中国作为世界最大养兔出产国之一， 26个省(自治区、直辖市)家兔总出栏量5亿2 000万只，总存栏量2亿2 400万只(2015年兔产业体系数据统计)[1]；饲养的家兔种类包括肉兔、獭兔和毛兔，其中肉兔和獭兔存栏量和出栏量分别占全国的91.58%和99.80%[2]；2015年我国兔肉产量87.4万t[1]，兔皮约1.1亿多张，兔毛产量约2万t[3]，兔皮、兔毛和兔肉总产量和出口量多年稳居世界第一。由此可见，养兔业在我国畜牧业经济中占有举足轻重的地位。

痒螨病是家兔养殖中常见的外寄生虫病之一，据报道我国家兔感染率可达70.0%[4]。该病是由绵羊痒螨兔亚种(Psoroptes ovis var. cuniculi，又名兔痒螨)寄生于家兔的外耳道皮肤表面所引起，表现出瘙痒，挠耳，外耳道内卷纸样结痂为主要临床症状，造成家兔体重减轻、饲料转化率下降、免疫功能降低，严重者出现死亡，给养兔业造成巨大的经济损失[5-7]。物种的遗传多样性可受环境和地理隔离等因素影响而出现变异，这点已在日本血吸虫[8]、捻转血矛线虫[9]、湖北钉螺[10]等物种中被证实。我国家兔饲养区域范围广泛、饲养品种较多，家兔品种和饲养区域的地理隔离是否会对家兔体表寄生的痒螨产生遗传变异？相关研究目前仍十分缺乏。线粒体DNA (mitochondrial DNA，mtDNA)具备母系遗传和高突变等特征，常作为研究物种进化的遗传标记[11-13]。我们课题组前期基于线粒体的编码蛋白基因Cytb基因对我国绵羊痒螨兔亚种的遗传变异进行了分析[14]，但因基因间存在不平衡的进化关系，仅选用一个线粒体基因进行遗传变异分析并不能准确地反映种群间的进化[15]。因此，本研究中我们选取了线粒体基因中非编码蛋白基因——16S rRNA基因再次分析我国家兔主要养殖区域的肉兔和獭兔体表寄生的绵羊痒螨兔亚种的遗传多样性特征，以期得到更为准确的我国绵羊痒螨兔亚种种群遗传多样性信息，从而为养兔业中痒螨病的防控提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 实验材料

从我国5个地理区域(华北、华东、华中、西北和西南)采集自然感染痒螨的肉兔和獭兔的外耳道结痂，从结痂中分离螨虫经形态学鉴定为绵羊痒螨兔亚种[16]，于-20 ℃保存备用。其中分离自獭兔的痒螨样品25个，分离自肉兔的痒螨样品58个，共计83个样品(表1)。

最后，学习效果即学生科学探究能力提升的评价，采用访谈和问卷调查的方式进行。一方面是学生自己的主观评价，另一方面是通过对实验题的解题能力比较进行客观评价。问卷的题目设定，主要包括两方面：学生自己的主观评价题，自我评估在科学探究各方面能力是否有提升；选择、整合高考卷和模拟卷中有代表性的实验试题，将上过拓展实验课的学生作为实验组，另外选择拓展实验开展前与实验组学生生物成绩相当的相同数量的学生作为对照组，评价分析实验组相比对照组，实验题解题能力提高的情况。

1.2 DNA的提取、PCR扩增和产物测序

将“1.1”中采集的各地痒螨样品随机挑选单个痒螨进行无菌研磨后，按照OMEGA公司的节肢动物DNA提取试剂盒(DNA Mollusc Kit)的说明书提取单个螨虫的基因组DNA，提取的DNA保存于-20 ℃备用。根据GenBank上已发表的绵羊痒螨线粒体基因组序列 (登录号：KJ957822)[12]设计特异性引物，扩增16S rRNA基因全序列。上游引物F-5′-AGGTATCGGAAGGTGCCTCT-3′；下游引物：R-5′-TCCCCTACCCCTAAAAGCTCA-3′。PCR扩增体系为25 μL：4 μL模板DNA，上、下引物各1 μL，6.5 μL ddH2O，12.5 μL 2 ×Taq PCR Master Mix。PCR反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃ 10 min。阴性对照模板使用无菌双蒸水。PCR反应结束后，取5 μL PCR扩增产物进行1%的琼脂凝胶电泳检测目的片段的大小，随后将PCR阳性产物送至生物工程(上海)股份有限公司进行正反双向测序，以保证测序结果的准确性。

