生物脱氮是去除养殖水体中氮污染的有效方法之一，具有经济高效的特点且不会对养殖水体造成二次污染[1]。通常认为，生物脱氮包括好氧硝化和厌氧反硝化两个过程，反硝化只有在厌氧条件下才会发生，20世纪80年代，随着副球菌属Paracoccus的首次发现[2]，国内外学者对好氧反硝化细菌研究报道逐渐增多，主要包括假单胞菌属Pseudomonas[3]、产碱菌属Alcaligenes[4]、芽孢杆菌属Bacillus[5]等。在水产养殖方面，通常为保证养殖动物健康生长，养殖水体必须保证在高溶氧状态下，而厌氧反硝化脱氮效率就会因此严重降低，故研究好氧反硝化细菌势在必行[6]。

溶藻弧菌Vibrio alginolyticus HA2是在天津某公司室内工厂化海水养殖池中筛选出具有高脱氮效率的菌株，对氨氮的去除率高达99.06%，脱氮率达97.27%[7]。但对该细菌整个硝化反硝化过程中代谢产物未有系统的分析研究。本试验中，对溶藻弧菌HA2以铵态氮硝态氮亚硝态氮种含氮量(132 mg/L)相等的不同氮源培养基在发酵罐中进行培养，测定试验过程中菌液的浓度和铵态氮、硝态氮、亚硝态氮、pH含量，以及可能代谢产物N2、NO、N2O的含量，以分析整个硝化反硝化过程中氮的代谢途径，以及研究溶藻弧菌HA2脱氮机理，旨在为溶藻弧菌HA2进一步研究和投入生产应用提供基础数据，并为新型生物脱氮技术发展提供数据支撑。

作为一项金融政策，金融开放自然而然的与金融发展水平相联系，根据前文对金融开放与金融发展相关研究的梳理，其影响方向存在一定不确定性：金融开放政策对本国金融部门发展既存在溢出效应，还可能带来替代效应。前一部分实证分析说明不同金融发展水平下金融开放政策影响经济增长的作用机制，依据模型设定，通过验证金融开放与金融发展的关系我们可以进一步确定金融发展是金融开放与经济增长的影响渠道，从而完整地验证金融发展的中介效应。对此，我们依据模型(4)进行回归分析，考察金融开放对一国金融发展的影响。相关结果见表6。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验菌株 试验菌株筛选自天津市某水产公司海水工厂化循环水养殖池。

本研究就女性免疫性不孕与慢性生殖道炎症及微量元素的关系进行探究与分析，结果显示，免疫性不孕的女性患者其阴道分泌物炎性因子(IL-6、IL-8及TNF-α)及血清铜均高于健康正常孕妇，血清硒及锌均低于健康正常孕妇，且不同分类与病程免疫性不孕者的阴道分泌物炎性因子及血清微量元素指标差异有统计学意义，Logistic分析显示，上述检测指标均与女性免疫性不孕有密切关系，进而肯定了上述指标与女性免疫性不孕的关系。其中慢性生殖道炎症导致的炎性细胞因子表达增强可较大程度反映生殖道的炎性损伤，微量元素对于子宫内膜及生殖系统其他方面的影响也较大程度存在，且对免疫的失调影响较大[17-19]。

1.1.2 培养基 维氏盐溶液：将5.0 g K2HPO4、2.5 g MgSO4·7H2O、0.05 g FeSO4·7H2O、0.05 g MnSO4·4H2O依次溶于1 L盐度为15的海水中。

其次，深化户籍制度改革，保障农民利益。在就地就近城镇化建设中，户籍制度不仅仅是公民身份的转变，更重要的是户籍制度下所捆绑的教育、医疗、就业、社保等一系列要素。继续深化户籍制度改革，建立城乡统一的户籍登记管理制度，促进人口合理有序流动，解决农民到城镇的落户、生活、工作以及在此过程中相应的教育、医疗等问题，是农民就地就近城镇化的保障性措施。2017年丰县根据徐州市《市政府关于进一步推进户籍制度改革的意见》实施城镇“零门槛”落户，全面放开县城和建制镇落户条件，满足合法稳定住所或合法稳定就业两个条件中的一点即可落户，该政策的实行对于合理引导人口流动、加快城镇化进程具有明显推动作用。

