0 引言

分散黄23是20世纪90年代中期低温分散染料中产量最多的一种，曾经一度在我国纺织印染市场中大量销售。而分散橙149因为没在我国进行生产因此在衣服上很少有检出。由于分散黄23和分散橙149在特定的条件下会还原出致癌芳香胺4-氨基偶氮苯，这些染料一旦使用在纺织品上，在与人体长期接触的过程中就会被人体皮肤所吸收，在人体复杂的生化条件下发生还原分解反应从而释放出致癌芳香胺，这些致癌芳香胺会使得细胞中的DNA发生变化，从而诱发癌症[1-2]。因此Okeo-Tex Standard 100在2006年修订时就将分散黄23列入禁用染料的名单，次年也将分散橙149列入其中。

目前在我国，关于禁用染料测定的标准有GB/T 23345-2009《纺织品分散黄23和分散橙149染料的测定》[3]。标准中所述的测定方法主要包括有液相色谱 -串联质谱仪法和高效液相色谱法，由于使用液相色谱-串联质谱仪法测定目标物的成本会比较高，而传统的高效液相色谱法测定时间太长。因此本实验在该标准的基础上，通过优化流动相的梯度来实现被测物的快速分离和分析。同时在该方法的基础上探究了不同流动相、不同流速、柱温对被测物的影响，最后通过测定其标准曲线相关系数和回收率来验证该方法的正确性。本方法有效缩短了传统液相色谱的分析时间，适用于纺织品中分散黄23和分散橙149的测定。

1 实验

1.1 实验原理

通过沸腾的二甲苯蒸汽回流萃取样品中的染料，之后再浓缩驱除提取液中的溶剂，残留物用甲醇定容后用聚四氟乙烯膜过滤，接着用高效液相色谱仪进行测定[3]。

2.2 实验仪器和试剂

高效液相色谱仪1260（安捷伦公司）、真空旋转蒸发仪、容量瓶、移液枪、甲醇 （HPLC级）、乙腈 （HPLC级）、甲酸 （HPLC级）、冰醋酸 （AR）、 磷酸 （AR）、 醋酸铵 （AR）、分散黄23和分散橙149标准品 （德国 Dr.Ehrenstorfer公司）。

1.3HPLC-DAD测试条件

色谱柱：Agilent Zorbax Eclipse SB-C18分析柱 (5 μm，4.6 mm×150 mm);流速0.5～1.0 mL/min;进样量 20 μL;柱温 30～50℃;流动相A:0.1%磷酸或0.1%甲酸或0.1%醋酸铵-醋酸溶液 （配制0.1%的醋酸铵溶液后用冰醋酸调节pH值至4.5），流动相B:乙腈；梯度洗脱程序：0～8 min，流动相B 10%～70%;8～10 min，70% ～90%，并保持6 min，16～20 min，流动相B 10%～90%，并保持5 min；检测波长范围：200～700 nm，定量波长：380 nm，460 nm。

1.4 样品前处理过程

准确称取分散黄23和分散橙149标准品适量 （精确到0.00001 g），以甲醇为溶剂准确配制质量浓度为500 mg/L的单组分标准储备液，之后进行稀释，取适量配制成100 mg/L的混标。之后再用甲醇逐级稀释至0.5 mg/L、2.5 mg/L、5.0 mg/L、10.0 mg/L、20.0 mg/L的工作液。

在Java中创建线程的方法有两种：继承类Thread和实现接口Runnable。在本课题中，由于专门建立了一个类样条曲线类（SplineThread）用来实现线程，因此，采用继承Thread类的方法来创建线程，并且把实现插补动画的程序代码放到从Thread继承来的方法run()中。具体的动画实现步骤如图4所示。通过以上的动画实现步骤，就可以实现数控插补的动态演示，达到可视的效果。

1.5 标准曲线的配制

取代表性试样/标样，裁剪成20 mm×5 mm的小片，称取1.0 g（精确到0.01 g），用无色纱布扎紧，置于25 mL沸腾的二甲苯上方回流45 min，使得冷凝的溶剂可以渗透过样品，之后冷却到室温后在真空旋转蒸发仪上60℃下除去二甲苯溶剂。残留物经甲醇多次转移到10 mL容量瓶中后用甲醇定容。定容后的样品经0.45 μm聚四氟乙烯滤膜过滤到样品瓶中，上机分析。

