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1.3.6.8-四溴咔唑降解菌的筛选与鉴定

更新时间:2016-07-05

环境问题污染物包括日益增加的已知化学物质、具有毒性效应的新物质以及偶然发现的新化合物.新化合物可以包括诸如人工添加剂(例如新型卤代阻燃剂)[1-3]、个人护理产品(例如药物)和副产品[4-5]以及目前受管制的污染物的代谢物和降解产物[6].大量的卤代化合物有可能在环境中持续存在,具有生物蓄积性和毒性[7-10].近年来环境样品中陆续被检测出卤代咔唑,且已被确定为持久性有机污染物(POPs),这些咔唑主要存在于沉积物和土壤样品中[11-15].大多数的卤代咔唑在有机污染物的针对性分析中被发现,包括溴化阻燃剂[11,14]和有机氯农药[16],或者其他潜在污染物,如多环芳烃(PAHs)、多氯二恶英和呋喃(PCDD/Fs)以及多氯联苯(PCBs)[13,15,17].

由于20世纪工业有机化学的兴起,许多卤代化合物及其副产品大量涌入环境中.有关氯代咔唑的发现,最早报道之一是在20世纪80年代初,纽约布法罗河被一个工厂工业染料废弃物所污染[17].在此之后的30 年里,在德国的土壤和沉积物[14,16]、希腊的海洋沉积物[16]以及北美大湖地区的淡水湖泊和河流沉积物中均有关于卤化咔唑的报道[11-13].在对持久性有机污染物的降解过程中,生物降解法无疑是众多降解方法中对环境的二次污染影响最小的方法之一[17],且生物降解一直被广泛地运用于环境修复[18].

1 材料与仪器

1.1 菌种来源

样品采自苏州某制药厂的受污染土壤,土壤经多点采样后,混合均匀.

1.2 培养基

无机盐培养基(MSM)[19-20]:将1.00 g NaCl,1.00 g (NH4)2SO4,1.50 g K2HPO4,0.50 g KH2PO4和0.20 g MgSO4·7H2O溶于离子水中并定容至1 L,自然pH值,分装至锥形瓶中,在121 ℃高压灭菌锅中灭菌20 min.其固体培养基则需另加入体积比为2.0%的琼脂粉.

LB培养基:将10.0 g酵母粉,5.0 g蛋白胨,10.0 g氯化钠溶解在去离子水中并定容至1 L,自然pH值,装至锥形瓶中,在121 ℃高压灭菌锅中灭菌20 min.固体培养基则需另加入体积比为2.0%的琼脂粉.

微量元素溶液[21-23]:将0.13 g MnSO4·H2O,0.23 g ZnCl2,0.03 g CuSO4·H2O,0.42 g CoCl2·6H2O,0.15 g Na2MoO4·2H2O和0.05 g AlCl3·6H2O溶解在去离子水中并定容至1 L,备用.

1.3 实验方法

1.3.1 菌株的纯化与分离

称取5 g土壤样品置于100 mL含1 mg/L1.3.6.8-四溴咔唑的无机盐培养中,置于30 ℃,180 r/min恒温摇床中好氧培养一周.取5 mL上清液转移至新的100 mL含1 mg/L 1.3.6.8-四溴咔唑的无机盐培养集中,相同条件下再培养一周,重复上述操作4 次.

从最后一次富集的培养液中取5 mL进行稀释,稀释倍数分别为10倍,100倍和1 000倍.取0.1 mL稀释后的溶液分别涂布在含1 mg/L 1.3.6.8-四溴咔唑的无机盐固体培养基上,倒置在30 ℃恒温培养箱中培养2~3 d,待培养基上的菌落长到合适大小时,挑取不同形态的菌落分别在不同的LB固体培养基上划线,置于30 ℃恒温培养箱中培养.重复上一步操作数次,直至每块培养皿中的菌落单一.

按照上述方法配制新的降解液,将若干制备好的降解液平均分为5 份,每份降解液pH值分别调节至5,6,7,8,9,放置在30 ℃,180 r/min的摇床上培养.

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通过观察细菌形态,细菌生理生化特性及其16S rDNA序列对细菌种属进行鉴定.菌株生理生化特征参考《常见细菌系统鉴定手册》[24].16S rDNA序列交由上海生工生物工程股份有限公司完成.将测试结果对比Genbank中相关16S rDNA序列,用Neighbor-Joining法构建系统发育树.