将测序结果按照峰图人工核对，运用BLASTn和DNAMAN 6.0.3软件对序列进行比对、拼接、剪切，构成对应的16S rRNA全序列文件。运用MEGA 5.0软件对比核苷酸序列以及对碱基百分比和种群间遗传距离进行分析；采用DnaSP 5.0软件对变异位点数、单倍型数、遗传分化系数(Fst)、核苷酸多样性(Pi)和单倍型多样性(Hd)进行统计，并计算基因流Nm=1/4(1/Fst-1)；采用Arlequin 3.1软件分析种群间的遗传差异(Fst)和分子变异(AMOVA)以了解不同地区的遗传结构，并对各种群进行中性检验(Tajima’s D和Fu’s Fs)；构建单倍型网络分布图和采用NJ法构建系统发育树，并用bootstraps(重复1 000次)检验聚类树的置信度。

1.3 数据处理及分析

2) 沿洋山港主航道的进出港船舶以中大型集装箱船为主、兼有大型油船和液化天然气(Liquefied Natural Gas, LNG)船，日平均流量57艘次。

2 结 果

2.1 核苷酸序列分析

83条序列共存在52个单倍型(H1～H52)，其中H2、H4、H9、H16、H32为共享单倍型；H4单倍型共享频率最高。单倍型H2由华北地区的2个样本(HB2与HB4)与西南地区的9个样本所共享(XN2、XN8、XN12、XN31、XN33～35、XN42、XN43)；单倍型H4由华北地区(HB5)、华中地区(HZ1)、西北地区(XB1、XB6、XB7)、西南地区(XN10、XN43、XN44、XN45、XN46、XN47、XN48)共享；单倍型H9由华东地区(HD2、HD3、HD8)、西南地区(XN20、XN23、XN25、XN26)共享；单倍型H16由华中地区(HZ4、HZ6、HZ8、HZ9)、西南地区(XN19)共享；单倍型H32由XN21、XN22共享；其余的均是各种群地区特有的单倍型(表1)。

2.2 单倍型分布

成功获得83个绵羊痒螨兔亚种样品的16S rRNA全序列，经分析获得的83条16S rRNA序列，全长均为1 025 bp(GenBank No.:MH 304762～MH 304844)。DnaSP 5.0软件分析显示83条基因序列中共有83个变异位点，其中包括68个单变异位点(81.93%)和15个简约性位点(18.07%)，无碱基缺失和插入，其中转换突变的数量大于颠换突变数量。

2.3 单倍型多样性及核苷酸多样性

5个地理种群的单倍型多样性(Hd)为0.857 14(西北地区)～0.964 29(华北地区)，我国整体种群的单倍型多样性(Hd)较高(0.958 27)，表明我国整体种群及各地种群的绵羊痒螨种群单倍型多样性(Hd)较为丰富(表1)。我国整体种群的平均核苷酸多样性(Pi)为0.006 86，而5个地理种群中，以华中地区的核苷酸多样性(Pi)最低(0.001 71)，华东地区的核苷酸多样性(Pi)最高(0.006 76)，表明我国这5个区域的核苷酸多样性(Pi)较高；5个地理种群核苷酸差异指数(K)的范围在1.755 56(华中地区)～6.928 57(华东地区)(表1)。

2.4 遗传距离、中性检验值和遗传分化指数

5个地理种群间的Fst值(-0.037 59～0.587 63)和基因流值-6.900 7～31.117 62变化较大(表3)，其中华中地区与华东地区的Fst值最高，并且遗传分化差异显著(P<0.005)，这两个区域的基因流Nm为0.175 43，表明种群间存在较小的基因流；华东地区与西南地区基因流值Nm(31.117 62)最高，表明种群间基因交流频繁，导致两者间的遗传分化差异不显著(Fst值=0.007 97，P>0.005)。

