莽草酸(shikimate)，化学名称3,4,5-三羟基-1-环己烯-1-羧酸，是合成芳香族氨基酸及有机酸的重要中间物.由于其独特的化学结构，可以被用来合成重要的化学品，如酚类、生物碱、吲哚衍生物和手性药物等[1-2].更为重要的是，莽草酸是合成抗猪/禽流感药物达菲的前体物[3-5].此外，莽草酸还被广泛用作除草剂和抑菌剂[6]，以及应用于有机化学和医药行业[5].莽草酸的现行生产方法主要是从八角果实中提取，其涉及步骤多、收率极低[7].微生物发酵法生产莽草酸是一种极具潜力的可持续的替代工业生产方法.目前，利用代谢工程构建莽草酸生产菌株已成为研究热点，包括大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌、枯草芽孢杆菌等[7-8].经过多年的研究，科学家们已经构建了许多莽草酸生产菌株，有些莽草酸产量也比较高.然而，从莽草酸高产菌株的获得到其工业化生产之间还必须进行发酵培养基的优化和发酵过程控制的系统研究.

本课题组在前期工作中获得了一株大肠杆菌莽草酸生产菌，首先对其发酵培养基中碳氮源、金属离子进行了单因素优化，在此基础上，经过正交实验设计，对影响菌体生长和莽草酸产量的重要因素进行组合优化，拟获得适宜莽草酸发酵的培养基配方，为今后莽草酸工业化生产提供一定的参考.

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 菌 株

莽草酸生产菌大肠杆菌(Escherichia coli)SHIKΔaroL，保藏于天津科技大学代谢工程研究室.

1.1.2 培养基

斜面培养基：牛肉膏10 g/L，酵母膏5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 2.5 g/L，琼脂粉30 g/L.pH 7.0～7.2，121 ℃灭菌20 min.

首先，在工业锅炉的给水过程中，使用除盐水的效果要比软化水的效果好，其制水及排污过程中所产生的能耗都较低；其次，对于一般工业锅炉的使用单位来说，用除盐水代替软化水，所消耗的资金成本较高，从经济层面上分析这一做法并不合适。所以说，在工业锅炉的给水过程中，选择除盐水及软化水的最关键问题，就是需要结合实际的锅炉运行需要，从经济、技术层面进行综合性分析，制定有效的方案措施。

种子培养基：葡萄糖40 g/L，酵母粉2 g/L，蛋白胨2 g/L，柠檬酸三钠1.6 g/L，(NH4) 2SO4 1.2 g/L，K2HPO4 5.6 g/L，MgSO4·7H2O 1.6 mg/L，FeSO4·7H2O 2.8 mg/L，MnSO4·H2O 1.2 mg/L，VB1 1.3 mg/L，VH 0.3 mg/L.pH 7.0～7.2，121 ℃灭菌20 min.

发酵培养基：葡萄糖8 g/L，酵母粉1 g/L，蛋白胨5 g/L，牛肉膏1 g/L，玉米浆0.5 mL/L，柠檬酸2 g/L，(NH4)2SO4 1.6 g/L，K2HPO4·3H2O 7.5 g/L，MgSO4·7H2O 2 mg/L，FeSO4·7H2O 3 mg/L，钼酸铵0.009 mg/L，硼酸0.17 mg/L，CoCl2·6H2O 0.047 mg/L，MnSO4·H2O 0.017 mg/L，CuSO4·7H2O 0.017 mg/L，ZnSO4·7H2O 0.02 mg/L.碳氮源和金属离子优化实验中各物质的含量根据实际情况添加.pH 7.0～7.2，121 ℃灭菌20 min.

1.1.3 主要仪器

生化培养箱，广东省医疗器械厂；振荡培养箱，上海智诚分析仪器制造有限公司；数显鼓风干燥箱，上海博迅实业有限公司；752型紫外可见分光光度计，上海菁华科技仪器有限公司；SBA-40C生物传感仪，山东省科学院；LC-20A高效液相色谱仪，日本岛津公司.

