卡那霉素(kanamycin)是1957年由日本人梅泽滨夫从卡那链霉菌(Streptomyces kanamyceticus)发酵液中提取出的一种氨基糖苷类抗生素[1].卡那霉素在国内已有30多年的生产史.长期以来，普遍采用不补料、不控制pH的分批发酵工艺，高浓度碳、氮源发酵培养基经灭菌、接种后进行发酵，发酵过程中每天补水1 次，发酵液流变性差、供氧和传质效果弱.发酵前期由于大量糖的消耗，pH过低，不利于链霉菌生长.发酵中后期，发酵液过多的氮源分解以及菌体的早衰导致pH过高，不利于菌体的代谢和卡那霉素的合成，发酵水平长期徘徊在8 000 U/mL左右.赖滨霞采用间歇补料工艺，效价达8 800 U/mL以上[2].补料分批发酵技术已大量应用于发酵过程中[3-5].

针对目前国内卡那霉素生产现状及问题，采用发酵过程连续补料工艺，均匀营养、改善供氧和发酵液流变性，控制pH，提高生产菌的代谢和卡那霉素的合成.新发酵工艺较大幅度提高了发酵水平.

美国农业部预测，中国在2017-2018年农业季将会进口大约480万吨的大米，按2016年中国稻谷产量20693.4万吨计算，进口量仅占国内稻谷产量的2%。翟留栓认为，从数量上看，大量进口美国大米不会对中国稻谷格局产生实质影响；从质量上看，美国大米不具备很强的市场竞争力；从市场需求上看，进口美国大米对中国大米市场的冲击是十分有限的，大米是一种品牌农产品，人们消费大米是认品牌的，而美国大米并没有品牌，在此方面没有优势。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 菌 种

卡那链霉菌(Streptomyces kanamyceticus)0708，由浙江金华康恩贝生物制药有限公司研发中心提供；枯草芽孢杆菌63501由浙江金华康恩贝生物制药有限公司质量控制部提供.

1.1.2 培养基

种子培养基：玉米淀粉30 g/L，黄豆饼粉20 g/L，葡萄糖6 g/L，玉米粉10 g/L，NaNO3 1 g/L，CaCO3 4 g/L，淀粉酶0.03 g/L.pH自然，121 ℃灭菌30 min.

原发酵培养基：玉米淀粉60 g/L，麦芽糖50 g/L，黄豆饼粉50 g/L，蛋白胨5 g/L，NaNO3 8 g/L，KH2PO4 0.2 g/L，CaCO3 2 g/L，ZnSO4·7H2O 0.2 g/L，淀粉酶0.05 g/L，豆油5 g/L，PPE聚醚消泡剂0.1 g/L；pH 6.8～7.2，121 ℃灭菌30 min.

取表3中025批次发酵罐的发酵参数作图，结果见图2.由表3和图2可见：采用补料工艺，控制发酵液pH，卡那霉素效价平均提高31%，最高达37%，总产量平均提高35%，最高增产率达40%.

对比图1、图2可以发现，轨道换乘站周末与工作日的客流时变特征差异很大，工作日早晚双峰特征明显，周末早晚高峰时段则与平峰时客流量差异不大. 因此基于客流的时变规律可以对周末与工作日的客流拥塞风险进行有效区分.

补料培养基：淀粉水解液400 g/L，酵母粉90 g/L，分别进行121 ℃灭菌30 min.

1.2 方 法

1.2.1 摇瓶培养条件

斜面培养条件：用接种环取卡那链霉菌0708在斜面上划线接种，28 ℃培养108 h.

采用低浓度碳氮源发酵培养基，通过流加玉米淀粉水解液和酵母粉溶液，控制pH和溶氧，延长发酵周期至144 h，平行3 罐验证发酵新工艺的稳定性，结果见表4.

卡那霉素效价测定方法：管碟法

（1）对照组：34例患者中男性32例，女性2例；年龄范围60～86岁，平均年龄69.2岁；双侧血肿10例，单侧血肿24例。

50 L发酵罐装液量25 L，接种量10%，培养温度27 ℃，罐压0.05 MPa, 空气量15～35 L/min, 搅拌转速300～600 r/min，培养时间144 h.

补料方法：使用蠕动泵流加玉米淀粉水解液，控制发酵液总糖质量浓度(25±5) g/L；发酵72 h后，当溶氧回升时流加酵母粉溶液(2±0.1) g/(L·d)；用工业氨水控制发酵液pH为6.8±0.02.