1.4 菌株降解的条件优化

降解液的制备:将降解菌接种至LB液体培养基中扩大培养,将培养好的菌液8 000 r/min离心8 min,用新鲜无机盐洗涤2次,将清洗干净的菌液转移至含1 mg/L 1.3.6.8-四溴咔唑的无机盐中.

1.4.1 温度对菌株降解的影响

按上述方法配制降解液,确保降解液中的OD600=1.5,将若干制备好的降解液平均分为5 份,分别放置在温度为22,30,38,46,54 ℃,转速为180 r/min的摇床上培养.

1.4.2 pH对菌株降解的影响

将每株单菌接种至液体LB培养集中扩大培养,将培养好的菌液转移至离心管中,8 000 r/min离心8 min.用新鲜的MSM清洗菌液2次.将清洗干净的菌体转移至含有1 mg/L 1.3.6.8-四溴咔唑的MSM液体培养集中制成降解液,30 ℃,180 r/min摇床培养.

1.4.3 不同底物质量浓度对菌株降解的影响

问题6 图3 是某地从0时到12时的气温变化图,假设气温是连续变化的,请用两种不同的曲线将图形补充成完整的函数图象.请问在这段时间内,一定有某时刻的温度为0℃吗?为什么?

将清洗干净的菌体转移至MSM液体培养基中,制成种子液,将若干种子液平均分为5 份,分别添加1.3.6.8-四溴咔唑,使得每份种子液中1.3.6.8-四溴咔唑的质量浓度分别为0.1,0.5,1,5,10 mg/L,放置在30 ℃,180 r/min的摇床上培养.

2 结果与讨论

2.1 菌种鉴定

土壤样品富集数次以后,分离纯化出一株能有效降解1.3.6.8-四溴咔唑的降解菌,命名为JW.该菌株为革兰氏阳性菌,好氧,在LB固体培养基上培养2~3 d后,菌落呈淡黄色,菌落大致为边缘平整的圆形,表面光滑湿润(图1).菌株JW能够利用葡萄糖、乳糖、蔗糖和甘露糖,对卡那霉素、氨苄青霉素、链霉素和氯霉素等抗生素都具有抗性.16S rDNA序列构建系统发育树如图2所示,根据其同源性分析得知:该菌被鉴定为Stenotrophomonas sp..

2.发挥阵地作用,提升工作水平。切实发挥党校的培训作用,邀请外部专家和内部模范讲授课程,对党员、党员干部进行集中轮训和专题培训;成立党建思想政治工作研究会,不断提高公司党建、政研工作水平,推进公司党建与思想政治工作的理论和实践创新,提高公司党建思想政治工作整体水平。

图1 菌株JW在LB培养基上生长3 d的菌落图 Fig.1 The colonies of strain JW cultured in LB for 3 days

图2 菌株JW的系统发育树 Fig.2 Phylogenetic tree by strain JW

2.2 菌株降解的条件优化

2.2.3 底物初始质量浓度对菌株降解的影响

将放置在不同温度摇床中的锥形瓶培养20 d后取出,按照1.3.1中所述方法测定剩余1.3.6.8-四溴咔唑的含量.图3结果显示:菌株JW受温度的影响较大,当温度大于或小于30 ℃时,降解效率明显下降,当温度升高至50 ℃以上时,其降解效率甚至不足10%.由此可知,降解菌JW的最适温度为30 ℃.

2.2.2 pH对菌株降解的影响

将不同pH值的锥形瓶在相同条件下培养20 d后取出,按照1.3.1中所述方法测定剩余1.3.6.8-四溴咔唑的含量.图4结果显示:菌株JW更适合在中性条件下生长,当pH值大于或小于7时,降解效率会受到一定的影响.由此可知,降解菌JW的最适酸碱度为中性.

图3 温度对JW降解效率的影响 Fig.3 Effect of temperature on degradation by strain JW

图4 pH值对JW降解效率的影响 Fig.4 Effect of pH on degradation by strain JW

2.2.1 温度对菌株降解的影响

每隔4 d从30 ℃摇床中各取出3 瓶不同底物质量浓度的样品,按照1.3.1中所述方法测定剩余1.3.6.8-四溴咔唑的含量.图5结果显示:菌株JW的降解效率大致与底物质量浓度成反比,即1.3.6.8-四溴咔唑质量浓度越低,菌株JW的降解速率就越快.