2 结果与讨论

2.1 不同流动相种类对分散黄23和分散橙149测定的影响

为了使目标产物得以分离，在高效液相色谱方法开发中，流动相的选择是极其重要。一般来说，常用作反相色谱的有机相是甲醇和乙腈。两者相比，甲醇活性比乙腈高有时候会与某些样品反应、在低波长下有紫外吸收，因此会降低方法的灵敏度，但是价格相对来说较为便宜，而乙腈价格较高但洗脱能力较好且很少和样品发生反应，同时截至波长比甲醇低20 nm。在本方法中，为了提高分析方法的灵敏度，我们选择使用乙腈作为有机相。在水相的选择中，为了改善峰型，提高响应值和分离度，一般会调节水相体系的pH值，加入酸或者缓冲盐。在标准GB/T 23345-2009纺织品分散黄23和分散橙149的测定中就使用了0.1%的磷酸溶液作为水相。为了探究不同流动相对分析方法的影响，本实验通过采用0.1%磷酸溶液、0.1%甲酸溶液和0.1%醋酸铵溶液 -醋酸溶液 (pH=4.5)作为流动相探究不同水相流动相对目标产物分离度和响应值的影响。为了保证实验过程的准确性，实验分别采用了0.5 mg/L、2.5 mg/L、5 mg/L的混标溶液在不同的流动相条件下进行梯度洗脱，实验结果如表1、2、3所示。

正是因为上述特性，日记这一工具被主要应用于考察二语习得研究中的个体差异问题，学习策略问题，师、生二语课堂教与学的体验问题，以及移民和旅行者对在目的语环境中学习第二语言和与当地人进行社会交往的认知问题。

为了保证实验结果的准确性，在探究不同流速对分散黄23和分散橙149时，采用0.1%的磷酸溶液和乙腈作为流动相，柱温为40℃且保持相同的洗脱梯度。如表4所示，随着流动相流速增大，响应值越来越低，且保留时间逐渐前移。图3和图4是不同流速下分散黄23和分散橙149的色谱图，从图中可以看出尽管流动相流速发生变化，但两种目标产物还是能够很好地分离并且峰型没有太大的变化。一般来说，流速越小分离度会增加且峰型越好，但这时候柱效会降低且样品出峰时间长，还浪费溶剂。而流速太大了也会使得目标产物出峰位置前移，既影响目标产物的分离度又会使得柱子压力过大。结果表明，随着流速的增加，色谱柱的理论塔板数升高，分离因子和分离度会降低，因此在保证柱压不会过高以及分离度能够满足方法的精密度时，5 μm的C18反相色谱柱的流速尽可能保持在1.0 mL/min左右。

取2.5 mg/L混标在不同流动相中洗脱的色谱图进行比较，如图1和图2所示：分散黄23和分散橙149的分离度和峰型在三种条件的流动相下都能有效分离，且响应值相当。由于磷酸在低波段没有紫外吸收且不像甲酸容易挥发且有刺激性，又不会像醋酸缓冲盐溶液那样长期使用对HPLC的泵头产生损害，而且能够对分散黄23和分散橙149进行有效的分离，因此在不影响分析结果的情况下，流动相选择0.1%的磷酸溶液效果较佳。

 

表1 流动相为0.1%磷酸和乙腈的测试数据

  

流动相A：0.1%磷酸；流动相B：乙腈

 

物质质量浓度/(mg·L-1)响应值 保留时间实测值 均值 RSD/%实测值/min响应值 保留时间 物质质量浓度/(mg·L-1)均值/min RSD/% 实测值 均值 RSD/%实测值/min均值/min RSD/%74.712.33550.513.911（分散黄23）0.5 74.0 12.329 50.2 13.910 75.6 12.311 51.3 13.926 76.1 12.330 51.5 13.940 76.0 12.327 50.9 13.963 75.8 12.330 51.0 13.964 75 1.1112.33 0.07 (分散橙149)0.551 0.9513.94 0.17 364.412.316242.613.882（分散黄23）2.5 366.0 12.317 244.2 13.890 366.2 12.315 243.2 13.877 371.5 12.321 247.5 13.943 372.9 12.325 248.3 13.938 366.1 12.316 243.1 13.912 368 0.9412.32 0.03 (分散橙149)2.5245 1.0013.91 0.21 822.012.317546.213.882 838.3 12.330 557.2 13.913（分散黄23）5 822.4 823.0 823.9 828 0.9812.329 12.329 12.331 12.33 0.04 (分散橙149)5 546.4 548.1 547.1 550 0.9713.905 13.903 13.921 13.91 0.11 838.7 12.331 557.3 13.927

 

表2 流动相为0.1%甲酸和乙腈的测试数据

  

流动相A：0.1%甲酸；流动相B：乙腈

 