1.2.3 分析方法

发酵培养条件：按10%接种量，将种子液接种到80 mL发酵培养液中(750 mL园底三角瓶)，27 ℃培养144 h，摇瓶机转速230 r/min.

2017年11月，成都召开“新经济发展大会讲话”，四川省委常委、成都市委书记范锐平在大会讲话中明确指出：要提升新模式服务实体经济能力，结合国家制造强市、国家服务业核心城市、都市现代农业示范城市建设，以“互联网+”思维改造提升实体经济，积极探索发展众筹、定制服务、新零售等新模式，重塑产业链和价值链，构建基于新模式的经济新体系。

1) 糖测定方法：斐林试剂法.

2) 氨基氮测定方法：甲醛法.

3) 菌体浓度的测定：取发酵液10 mL，3 500 r/min离心10 min，计算沉降物占发酵液的百分比.

2 结果与分析

2.1 降低发酵培养基初始糖质量浓度对卡那霉素合成的影响

原发酵培养基配方中含有玉米淀粉60 g/L、麦芽糖5 g/L，初始糖质量浓度高，导致发酵液流变性差.为降低发酵液黏度、提高溶氧、节约成本，研究降低发酵培养基初始糖质量浓度对卡那霉素合成的影响，结果见表1.

表1 降低发酵培养基初始糖质量浓度对卡那霉素合成的影响

Table 1 Effect of reducing fermentation cultured initial sugar concentration on kanamycin synthesis

序号玉米淀粉/(g·L-1)麦芽糖/(g·L-1)豆油/(g·L-1)卡那霉素效价/(U·mL-1)对照60505566915050106330250401063623503010652545020106422550101062256500106134

由表1可见：1) 玉米淀粉从60 g/L降到50 g/L，豆油从5 g/L升到10 g/L，效价提高11.66%；2) 玉米淀粉从60 g/L 降到50 g/L，豆油从5 g/L升到10 g/L，麦芽糖从50 g/L降到30 g/L，效价比对照提高15%，说明适当地降糖加油有利于卡那霉素合成；3) 维持玉米淀粉50 g/L、豆油10 g/L，只是麦芽糖质量浓度从50 g/L 降到30 g/L，效价提高3%，麦芽糖质量浓度继续从30 g/L降到0 g/L，效价下降6%.说明麦芽糖对卡那霉素合成的影响不显著，出于经济成本考虑，发酵培养基初始配方中选择玉米淀粉50 g/L、豆油10 g/L、麦芽糖0 g/L作为新配方的碳源组合.

2.2 降低发酵培养基含氮量对卡那霉素合成的影响

原发酵培养基中含有黄豆饼粉50 g/L，NaNO3 8 g/L，降低发酵培养基含碳量有利于卡那霉素合成，为平衡碳氮比，研究降低发酵培养基含氮量对卡那霉素合成的影响，结果见表2.

表2 降低发酵培养基含氮量对卡那霉素合成的影响

Table 2 Effect of reducing fermentation cultured nitrogen content on kanamycin synthesis

序号蛋白胨/(g·L-1)豆饼粉/(g·L-1)NaNO3/(g·L-1)效价/(U·mL-1)对照55085898154046225253046485352045206451042149

由表2可见：黄豆饼粉从50 g/L降到30 g/L，NaNO3从8 g/L降到4 g/L，卡那霉素效价提高10%；黄豆饼粉质量浓度继续从30 g/L 降到10 g/L，效价不断下降.说明发酵培养基初始配方中黄豆饼粉30 g/L、NaNO3 4 g/L、蛋白胨5 g/L为最佳氮源组合.

由2.1和2.2的摇瓶发酵结果可见：降低初始碳和氮的质量浓度，不仅没有降低产量，卡那霉素的效价反而提高，说明发酵培养基可以降低组分浓度.