硝态氮源培养基：将0.8 g NaNO3、5.66 g 柠檬酸钠、50 mL 维氏盐溶液依次溶于1 L蒸馏水中，调节pH至7。

本研究中对溶藻弧菌HA2菌株在3种氮源培养基中的生长进行Logistic模型曲线拟合，拟合曲线均呈“S”型，拟合曲线与实际平均值基本吻合。

本试验中利用3种不同氮源培养基培养溶藻弧菌HA2，试验过程中均未检测出NO、N2O (仪器测定范围0～50 mg/L，分辨率为0.5 mg/L)。在不同培养基中N2的代谢状况见图8，各组N2量与对照组相比均有增加趋势。铵态氮组0～18 h时，N2量缓慢增加，51 h 时达到最高(80.38%)，在第60 h时又有降低趋势，N2量最低为79.37%，最高达到80.39%；第51 h时硝态氮培养基中N2量达到最高(80.45%)；第51 h时亚硝态氮培养基中N2量达到最高(80.53%)。从N2量趋势图可看出，3种氮源培养基同时在51 h时上升到最高点， N2量在铵态氮培养基中上升最早，在亚硝态氮培养基中上升最晚，但在亚硝态氮培养基上升速率最快。

1.1.3 试验仪器 麦氏浓度仪(DENSICHEK，IDK215957)；紫外分光光度计(UVmini-1240)、一氧化氮检测仪(深圳市普利通电子科技有限公司，PLT-BX-NO)；一氧化二氮检测仪(深圳市普利通电子科技有限公司，PLT-BX-N2O)；氮气检测仪(深圳市普利通电子科技有限公司，PLT-BX-N2)；pH计(SevenEasy Plus-S20P)。

1.2 方法

[32]Soroush Vosoughi, Deb Roy, Sinan Aral, “The spread of true and false news online”, Science, 2018, 359(6380), pp. 1146-1151.

在容积为10 L的发酵罐中进行试验(图1)，试验前将所有装置在121 ℃下灭菌处理20 min， 将7 L不同氮源的硝化培养基分别加入不同发酵罐中，各记为A(铵态氮源培养基)、B(硝态氮源培养基)、C(亚硝态氮源培养基)组，每组设3个重复，各试验组接种10 mL浓度为2.93麦氏浓度的溶藻弧菌HA2，试验温度为(26.03±1.16)℃，连续发酵120 h，在发酵的第0、12、18、36、39、42、45、48、51、54、57、60、63、66、69、72、84、96、108、120 h 取样。发酵液每次取10 mL,分别以5000 r/min离心10 min，测定上清液中铵态氮、硝态氮、亚硝态氮的浓度，检测发酵罐中N2、NO、N2O气体的含量，直到仪器显示浓度达到稳定值为止。

铵态氮源培养基：将0.5 g NH4Cl、5.66 g 柠檬酸钠、50 mL 维氏盐溶液依次溶于1 L蒸馏水中，调节pH至7。培养基经过121 ℃灭菌20 min，下同。

图1 试验装置 Fig.1 A diagram of the apparatus used in the experiment

本试验中，分别采用纳氏试剂分光光度法、锌-镉还原分光光度法、重氮-偶氮光度法、麦氏浓度仪，检测铵态氮、硝态氮、亚硝态氮、菌液浓度；通过深圳市普利通电子科技有限公司的电子仪器检测N2、NO、N2O气体的含量。

1.3 数据处理

试验数据以平均值±标准差(mean±S.D.)表示。用SPSS 19.0软件进行非线性回归分析，根据细菌生长浓度、时间计算出3种培养基条件下非线性参数，再根据拟合曲线参数值、估计值、拟合度(R2)选出最优生长模型，模型表达式为指数函数y=k/[1+exp(a-b×t)]，其中a为参数，b为瞬时生长率，k为生长极限值，t为自变量时间(h)。