科研成果转化是一项周期长且高风险的活动，需要政府、高校、企业、科研成果持有人的多方配合，构建完善的成果转化资金保障机制才能完成。完善的成果转化资金保障机制能合理地分配各阶段资金的投入比例，保障整个转化过程有充足的资金流，有效解决科研成果转化过程中投入资金不足的问题，保证转化过程顺利地完成。

5个地理种群中，除华北地区的Tajima’s D检验值为正值(0.067 96)，其余4个地理种群均为负值(-1.658 34～-0.959 56)，西北地区Tajima’s D绝对值最高，华北地区Tajima’s D绝对值最低，并且华中地区、西北地区、西南地区种群差异显著(P<0.005)。除华东地区的Fu’s Fs值为正外(0.183 69)，其余4个区域值均为负(-20.424 13～-0.003 85)，以西南地区绝对值最高，西北地区绝对值最低，华中地区和西南地区种群差异显著(P<0.005)(表1)。

2.5 系统发育树与单倍型网络图的构建

单倍型网络图显示(图2)，单倍型被分成两部分，各单倍型呈发散分布，相邻单倍型之间的突变从1步到5步不等，网络图中各单倍型的聚类情况与NJ树的聚类情况非常相似，同样未形成显著的地理种群结构。

华北地区与华东地区、华中地区、西北地区、西南地区的遗传距离分别为0.008、0.005、0.005、0.007，且差异显著(P<0.005)；华东地区与华中地区、西北地区、西南地区的遗传距离分别为0.010、0.009、0.006，且差异显著(P<0.005)；华中地区与西北地区、西南地区的遗传距离分别为0.004和0.009，且差异显著(P<0.005)；西北地区与西南地区的遗传距离为0.008，遗传距离差异显著(P<0.005)(表2)。

NJ树显示(图1)，绵羊痒螨兔亚种的52个单倍型构成2个大的分支。2大分支包含了不同的地理来源及温度带的单倍型，单倍型的分布无规律可循，尚未形成显著的地理种群结构和温度种群结构。

内网用户终端的非法上网外联行为是企业网络安全中最薄弱的环节，所以在系统的管理上要重点检测和管理企业内用户的非法自建通路连接非授权网络的行为，在企业内网中通过分区域和分部门地进行监控上网行为，过滤网页访问，过滤邮件，限制上网聊天行为，阻止不正当文件的下载。另外还可以通过对上网权限审计控制，对网络行为审计和邮件外发审计等控制行为，可使企业内网终端上网安全性可控［7］。设置带宽控制系统，使网络管理人员对实时数据流量情况能够清晰掌握，能定位网络流量的基线，从而及时发现网络是否出现异常流量并控制带宽。网络行为监控系统结构如图1所示。

3 讨 论

本研究首次成功地利用PCR技术扩增了我国5大区域的83株绵羊痒螨兔亚种的16S rRNA全序列，并分析了其遗传多样性和种群结构特征。我们采用的单个痒螨虫体进行DNA提取，克服了多个痒螨虫体提取DNA所带来的不准确性，避免了遗传变异的不准确性[17-19]。研究表明地理环境和宿主的改变会影响寄生虫种群遗传结构[20]，前期我们课题组基于Cytb分析亦证实我国地理环境差异较大的各地采集的绵羊痒螨间存在较高的遗传多样性，有一定的遗传分化，但未分化形成地理种群结构[14]。但基于单个基因得到的遗传变异结果并不一定能准确地反映种群间的进化关系，因此，本研究采用线粒体16S rRNA基因进一步分析我国各地绵羊痒螨的遗传多样性。

(5)加强产学研合作，鼓励企业与高校、科研院所共建优势互补、成果共享、风险共担的技术创新联合体，建设更多的企业技术中心、工程技术研究中心和院士博士硕士工作站，培育创新型企业和高新技术企业。