1.2 发酵培养方法

1.2.1 菌种活化

从冷藏的菌种保藏斜面上或是保菌管中，用接种环接取适量菌体划线接种到新鲜活化斜面，36 ℃恒温培养16～20 h.再将斜面用无菌接种环转接至新的斜面，继续活化菌株，32 ℃培养20～24 h.

1.2.2 种子培养

通过对以上四组实验结果的对比分析可知：菌体生物量及莽草酸产量在不同实验组中相差较大，同组实验则相差较小.

将活化好的斜面，用接种环刮两环接种至含30 mL种子培养基(含质量分数4%的葡萄糖)的挡板瓶中.于36 ℃，200 r/min下摇床培养，通过苯酚红指示剂指示，用氨水调节pH为6.4～7.0.

通过以上单因素发酵优化实验，得出各因素对菌体生长和莽草酸积累的最适添加浓度.由于玉米浆对菌体生物量和莽草酸产量均无显著影响，可以将其去除.选取最优的酵母粉用量2 g/L，葡萄糖质量浓度15 g/L，其他发酵培养基的成分保持不变，对牛肉膏、蛋白胨、MgSO4·7H2O和FeSO4·7H2O四种成分进行进一步正交优化.实验采用四因素三水平的L9(34)正交设计，各因素及水平见表1，莽草酸产量及均值分析见表2，显著性统计分析见表3.

1.2.3 发酵培养

种子培养约10 h后，按体积分数10%的接种量转接至终体积为30 mL的发酵培养基中，初始葡萄糖质量分数为4%.于36 ℃，200 r/min下摇床培养，通过苯酚红指示剂指示，用氨水调节pH为6.4～7.0.当底糖消耗将近完全时补加0.5 mL质量分数为60%的葡萄糖.

1.3 分析检测方法

1.3.1 pH测定

使用pH 6.4～8.0精密pH试纸测定.

医保办工作人员积极参加医保经办机构组织的各种医保会议及医保管理方法分享等活动，学习最新医保管理策略。邀请上级医保经办机构人员来院进行医保知识讲座和对新政讲解，针对理解不到的内容和案例互动交流，达成对医保政策理解的共识，从而保持医保政策贯彻执行的一致性。

菌体生物量以干重表示，取30 mL发酵液13 000 r/min离心20 min，弃上清，菌体用去离子水洗涤两次，置于55 ℃恒温干燥箱中至恒重.用分析天平称重并计算每毫升发酵液所占的干重.

将发酵液稀释不同倍数，采用752型分光光度计测定600 nm波长下的吸光度，使OD600处于0.2～0.8.以OD值为横坐标，菌体干重为纵坐标绘制菌体干重曲线，获得干重曲线方程为：Y=0.362 41X-0.011 39(R2=0.998 3；Y为菌体干重DCW，g/L；X为OD600).

所取发酵样品稀释一定倍数后，测定OD600，根据干重曲线求得菌体干重DCW.

综上所述，通过单因素发酵优化实验发现：蛋白胨对菌体生长和产酸都有促进作用；牛肉膏对菌体生长促进作用明显，对产酸影响较小；酵母粉对菌体生长略有影响；玉米浆对菌株莽草酸发酵影响不大，可以忽略.因此，在后续正交实验设计中，只对蛋白胨和牛肉膏进行优化.赵现方等[9]对莽草酸发酵的碳氮源进行了优化，也发现相较于豆饼粉和酵母膏等，蛋白胨和牛肉膏对莽草酸发酵的影响最大.

采用SBA-40C生物传感仪测定.

分别以各因素的水平变化为横坐标，以莽草酸产量的均值为纵坐标，画出水平与指标关系图(图4).从图4可以看出：A2B1C3D1为最佳方案，符合表2中莽草酸产量最高时的因素组合.因此确定该培养基为大肠杆菌莽草酸发酵的最适培养基.具体配方为：牛肉膏3 g/L，蛋白胨10 g/L，MgSO4·7H2O 2 mg/L，FeSO4·7H2O 2 mg/L，酵母粉2 g/L，葡萄糖15 g/L，其他成分同材料与方法部分描述.通过培养基优化后，莽草酸产量达到4.675 g/L，是优化前1.453 g/L的3.22倍.