2 结果与分析

2.1 溶藻弧菌HA2在3种培养基中的生长状况

根据各时期不同培养基中溶藻弧菌HA2测定的麦氏浓度数据，用Logistic非线性模型对溶藻弧菌HA2的生长曲线进行拟合。在铵态氮源培养基中，HA2的生长曲线通过多次调整拟合(图2)，确定最高拟合度R2为0.791，拟合程度一般，生长极限k值为4.769，实际平均值比拟合值稍早到达生长极限k，试验第66 h时达到k值；在硝态氮源培养基中，HA2的生长曲线拟合见图3，拟合度R2为0.917，拟合曲线与实际平均值基本上吻合，生长极限k值为5.477，在试验第84 h 时达到k值；在亚硝态氮源培养基中，HA2的生长曲线拟合见图4，拟合度R2为0.977，拟合程度较高，拟合曲线与实际平均值基本吻合，生长极限k值为5.567，试验第108 h 时达到k值。 在铵态氮、硝态氮、亚硝态氮3种氮源培养基中溶藻弧菌HA2的生长拟合曲线均呈“S”型，经拟合曲线结果可得瞬时生长速率参数b依次减小(0.910、0.891、0.887)，拟合度R2依次增加，HA2菌生长极限k值依次升高。

当前高职教育飞速发展，高职院校均开始注重内涵发展、提高教学质量、深化课程改革，而高职院校的课程标准建设就是深化课程改革的重要环节，因此，课题组希望，以此课程标准为推手，通过构建并实施基于就业的高职教育课程标准，促进整体教学质量的提高，从而进一步提高就业质量。

图2 溶藻弧菌HA2在铵态氮源培养基中的生长拟合曲线 Fig.2 Growth curve of Vibrio alginolyticus HA2 in the ammonium nitrogen culture media

2.2 溶藻弧菌HA2在不同氮源培养基中对代谢的影响

从图5可见：在铵态氮源培养基中，从0 h到45 h时，含量持续降低，在45 h时 去除率达到最高(99.97%)；从45 h开始含量呈现增加趋势，在72 h 时含量达到最高值(0.78 mg/L)；而试验期间，含量一直低于0.10 mg/L。

(ΔG°′=-348.9 kJ/mol)。

图3 溶藻弧菌HA2在硝态氮源培养基中的生长拟合曲线 Fig.3 Growth curve of Vibrio alginolyticus HA2 in nitrate nitrogen culture media

图4 溶藻弧菌HA2在亚硝态氮源培养基中的生长拟合曲线 Fig.4 Growth curve of Vibrio alginolyticus HA2 in nitrite nitrogen culture media

图5 铵态氮源培养基中铵态氮、硝酸态氮、亚硝酸态氮含量变化 Fig.5 Changes in concentrations of ammonia nitrogen, nitrate nitrogen and nitrite nitrogen in ammonium nitrogen culture media

从图6可见：在硝态氮源培养基中，0～60 h时含量持续降低，在60 h时的去除率达到最高呈先升高后降低的趋势，在48 h时含量增加至最高22.27 mg/L，在60 h时 含量降低到0 mg/L；从60 h开始含量呈现增加趋势。

图6 硝态氮源培养基中铵态氮、硝态氮、亚硝态氮含量的变化 Fig.6 Changes in concentrations of ammonia nitrogen, nitrate nitrogen and nitrite nitrogen in nitrate nitrogen culture media

从图7可见：在亚硝态氮源培养基中，54 h时 含量开始降低，到60 h 时稳定于37.96 mg/L，降解率最高为36.87%；60 h 时，含量开始升高。

注：该次测定缺少硝态氮数据。硝态氮测定原理是通过硝态氮硝解还原为亚硝态氮，再进行亚硝态测定 Note：The nitrate nitrogen data are absent because the reduction rate can not be accurately measured. The determination of nitrate nitrogen levle is based on nitrate-N reduction to nitrite nitrogen and then nitrite determination 图7 亚硝态氮源培养基中铵态氮、亚硝态氮含量变化 Fig.7 Changes in concentrations of ammonia nitrogen and nitrate nitrogen in nitrite nitrogen culture media

2.3 不同氮源培养基中代谢气体的含量

对照组为生理盐水，调节pH至7.0。

图8 在不同培养基中溶藻弧菌HA2产生的N2量 Fig.8 N2 levels produced by Vibrio alginolyticus HA2 in different culture media