环境的改变会导致动物物种自身变异的产生，遗传变异的大小表现出其遗传多样性的高低，遗传多样性低的物种种群很难在多变的环境中生存。所以遗传多样性较高的物种比变异较低的物种更具备进化潜力和环境适应性，这更有利于种群的发展[21]。通常用单倍型多样性(Hd)和核苷酸多样性(Pi)来衡量一个物种或群体遗传多样性。本研究中83个样本共有52个单倍型，其Hd达0.958 27，表明我国这5个区域的绵羊痒螨的单倍型多样性较为丰富。然而本研究中5个区域总的核苷酸多样性为0.006 86，表现出较低的核苷酸多样性水平。这种高Hd值、低Pi值的现象反映了绵羊痒螨种群在历史中可能出现过瓶颈效应而出现种群扩张，种群快速的自身变异以致其较高单倍型多样性，但并没有积累较高的核苷酸多样性水平[22]。这种高Hd、低Pi的现象常发现于大多数具有较大的母系有效种群和较强繁殖能力的无脊椎动物中[23-24]。再者，中性检验(Tajima’D和Fu’s Fs)结果亦证明了我国绵羊痒螨群体在历史上可能出现过种群扩张现象，从而易于该种群的生存。

表1 基于16S rRNA分析我国5个地理区域绵羊痒螨兔亚种种群的遗传多样性指数 Table 1 Indexes of genetic diversity of Psoroptes ovis var. cuniculi populations from five regions in China, based on 16S rRNA

种群Population样品数量Number of samples样品编号Number of samples样品来源Samplesource温度带Temperaturezone变异位点数Number of variable sites单倍型数(单倍型)Number ofhaplotypes单倍型多样性Haplotype diversity (Hd)核苷酸多样性Nucleotide diversity (Pi)平均核苷酸差异指数Average number of differences (K)Tajima s DFu s Fs华北HB8河北(保定HB1～HB8)力克斯兔源暖温带177(H1～H7)0.964 290.006 486.642 860.067 96-1.273 53华东HD8山东(济南HD1～HD8)新西兰兔源暖温带226(H8～H13)0.892 860.006 766.928 57-0.959 560.183 69华中HZ10河南(开封HZ1～HZ2)湖北(HZ3～HZ10)力克斯兔源亚热带87(H4、H14～H19)0.866 670.001 711.755 56-1.636 00∗-3.710 55∗西北XB7陕西(宝鸡XB1～XB7)力克斯兔源暖温带155(H4、H20～H23)0.857 140.004 184.285 71-1.658 34∗-0.003 85西南XN50四川(德阳XN1～XN2;雅安XN3～XN10;成都XN11～XN29;西昌XN30～XN43;资阳XN44～XN50)新西兰兔源亚热带5233(H2、H4、H9、H16、H24～H52)0.952 650.006 056.198 37-1.612 31∗-20.424 13∗整体种群83HB1～HB8,HD1～HD8,HZ1～HZ10,XB1～XB7,XN1～XN50力克斯兔源和新西兰兔源暖温带和亚热带8352(H1～H52)0.958 270.006 867.034 97-1.159 65-5.045 67

*. P<0.005，表示差异显著 *.P<0.005, indicates significant difference

表2 我国5个地理区域绵羊痒螨兔亚种种群的遗传距离 Table 2 Genetic distance of Psoroptes ovis var. cuniculi populations between five region populations in China

种群Population种群Population遗传距离Genetic distance方差Std. Err华北地区HB华东地区HD0.0080.002华中地区HZ0.0050.001西北地区XB0.0050.001西南地区XN0.0070.002华东地区HD华中地区HZ0.0100.003西北地区XB0.0090.002西南地区XN0.0060.002华中地区HZ西北地区XB0.0040.001西南地区XN0.0090.002西北地区XB西南地区XN0.0080.002

表3 我国绵羊痒螨兔亚种种群的基因流(Nm)(上三角)和遗传分化度(Fst)(下三角) Table 3 Gene flow (Nm) (above diagonal) and genetic diversity (Fst) (below diagonal) between Psoroptes ovis var. cuniculi populations in China

种群Population华北地区HB华东地区HD华中地区HZ西北地区XB西南地区XN华北地区HB—1.134 350.712 76-6.900 701.288 74华东地区HD0.180 59—0.175 430.468 5331.117 62华中地区HZ0.259 67∗0.587 63∗—1.017 420.278 44西北地区XB-0.037 590.347 930.197 25∗—0.589 91西南地区XN0.162 470.007 970.473 09∗0.297 65∗—