采用高效液相色谱法测定.发酵液预处理：取1 mL发酵液于1.5 mL离心管中，12 000 r/min离心2 min，取上清液稀释5倍，稀释液经0.2 μm膜滤器过滤后置于4 ℃冰箱中待测.检测条件：紫外检测器，色谱柱为Bio-Rad Aminex HPX-87H(300 mm×7.8 mm，L×I.D.)；流动相为5 mmol/L硫酸，流速0.5 mL/min，柱温30 ℃，检测波长215 nm.

2 结果与讨论

2.1 不同氮源对菌体生长及产酸的影响

发酵培养基中分别添加0，5，10，15，20 g/L的蛋白胨，对应的菌体生物量和莽草酸产量如图1(a)所示.当蛋白胨质量浓度为0～15 g/L时，菌体干重随着蛋白胨质量浓度的升高而升高，当蛋白胨质量浓度为20 g/L时，菌体干重略有下降.而莽草酸产量随着蛋白胨质量浓度的升高而一直上升.说明蛋白胨质量浓度确实对菌体生长和产酸有显著影响.

发酵培养基中分别添加0，1，3，6，9 g/L牛肉膏，菌体生物量和莽草酸产量如图1(b)所示.菌体干重基本随着牛肉膏添加量的升高而不断上升，而莽草酸产量基本保持不变.说明牛肉膏对菌体生长有一定作用，但对产酸没有显著影响.

发酵培养基中分别添加1，2，3，4 g/L的酵母粉，菌体生物量和莽草酸产量如图1(c)所示.当酵母粉质量浓度大于2 g/L时，菌体干重基本维持稳定.酵母粉质量浓度为2 g/L时，莽草酸产量达到最大，之后出现波动.说明酵母的添加对菌体生长有一定影响，对产酸没有显著影响.

发酵培养基中分别添加0，0.5，1.0，1.5 mL/L的玉米浆，菌体生物量和莽草酸产量如图1(d)所示.在所测试的玉米浆体积分数范围内，菌体干重和莽草酸产量出现小幅波动，基本保持不变，说明玉米浆的添加对菌体生长与产酸没有显著影响.

1.3.2 菌体生物量测定

1.3.3 葡萄糖浓度测定

图1 氮源对菌体生长及产酸的影响 Fig.1 Influence of nitrogen sources on bacterial growth and shikimate production

2.2 葡萄糖质量分数对菌体生长及产酸的影响

赵现方等[9]的研究发现葡萄糖和果糖比甘油和蔗糖等更有利于莽草酸的生产.笔者只选择了发酵工业中常用的葡萄糖，考察初始发酵培养基中的葡萄糖质量分数对莽草酸发酵的影响.在发酵培养基中分别添加质量分数为0.5%，1%，1.5%，2.0%，2.5%的葡萄糖，菌体生物量和莽草酸产量如图2所示.菌体干重和莽草酸产量随葡萄糖质量分数的升高呈现先升后降趋势，均在葡萄糖为1.5%时达到最大值，说明葡萄糖质量分数对菌体生长与产酸有一定的影响.仲楠[10]研究结果表明：莽草酸产量随着葡萄糖质量分数的升高先增加后下降，在葡萄糖质量分数为1.7%时达到最大值，与本实验结果类似.