2.3 连续补料对卡那霉素合成的影响

抗生素是次级代谢产物，在发酵后期营养物质匮乏的情况下才能合成，但营养物质的缺乏又不能大量持久地合成抗生素.因此连续低浓度补料可以维持抗生素的长时间合成.发酵液pH的变化会影响各种酶活、基质利用速率和细胞结构，影响菌体细胞膜电荷状况，引起膜渗透性的变化，从而影响菌体对养分的吸收和代谢产物的分泌[5].因此控制好发酵液的pH值有利于卡那霉素合成.

③单井控制面积要根据设计单井涌水量及作物最大灌水定额确定，审查中要严格控制单井控制面积，一方面尽量少打井减少投资，另一方面可促进节水，避免水资源的浪费。

为更好地进行连续补料发酵，对不补料发酵过程的工艺参数作图分析，结果见图1.

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图1 不补料工艺的发酵曲线 Fig.1 No feeding process of fermentation

由图1可见：在发酵18，42，66，85 h，通过4 次补水稀释发酵液，使溶解氧回升；发酵至96 h，pH高达7.9，糖和溶氧耗速率下降，卡那霉素效价增长趋缓，说明营养及环境条件不适合菌体合成卡那霉素，需要补料及代谢条件的平衡.

应用50 L自控发酵罐，按方法1.2.2发酵120 h.每6 h取样，通过斐林试剂法测定发酵液残糖含量.通过流加玉米淀粉水解液，控制发酵液总糖质量浓度在(25±5) g/L.通过自动流加氨水控制pH为6.8±0.05.发酵72 h后，依据维持较高的摄氧率流加酵母粉溶液.连续补料发酵结果见表3.

石破天眼前出现了一张清丽白腻的脸庞，小嘴边带着俏皮微笑，月光照射在她明澈的眼睛之中，宛然便是两点明星，鼻中闻到那少女身上发出的香气，不由得心中一荡，他虽于男女之事全然不懂，但一个二十岁的青年，就算再傻，身当此情此景，对一个美丽的少女自然而然会起爱慕之心。

表3 连续补料对卡那霉素合成的影响

Table 3 Effect of continuous feeding on kanamycin synthesis

批号放罐体积/L效价/(U·mL-1)效价提高率/%总产量×10-6/U增产率/%对照35．28520—300—02535．911673374194002637．110500233903002735．7113483340535平均36．2111743140535

新发酵培养基：玉米淀粉50 g/L，黄豆饼粉30 g/L，蛋白胨5 g/L，NaNO3 4 g/L，KH2PO4 0.2 g/L，CaCO3 2 g/L，ZnSO4·7H2O 0.2 g/L，淀粉酶0.05 g/L，豆油10 g/L，PPE聚醚消泡剂0.1 g/L；pH 6.8～7.2，121 ℃灭菌30 min.

1.2.2 发酵罐培养条件

图2 补料工艺的发酵曲线 Fig.2 Feeding process of fermentation

2.4 延长发酵周期对卡那霉素合成的影响

分析图1,2两条发酵曲线发现：连续补料发酵至120 h时，发酵液中残留总糖和氨基氮含量仍较高，比较补料与不补料两种发酵过程中卡那霉素的效价及合成速率，结果见图3.

图3 连续补料与不补料发酵过程中卡那霉素效价与合成速率的变化 Fig.3 Variation of kanamycin titer and synthesis rate in continuous and non-fed fermentation

由图3可见：不补料发酵工艺卡那霉素合成速率96 h后出现大幅下降，而流加补料工艺发酵至96～120 h，卡那霉素合成速率仍较高，达110 U/(mL·h)；发酵周期延长到144 h，卡那霉素合成速率仍在96 U/(mL·h)，再延长到168 h，卡那霉素发酵合成速率降低明显，因此卡那霉素补料工艺的最佳发酵周期为144 h.

2.5 卡那霉素补料新工艺稳定性的研究

种子培养条件：挖取斜面上活化的菌苔，接种到80 mL种子培养液中(750 mL园底三角瓶)，摇瓶机转速220 r/min，28 ℃培养48 h.