2.4 不同氮源培养基中pH的变化

溶藻弧菌HA2在不同氮源培养基中pH变化如图9所示，各组培养基pH均呈增加趋势，在加入培养基的第24 h时，pH值开始上升，铵态氮组上升速率最快，硝态氮、亚硝态氮组上升速率趋于一致。培养开始时，铵态氮、硝态氮和亚硝态氮组pH值分别为7.88、8.45和8.54，到培养结束时，各组的pH分别为9.46、9.54和9.51。

图9 溶藻弧菌HA2在各培养基中pH的变化 Fig.9 Changes in pH of Vibrio alginolyticus HA2 in the culture media

3 讨论

3.1 溶藻弧菌HA2在不同氮源培养基中的生长

亚硝态氮源培养基：将0.65 g NaNO2、5.66 g 柠檬酸钠、50 mL 维氏盐溶液依次溶于1 L蒸馏水中，调节pH至7。

同步硝化反硝化细菌在不同氮源培养基中生长状况有较大差异，梁贤[8]研究发现，异氧硝化细菌YL分别在以唯一氮源为亚硝态氮和硝态氮的培养基中生长状况均较好。潘玉瑾等[9]研究发现，好氧反硝化细菌ZPQ2分别在以KNO3、(NH4)2SO4为唯一氮源培养基中生长较好。本试验中分别以铵态氮(NH4Cl)、硝态氮(NaNO3)、亚硝态氮(NaNO2)为唯一氮源培养溶藻弧菌HA2，并拟合该菌株生长曲线，结果显示，溶藻弧菌HA2在铵态氮、硝态氮、亚硝态3种氮源培养基中达到生长极限k值分别需要66、84、108 h，拟合曲线瞬时生长速率参数b分别为0.910、0.891、0.887，由此可知，该菌株在3种氮源培养基中生长速率从快到慢分别为铵态氮、硝态氮、亚硝态氮。Logistic拟合模型本质是反映生物遗传生长潜力，不受环境、食物等因素影响，只与生物品种有关[10]。事实上，溶藻弧菌HA2生长过程中会受到氮源等因素的影响，从而影响拟合曲线的拟合度，拟合度大小反映氮源对该菌株生长影响程度，生长极限k值是细菌在该环境中所能达到的极限值，k值受不同种类氮源影响。本试验中，溶藻弧菌HA2在铵态氮、硝态氮、亚硝态氮3种不同氮源培养基中的生长曲线拟合度R2分别为0.791、0.917、0.977，生长极限k值分别为4.769、5.477、5.567，因此，该菌株受3种培养基的影响程度依次为亚硝态氮<硝态氮<铵态氮。本试验结果表明，溶藻弧菌HA2在这3种氮源培养基中均可以生长，这与杨浩锋等[11]、王弘宇等[12]、Ellington等[13]的研究结果一致。

3.2 溶藻弧菌HA2在不同氮源培养基中对代谢的影响

传统硝化理论认为，硝化过程分为两步完成：首先将铵态氮氧化为亚硝态氮即公式(1)，再将亚硝态氮氧化为硝态氮即公式(2)，这两步分别由细菌催化完成[14]。Van Kessel等[15]研究发现,硝化过程存在单步硝化酶(AMO)，并通过同位素标来研究氨在细胞内部催化形成硝态氮的过程，未发现同位素标记的亚硝态氮产出，新的硝化模型(3)被证实存在。硝化过程为

目前，各个城市均建设了若干个IDC机房/网络系统，其中由一部分服务于本城市的城市级，还有一部分服务于全省乃至全国。

(ΔG°′=-274.7 kJ/mol)，

(1)

(2)

MNIST数据集中包含了60000个灰度图片，图片的内容是手写的0-9阿拉伯数字。每张图片的分辨率为28×28=784像素，每一幅图都属于十个类别中的一类。本文直接使用像素的灰度值作为输入。在实验中，两个算法都先使用PCA将数据降维到55维，再运行各自的降维过程将数据降到2维。两个算法的perplexity参数都设置为30，在最小化目标函数的过程中都进行20000次迭代。

(3)