物质质量浓度/(mg·L-1)响应值 保留时间实测值 均值 RSD/%实测值/min响应值 保留时间 物质质量浓度/(mg·L-1)均值/min RSD/% 实测值 均值 RSD/%实测值/min均值/min RSD/%76.212.35051.713.973（分散黄23）0.5 76.3 12.336 51.1 13.949 74.8 12.327 50.4 13.926 74.7 12.334 50.5 13.927 74.8 12.346 50.5 13.934 74.7 12.351 51.3 13.942 75 1.0312.34 0.08 (分散橙149)0.551 1.0413.94 0.13 367.812.352244.513.953（分散黄23）2.5 366.8 12.351 244.9 13.957 367.1 12.342 244.9 13.952 374.0 12.339 249.8 13.942 366.8 12.335 243.8 13.956 368.8 12.355 244.1 13.991 369 0.7512.35 0.07 (分散橙149)2.5245 0.9113.96 0.12 832.012.354544.314.011 816.7 12.342 543.0 13.984（分散黄23）5 832.1 828.7 831.9 826 0.9012.333 12.353 12.348 12.34 0.08 (分散橙149)5 554.6 553.8 553.0 549 1.0413.985 14.021 13.995 13.99 0.14 817.4 12.333 543.0 13.966

 

表3 流动相为0.1%醋酸铵-醋酸和乙腈的测试数据

  

流动相A：0.1%醋酸铵-醋酸；流动相B：乙腈

 

物质质量浓度/(mg·L-1)响应值 保留时间实测值 均值 RSD/%实测值/min响应值 保留时间 物质质量浓度/(mg·L-1)均值/min RSD/% 实测值 均值 RSD/%实测值/min均值/min RSD/%74.812.36550.313.981（分散黄23）0.5 74.4 12.340 50.0 13.938 76.0 12.340 51.5 13.951 74.9 12.337 50.4 13.948 76.4 12.339 50.9 13.956 76.0 12.336 51.3 13.963 75 1.1012.34 0.09 (分散橙149)0.551 1.1713.96 0.11 367.112.351243.213.981（分散黄23）2.5 367.5 12.337 244.7 13.967 367.6 12.334 244.3 13.945 376.4 12.356 244.8 13.978 367.5 12.332 249.2 13.986 374.4 12.338 245.3 13.966 370 1.1312.34 0.08 (分散橙149)2.5245 0.8413.97 0.11 815.112.347542.213.950 832.2 12.339 541.8 13.997（分散黄23）5 831.4 823.5 825.8 827 0.8112.338 12.335 12.325 12.34 0.06 (分散橙149)5 549.3 541.2 538.6 542 0.7213.964 13.962 13.968 13.97 0.11 831.9 12.330 538.9 13.965

即使晚年，西湖边的云松书舍也没有成为他最终的选择。他毫无疑问是香港的产物，是那个特殊时代的产物，离开了这样的时空来看金庸，无论褒之贬之都没有历史感，对历史人物要有同情之理解，钱穆先生是对的。何况他生平的言行还有许多不到能细说、能说清楚的语境。

  

图1 不同流动相下分散黄23的色谱图

  

图2 不同流动相下分散橙149的色谱图

2.2 不同流速对分散黄23和分散橙149测定的影响

由表1到表3实验结果可得，实验中不同流动相的使用对分散黄23和分散橙149响应值和保留时间没有太大的影响，分散黄23和分散橙149的出峰时间分别在12.3 min和13.9 min左右。在6次重复实验中，不同流动相测定的峰面积响应值和保留时间的相对标准偏差也很接近。

对全科医生抗生素用药态度的调查结果显示，有30.8%的医生认为在治疗过程中正确地选择抗生素非常难；89.7%的医生认为自己的抗生素相关知识还有待学习提高。由此说明，政府要继续加大对社区医院的卫生资源投入和配置，加强对社区医生，尤其是全科医生抗生素用药岗位培训和继续教育。此外，约有1/3的全科医生认为抗生素可预防急性上呼吸道感染的并发症，可见，全科医生对抗生素存在滥用的倾向。

 

表4 不同流速下分散黄23和分散橙149的峰面积响应值和保留时间

  

备注：分散黄23、分散橙149标样的质量浓度均为5 mg/L

 

目标物 流速/（mL·min-1） 响应值 保留时间/min 目标物 流速/（mL·min-1） 响应值 保留时间/min 0.5 1688.0 16.335分散黄23 0.5 1133.0 19.518 0.6 1404.9 15.004 0.6 940.1 17.620 0.7 1181.2 14.056 0.7 785.4 16.340 0.8 1036.4 13.353 0.8 688.0 15.423 0.9 921.0 12.775 0.9 614.3 14.950 1.0 822.4 12.329 1.0 546.4 13.905分散橙149