车间调度过程中，子批量Nji的初始位置为Ojil1所选机床，结束位置为OjilSjil所选机床，工序OjilSjil完工后不再需要搬运。搬运能耗为所有子批量在工序之间的搬运能耗之和，如式(15)所示。

表4 卡那霉素补料新工艺稳定性的验证结果

Table 4 Verificationresults of new feeding process stability kanamycin fermentation

实验批号效价/(U·mL-1)放罐体积/L总产量×10-6/U效价提高率/%增产率/%对照820635．22891001000401397337．05171701790411337637．24981631720421388736．7510169170平均1374537．0508167176

由表4可见：连续补料发酵工艺与原不补料工艺比较，卡那霉素效价最多提高70%，平均提高67%，产量最多提高79%，平均提高76%.平行3 罐验证发酵新工艺的稳定性好，效价和产量差异均小于5%.

3 结 论

降低卡那霉素发酵初始培养基中玉米淀粉、麦芽糖、黄豆饼粉的质量浓度后，改善了发酵液黏度，有利于提高发酵液溶氧和营养物质的传递.新配方为玉米淀粉50 g/L，豆油10 g/L，黄豆饼粉30 g/L，NaNO3 4 g/L.卡那霉素原发酵工艺对pH不控制，前期由于糖的分解产生有机酸导致pH下降，而链霉菌适合在中性偏碱的环境中生长；中后期由于黄豆饼粉中蛋白质的分解、生理碱性盐NaNO3中的利用及菌体自溶，pH逐步升高到8.0左右，而卡那霉素合成的最适pH为6.8，因此通过降低初始糖质量浓度、流加糖，有利于pH稳定，控制好pH，使卡那链霉菌的生长与合成抗生素相关的酶处于最适状态，有利于卡那霉素的大量合成.采用新配方发酵培养基和补料新工艺，卡那霉素发酵效价最多提高70%，平均提高67%；产量最多提高79%，平均提高76%.发酵新工艺的稳定性好，效价和产量差异均小于5%.

其他参数测定方法：

参考文献：

[1] 王嶽, 方金瑞. 抗生素[M]. 北京:科学出版社, 1988.

基于上述的研究目的，本文主要的分析数据包括：读者借阅数据、借还分类数据、读者荐购数据、读者预约数据，分析的时间范围为2014—2018年。其中读者借阅数据包括不同类型和不同学院读者的借阅人数和借阅册次分布，借还分类数据包括不同学科在全年的借阅比例分布，读者荐购数据包括通过线上荐购系统参与图书采访的所有记录，读者预约数据包括读者需要但图书馆当前无可用复本的数据记录。由于数据记录中可能包含空值、系统异常处理值、临时记录等可能影响统计结果的值，在对数据预处理过程中自动剔除无效记录（尤其是读者类型、学院为空值的记录）。

[2] 赖滨霞. 间歇补料发酵方法在卡那霉素发酵中的应用[J].海峡药学, 2010,22(12):23-24.

[3] 王炫, 谢希贤, 蔡传康, 等. 谷氨酸棒杆菌KGA-3产α-酮戊二酸补料分批发酵工艺优化[J].发酵科技通讯, 2016,45(1):45-49.

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[5] 李继安, 林惠敏, 牛金刚, 等. 流加补料技术在林可霉素发酵中的应用[J].中国医药工业杂志, 2012,43(9):739-742.

CiteSpace中时间范围设置为“From 2004 to 2018”，years per slice为 1年，Node Types选择Keyword，每个时间切片选择Top 50，连线强度选择Cosine，没有进行裁剪（Pruning），生成移动阅读高频词统计表（见表3）和关键词共现图谱。点击Burstness进行突发性探测，生成突发性关键词（见图5）。

[6] 储炬, 李友荣. 现代工业发酵调控学[M]. 3版. 北京:化学工业出版社, 2016.

1.2.2 训练内容 以汪波等［5］编制的“精神分裂症患者社会技能训练模式”为基础，内容适当简化和调整，尽可能符合患者的实际需要和方便易行，主要内容包括5个方面。

式中，x1，x2 和S1，S2分别为前后n1年和n2年的均值和标准差；S为合并方差；T为两组样本对应的统计量。