本试验结果显示，溶藻弧菌HA2在铵态氮源培养基中生长前45 h 内，含量持续降低，45 h 时去除率达到最高(99.97%)，在57 h时含量由0 mg/L开始上升，结果显示，在含量开始上升之前，未检测出含量，说明在此硝化过程中未经过转化过程，因此，该菌株硝化模型可能属于新型的硝化模型(3)。Daims等[16]研究发现，存在完整一步硝化细菌，该理论在同一年被更有力地证实。

反硝化过程中的积累通常在还原速率小于氧化速率时出现[14]。利用硝态氮作为唯一氮源培养溶藻弧菌HA2，试验结果显示，含量在前60 h是持续降低，60 h时的去除率达到最高含量在24 h时开始升高并在48 h时达到最高值。本试验过程中出现了亚硝态氮积累现象，Sun等[17]在反硝化细菌研究中也发现亚硝态氮有明显积累。

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溶藻弧菌HA2在亚硝态氮源培养基中培养的120 h内，含量在前60 h 降低，最高降解率为36.87%，从60 h后处于在一个稳定水平(37.96 mg/L以上)，从60 h时开始含量上升；而在硝态氮源培养基中，含量于48 h时上升到22.27 mg/L，随后开始下降，60 h时降至0 mg/L， 而含量于60 h时开始上升。这种现象与王际英等[18]的试验现象一致，其铵态氮上升原因可能是与生物体衰亡、代谢有关。

3.3 溶藻弧菌HA2在不同氮源培养基中的代谢气体分析

Richardson等[19]研究表明，可通过两种途径转化为气态氮，其一为然后再直接还原为气态氮，或者依次通过生成N2；其二为直接生成气态氮的过程，通过生物脱氮作用不会产生和本研究中发现，培养基中的能够被菌株HA2快速消除，并且积累较低含量的和所以初始的氮素被转化为气态氮(N2)和有机氮，该结果与刘天琪[20]报道的菌株Pseudomonas sp. ADN-42在纯氧下氨氮去除率为56.9%、最终产物N2生成量为52.1 mg/L相近。本研究中未检测到NO和N2O，与刘晶晶等[21]研究的Delftia tsuruhatensis反硝化气体代谢中间产物有N2O和NO不同，因此，菌株HA2的硝化途径可能为第一种，又与Kuenen等[22]研究的菌株T.pantotrop Ho的电子传递蛋白能在有氧条件下依次催化还原生成N2的结果不一致，因此，推测HA2菌株硝化反硝化脱氮过程为 → 从气体产生速率可以反映好氧反硝化速率，本试验中发现，N2量上升速率从大到小培养基依次为因此，结合HA2菌生长速率，HA2菌在铵态氮培养基中生长最快，好氧反硝化速率最低，在亚硝态氮中生长最慢，好氧反硝化速率最高。

3.4 溶藻弧菌HA2在不同氮源培养基中对pH的影响

相关研究表明，硝化过程是将铵态氮转化为硝态氮的过程，在此过程中电子从铵态氮传递到硝态氮，出现产酸过程pH下降[23]。而反硝化过程是一个产碱过程，培养基中pH呈增加趋势[24]。本试验结果显示，从溶藻弧菌HA2培养的第24 h开始，各组pH均呈现增加趋势。黄毅[25]在将硝化细菌加入到水族箱中发现，试验组和对照组含量均呈下降趋势，且试验组的pH低于对照组，这与本试验结果相反，说明HA2菌株不仅有硝化能力，可能还具有反硝化功能，与本研究中“3.2”节中水化氮代谢结果呼应，更进一步证实了HA2菌具有反硝化功能的推断。

4 结论

溶藻弧菌HA2在3种氮源培养基中均可以生长，3条拟合曲线均呈“S”型，该菌在中生长极限k值依次为4.769、5.477、5.567，在3种培养基中的生长速率依次为是一株完整硝化细菌，对和的降解率分别为99.97%、99.95%和36.87%。在本试验环境下，3种氮源培养基中均有N2增加的趋势，增加速率依次为溶藻弧菌HA2在氮源培养基中能明显增加培养基的pH值。

致谢：感谢天津立达海水资源开发有限公司为本试验提供帮助！

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