1.1一般资料2015年5月至2017年5月我院对48例闭合性外伤性脾破裂患者进行了研究分析,共有男性患者40例,女性患者8例,年龄12岁至76岁,平均38.5岁。患者有局部疼痛和瘀血症状出现,伴随轻度的腹膜刺激症状,为患者进行了腹腔穿刺抽血检验,结合B超和CT来进行判断,显示患者存在脾破裂症状。脾损伤依据2000年9月第六届全国脾脏外科学术研讨会脾脏外科学组和脾脏外科协作组制定的脾损伤程级分级标准[2]。

当m≥2时,H(m,n)的结构比较复杂,给出它的点可区别边色数还是有一定的难度的,在此借助染色算法能够给出H(m,n)的一个上界。

图2 葡萄糖质量分数对菌体生长及产酸的影响 Fig.2 Influence of initial glucose content on bacterial growth and shikimate production

2.3 金属离子对菌体生长及产酸的影响

发酵培养基中分别添加质量浓度为0，1，2，3 mg/L的FeSO4·7H2O，菌体生物量和莽草酸产量如图3(a)所示.菌体干重随FeSO4·7H2O质量浓度的升高而不断增加，在3 mg/L时达到最大值.莽草酸产量在FeSO4·7H2O质量浓度为2 mg/L时升至最大值.说明铁盐的添加对菌体生长与产酸有一定的促进作用.在发酵培养基中分别添加质量浓度为0.8，1.4，2，2.6 mg/L的MgSO4·7H2O，菌体生物量和莽草酸产量如图3(b)所示.菌体干重随着MgSO4·7H2O质量浓度的升高先增加后下降，在MgSO4·7H2O为1.4 mg/L时达到最大.莽草酸产量呈现小幅波动.

图3 金属离子对菌体生长及产酸的影响 Fig.3 Effects of metal ions on bacterial growth and shikimate production

综上所述，FeSO4·7H2O对菌体生长和莽草酸积累均具有较大影响，而MgSO4·7H2O对菌体生物量影响较大.就单因素结果而言，最佳FeSO4·7H2O质量浓度为2 mg/L，最佳MgSO4·7H2O质量浓度为1.4 mg/L.然而，亚铁离子和镁离子为微量元素，少量添加对微生物生长具有不可或缺的作用，但其添加量需要严格控制.因此，在后续正交实验中对这两种金属离子的用量也进行了优化.

2.4 发酵培养基部分成分的正交实验

在大型猪场以及散养户中，仔猪白痢均有发生，该病是在仔猪哺乳期致病性大肠杆菌引起的肠道传染病。仔猪白痢病的发病率以及死亡率较高，同时也是一种影响生猪养殖效益、导致仔猪成活率低的主要疾病。

2)对于跨度达90 m的柔直阀厅屋盖，采用双层网架杆件长细比较大，采用三层网架可减小杆件计算长度，相应可减小杆件截面尺寸和球节点大小，节约用钢量的同时还可降低施工难度。网架采用优先采用螺栓球节点，仅在内力较大或构造不满足时采用焊接球节点，能够节约工期和降低现场施工难度。

表1 正交实验因素水平表

Table 1 Factors and levels in orthogonal experiment

因素水平123A牛肉膏/(g·L-1)136B蛋白胨/(g·L-1)51015CMgSO4·7H2O/(mg·L-1)0．81．42．0DFeSO4·7H2O/(mg·L-1)123

表2 莽草酸产量及均值分析

Table 2 Shikimate production and average analysis

实验设计A牛肉膏/(g·L-1)B蛋白胨/(g·L-1)CMgSO4·7H2O/(mg·L-1)DFeSO4·7H2O/(mg·L-1)莽草酸/(g·L-1)1150．824．39021101．443．59231152．063．0894351．463．99253102．024．67563150．844．2057652．044．14386100．863．20096151．423．861均值14．2913．7183．8153．427均值23．6903．8223．9693．980均值33．7354．1753．9324．309极差0．1960．1300．0810．275

极差分析：极差越大，表明因素的重要程度越高.由表2可知：四因素的极差排序为FeSO4·7H2O>牛肉膏>蛋白胨>MgSO4·7H2O，说明FeSO4·7H2O对实验结果带来的影响最大，其次为牛肉膏和蛋白胨，MgSO4·7H2O对实验结果造成的影响最小.

表3 显著性统计分析1)

Table 3 Significant statistical analysis

因素偏差平方和自由度F比F临界值牛肉膏0．06921．2384．460蛋白胨0．02720．4844．460MgSO4·7H2O0．01320．2334．460FeSO4·7H2O0．11422．0454．460误差0．2208

注：1) 在实验水平α=0.05时，分别验证各因素的显著性.