图5 初始质量浓度对JW降解效率的影响 Fig.5 Effect ofinitial concentration on degradation by strain JW

3 结 论

从苏州某制药厂受污染土壤中筛选出一株能够有效降解1.3.6.8-四溴咔唑的菌株JW.该菌株在LB培养基上呈淡黄色、圆形、边缘平整、表面光滑、隆起,经16S rDNA序列鉴定为Stenotrophomonas sp..该菌株可以在20 d内降解80% 1 mg/L 1.3.6.8-四溴咔唑,之后以缓慢的速率降解,直到50 d左右1.3.6.8-四溴咔唑基本降解完全.菌株JW在30℃,pH=7时降解效率最高,为卤代咔唑类化合物的生物降解提供了理论基础.

参考文献

氟化物在泄漏100 d后,整体沿着废渣填埋场边界往南迁移,移动距离较短,上覆第四系松散含水层影响范围限制在填埋场周边区域,中心部分最高浓度可达到源强浓度100 mg/l,而下伏岩溶含水层未受污染,渣库底部岩溶含水层浓度为零。

被称为改革开放“总设计师”的邓小平,曾经留学法国和俄国,早年在法国的时候就接受了马克思主义理论,并加入了共产党组织,后来又留学俄国,学习了列宁主义基本理论。马克思主义经典作家关于社会管理的思想成为改革开放后邓小平进行中国社会管理改革的重要理论来源。作为中央第一代领导集体的核心成员,邓小平参予了以毛泽东为核心的党中央对中国革命和建设的积极探索,也为改革开放后邓小平深思社会管理问题并力挺社会管理改革提供了丰富的思想资源。

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1.3.2 菌株的鉴定

将降解液用等体积二氯甲烷萃取,通过旋转蒸发仪将萃取液用乙腈换相,用氮吹仪将降解液转移至2 mL棕色进样瓶中并定容至1 mL.用HPLC验证1.3.6.8-四溴咔唑的降解情况.其中,分析柱为Grace Alltima®C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm,美国Grace公司),流速0.8 mL/min,检测波长为246 nm.

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灵魂在于坚守初心和宗旨。中国特色社会主义的理论自信之所以能够立得住,根本原因就在于坚持了社会主义道路,坚持了马克思主义的指导地位,这是一种不同于西方政治、经济、社会、文化的价值观念和理论运动。如果没有马克思主义的理论自信,就会在“理论纷飞”的世界中陷入单纯的资本逻辑、市场逻辑,而遗忘了社会主义的最终发展目标,遗忘了人民性的普遍诉求,遗忘了中国共产党的初心和宗旨,最终偏离了社会主义的方向。必须始终牢记为中国人民谋幸福、为中华民族谋复兴的初心,始终把为人类作出新的贡献作为自己的使命。

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对杭州市下城区当前做地工作的思考(朱云祥) ............................................................................................8-22

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互联网金融的发展为我国整体经济发展做出了重要的贡献,但目前在相关市场仍旧存在较大的风险和一定的监管空白。未来不仅要完善互联网金融法律体系,还要加强行政监管力度和加快信用评价体系建设,从而促进互联网金融行业健康蓬勃发展。

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比如在教学《过零丁洋》时,教师就可以穿上长袍,满面戚容地走上讲台,举目四望,背手独吟这首诗,在沉郁顿挫的情感中,把这首诗所饱含的慷慨激昂的爱国热情和视死如归的高风亮节,以及舍生取义的人生观。将这些中华传统文化中的崇高美德,淋漓尽致地展现给学生,使学生深切感受到传统文化的意义和价值。

经常有家长咨询宝宝误食的处理办法,因为误食的物品不同,处理方式也不同。下面,我将误食各种常见物品的家庭急救方法写出来给大家参考。

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采用泊松分布公式,依据地震事件进行统计,选取全省1949~2018年地震事件对省内发生地震的概率进行分析,预测未来全省地震发生情况(发生地震是小概率事件)。通过统计1949~2018年MS6.5级以上地震事件(表2),得到MS6.5级以上地震事件发生的频次(表3)。

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盼盼食品曾推出一款线上专供的乳酸菌水饮料新品,其外观以清凉感十足的淡蓝色为主色调。该公司相关负责人说,他们的目标客户是习惯于线上消费的年轻群体,产品零脂肪概念的推出与飘逸清爽的外包装巧妙结合。

黑龙江省的农作物秸秆总量约为6305万吨,其中玉米秸秆约3610万吨,水稻秸秆约1954万吨,大豆秸秆约741万吨[11]。

刘越,杨沁钰,马云
《发酵科技通讯》 2018年第01期
《发酵科技通讯》2018年第01期文献

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