  

图3 不同流速下分散黄23的色谱图

  

图4 不同流速下分散橙149的色谱图

2.3 不同柱温对分散黄23和分散橙149测定的影响

为了保证实验结果的准确性，在探究不同柱温对分散黄23和分散橙149测定的影响时，采用0.1%的磷酸溶液和乙腈作为流动相，1.0 mL/min的流速且保持相同的洗脱梯度下，通过测定5 mg/L分散黄23和分散橙149的混标来进行实验。结果如表5、图5和图6所示，不同柱温下分散黄23和分散橙149的峰面积响应值没有发生太大的变化，但保留时间会随着柱温的升高而前移但前移的程度不及增大流速对保留时间的影响明显。一般来说，柱温升高有利于提高目标产物的分离，但柱温太高会缩短色谱柱的寿命，而且作为流动相的乙腈沸点较低，柱温太高容易导致有毒乙腈蒸汽大量挥发从而损害测试者的健康。一般而言在保证分离度时，柱温尽可能保持在30～50℃。从图5和图6可以看出，虽然柱温在30℃时目标产物仍可以很好地分离，但由于在测试过程中，除了两种待测的目标产物外，布上还有很多其他不同类型的杂质可能会影响目标物的测定，因此在保护色谱柱和保证分离度的前提下，柱温控制在40℃较为合理。

 

表5 不同柱温下分散黄23和分散橙149的峰面积响应值和保留时间

  

备注：分散黄23、分散橙149标样的质量浓度均为5 mg/L

 

目标物 温度/℃ 响应值 保留时间/min 目标物 温度/℃ 响应值 保留时间/min 30 832.1 12.539分散黄23 30 553.4 14.378 35 832.5 12.461 35 553.6 14.205 40 822.4 12.329 40 546.4 13.905 45 832.0 12.241 45 544.3 13.762 50 847.5 12.158 50 562.9 13.594分散橙149

  

图5 不同柱温下分散黄23的色谱图

  

图6 不同柱温下分散橙149的色谱图

2.4 分散黄23和分散橙149标准曲线及回收率

图7和图8分别是分散黄23和分散橙149的工作曲线。结果表明分散黄23和分散橙149在质量浓度0.5～20 mg/L的范围内与色谱峰面积响应值呈良好的线性关系，相关系数分别为 0.99936和0.99919。

  

图7 分散黄23标准工作曲线

 

质量浓度/[ng· (μL)-1]

  

图8 分散橙149标准工作曲线

 

质量浓度/[ng· (μL)-1]

 

表6 分散黄23和分散橙149的回收率

  

目标产物 加标质量浓度 /(mg·L-1) 样品质量浓度/(mg·L-1) 检测质量浓度 /(mg·L-1) 回收率 /%分散黄23 0.5 0.51 0.48 94.1 2.5 2.48 2.38 96.0 5.0 5.02 4.73 94.2分散橙149 0.5 0.50 0.49 98.0 2.5 2.48 2.42 97.6 5.0 5.01 4.86 97.0

为了验证方法的可行性，本实验采用0.5 mg/L、2.5 mg/L、5.0 mg/L的混标来进行加标回收率实验。结果如表6所示，分散黄23和分散橙149的回收率均满足GB/T 23345-2009上80%～120%的要求[3]，表明该方法是可行的。

3 小结

本实验通过探究不同流动相、流速和柱温对分散黄23和分散橙149测定结果的影响，分析了不同的影响因素对测定结果的影响，从而得出适合分散黄23和分散橙149测定的最佳条件。利用乙腈和0.1%磷酸溶液作为梯度洗脱的流动相，得出最佳实验流速和柱温分别为1.0 mL/min和40℃。本实验优化了流动相的洗脱条件，有效地降低了分析时间，一次进样仅需25 min。同时为了验证方法的准确性，对分散黄23和分散橙149进行工作曲线以及加标回收率的测定。实验结果表明，两种染料在0.5～20 mg/L范围内线性良好，加标回收率在94.1%～98.0%范围内，符合国家标准对回收率的要求。

参考文献

[1]陈荣圻.C.I.分散黄23的禁用的检测 [J].印染2009， 35 （21）： 46-48.

[2]丁友超，徐鑫华，孙成，钱凯.液相色谱 -串联质谱测定纺织品中分散黄23和分散橙149[J].分析化学，2008，36 (9):1289-1292.

[3]中国纺织工业协会.GB/T 23345-2009纺织品 分散黄23和分散橙149染料的测定 [S].北京：中国标准出版社，2009.