*.P<0.005，表示差异显著 *.P<0.005, indicates significant difference

本次研究的5个地理区域跨越了亚热带和暖温带，同时被我国的南北分界线——秦岭-淮河所隔离以及长江、黄河等河流的阻断，这些天然的地理屏障形成了物种的地理隔离，地理的隔离可能会造成生殖隔离，因此天然的地理屏障形成了我国绵羊痒螨兔亚种种群之间的基因交流障碍。但从反映物种遗传分化强弱的基因流(Nm)和遗传分化系数(Fst)来看[25]，华东(山东)与西南(四川)种群间基因流值>4(Nm=31.117 62)，Fst值<0.05(Fst=0.007 97)，表明2个群体间基因交流充分，种群出现遗传分化可能性小[25]；而华北与华东、西南以及华中与西北种群间亦存在一定的基因交流(Nm>1)，种群间遗传分化较大(0.15<Fst <0.25)；其他地区种群间(除西北与华北间)基因交流小(Nm<1)，种群间遗传分化极大(Fst >0.25)。华中地区与西南地区、华东地区，华北与华东地区、西南以及华北与西北地区被巫山和雪峰山、大别山、南岭、秦岭、太行山所隔离， 这些天然屏障所隔离的绵羊痒螨兔亚种间却仍然存在频繁的基因交流，但痒螨虫体较小(约0.9 mm)，自身移动能力较低，因此，这些地区间的基因交流极有可能是由于各地家兔贸易所造成的，特别是山东和四川之间兔贸易频繁，因此导致两地间出现最高的基因流值(31.117 62)，目前已有许多关于宿主移动对寄生虫基因流影响的相关报道[20，26]。研究表明，多宿主寄生虫通常较专性寄生虫具有更低的遗传分化水平与更高的基因交流水平[20, 27]，这点在我们的研究中亦得到证实，本次研究的绵羊痒螨可寄生于兔、绵羊等多种动物体表，属于多宿主寄生虫，我们研究的多个地理区域间的绵羊痒螨兔亚种存在频繁的基因交流。这种频繁的基因交流可能会导致一个地方绵羊痒螨兔亚种的伊维菌素等耐药基因传递到另一个新地方。

HB.华北；HD.华东；HZ.华中；XB.西北；XN.西南 HB. Huabei；HD. Huadong；HZ. Huazhong；XB. Xibei；XN. Xi’nan 图1 基于痒螨16S rRNA的52个单倍型构建的NJ树 Fig.1 NJ Tree based on52 haplotypes of 16S rRNA of Psoroptes ovis var. cuniculi

单倍型的分布频率与圆圈的大小成正比；不同颜色表示不同样品来源 The haplotype distribution frequency is proportional to the size of the circle; Different colors represent different sample sources 图2 基于16S rRNA构建的绵羊痒螨单倍型网络图 Fig.2 A network map of Psoroptes ovis, based on 16S rRNA

系统发育树(NJ树)和单倍型网络图显示我国绵羊痒螨16S rRNA单倍型构成2大分支，呈现出杂乱的分布格局，绵羊痒螨兔亚种虫株并未按照地理来源聚集，同时亦未根据宿主(獭兔还是肉兔)而进行聚集，还未根据是源自亚热带还是暖温带而聚集(图1和图2)，未形成显著的地理种群结构、温度带种群结构和兔品种种群结构。从遗传距离、基因流及遗传分化指数来看，处于亚热带的西南地区与处于温带的华东西区间基因流值较大，遗传分化指数较小(表2和表3)。因此，我国绵羊痒螨种群间的基因交流与地理、兔品种和温度带无关。

4 结 论

本研究首次成功地利用PCR技术扩增了我国5大区域的83株单个绵羊痒螨兔亚种的线粒体16S rRNA全序列，分析了5个地理区域绵羊痒螨兔亚种的遗传多样性和种群结构特征。发现我国绵羊痒螨兔亚种的遗传多样性较高，遗传分化不明显，尚未形成地理种群结构。

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