视频资料在节目制作和查询查考中，起着不可替代的作用，而价值甄别更是一件复杂而系统的工作，要研究这一工作，需要先发了解视频资料价值甄别的意义、视频资料的价值取向、内容价值的判断标准等方面，最为关键的是编目员需要具备的审视角度和价值敏感性等综合素质才能做好视频资料的价值甄别。

样本按“1.3”项试验条件进行气相色谱质谱分析，对应总离子流色谱图如图1所示。从图1可以看出，试验用气相色谱条件满足紫椴鲜花挥发性成分的分离要求。经气相色谱-质谱联用仪分析，用NIST05数据系统检索，分离出55个色谱峰，最终鉴定44种成分，占总面积的96.71%。挥发性成分分析及面积归一化法定量结果见表1。表1 数据说明，紫椴花主要挥发性有机成分有芳樟醇(34.37%)、β-苯乙醇(31.37%)、β-顺式-罗勒烯 (12.03%)、丁香醇A(2.00%)、反式-α,α-5-三甲基-5-乙烯基四氢化-2-呋喃甲醇(3.59%)等，占挥发性物质总量的83.36%。

1.3.4 莽草酸浓度测定

图4 各因素水平与指标关系图 Fig.4 Correlation between levels and shikimate productions for each factor

3 结 论

本研究对大肠杆菌生产莽草酸的发酵培养基进行了优化，显著提高了莽草酸的产量.首先通过单因素优化实验发现，与酵母粉和玉米浆相比，蛋白胨和牛肉膏对菌体生长和莽草酸产量影响较大，初始葡萄糖、MgSO4·7H2O和FeSO4·7H2O浓度均对菌体干重和莽草酸产量产生较大影响.通过正交实验对这四个因素进行进一步优化，获得最佳莽草酸发酵培养基，此时莽草酸产量达到4.675 g/L，为培养基优化前的3.22倍.

参考文献：

选择参数r和θ作为坐标建立一个二维Hough变换参数空间。由上式知，投影序列中任意一点(θi，ξi)，映射到参数空间(r，θ)为一条曲线。这样就把图像空间中的检测问题转换到参数空间。通过在参数空间里进行简单的计数累加，然后统计并寻找累加器峰值来检测正弦曲线。另一方面，如果给定一条标准投影序列，也可以反推模型质心位于相应位置上的图像重建。这就有利于三维对象的重建。

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能源现况定位：广东一次能源生产量处于全国中下游水平，能源消费总量位于全国前列，能源自给率处于全国中下游水平；能源利用效率在国内领先但与发达国家仍有差距；非化石燃料消费占比接近全国平均水平两倍；用能成本高，位于全国前列。

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显而易见，既然学习者的学习风格与其左右脑倾向密切相关，而语言学习者学习风格的拓展又主要取决于其右脑的开发，因此可曲径通幽，通过开发学习者的大脑尤其是其右脑以达到拓展其学习风格的目的。作为一种右脑策略，绘制思维导图，利用思维导图处理英语学习材料就是快速达到此目的的有效方法之一。

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这首诗是乐府旧题，意在送友入蜀。诗人以浪漫主义的手法，展开丰富的想象，艺术的再现了蜀道峥嵘、突兀、强悍、崎岖等惊险和不可凌越的磅礴气势，借以咏叹蜀地山川壮秀，显示祖国山河的雄伟壮丽。真是文人相惜，贺老头次日就迫不及待地向唐玄宗大力推荐，惹得皇上有些不快：本皇圣明，野无遗弃之贤才啊，怎么又冒出个李白呢。但贺知章看起来并不糊涂，他把李白吹嘘的神乎其神，玄宗就在金銮殿召见了李白。

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鉴于我国绝大多数AMI患者直接就诊于基层医院，而基层医院的诊治现状又极不规范，因此，规范化胸痛中心建设应该立足于建立区域协同救治模式。