貂熊（Gulo gulo），别名狼獾，属食肉目（Carnivora），鼬科（Mustelidae），貂熊属（Culo），为环北极型动物，广泛分布于欧亚和北美大陆北部[1]，在中国只在东北地区的大兴安岭和新疆北部阿尔泰地区有分布。貂熊在1989年列入国家Ⅰ级重点保护动物。在我国的貂熊分布区内，缺少大型的食肉动物，使得貂熊成为这些林区生态系统中的顶级捕食之一，它的生存，尤其是在冬季，很大程度上依赖于大中型食草动物种群的丰富度[2]。这样，貂熊不仅是世界环北极的代表性动物物种，并且是我国寒温带针叶林生态系统的重要的旗舰物种和指示种。

1.4 观察指标 术中总失血量：由专人进行评估，计算冲洗吸引瓶中增加液体量和术中使用纱布增加净质量。血红蛋白变化情况：术后第3天复查血常规，血红蛋白值与术前差值为血红蛋白变化。输血患者比例：输血患者占所在组全部患者人数的百分比为输血患者比例。输血指征：术后复查血红蛋白＜70 g／L；血红蛋白介于 70～100 g／L患者伴有头晕，心慌，气短，精神状态差，等心肺不耐受由主任医师判断是否给予输血。深静脉血栓：术后第5天所有患者常规复查双下肢静脉彩色多普勒超声检查明确是否有深静脉血栓形成。术后引流量、住院时间、术后深静脉血栓及肺栓塞发生率。

线粒体DNA是具有变异速率高、母性遗传、不重组以及共线性好等遗传特性且不受自然选择或人工选择的影响，是理想的进化分析分子标记。以往的研究多集中在线粒体控制区和蛋白质编码区。而线粒体RNA基因具有大致相同的核苷酸数，相对于核tRNA基因，线粒体tRNA基因进化速率要快100倍[3]，碱基的转换/颠换速率也大致相当。高等动植物线粒体基因组几乎均含有22个tRNA基因，线粒体tRNA基因的二级结构是从研究种群遗传和进化的理想的分子标记 [4]。Hopper等认为基因组分析和新技术开辟了tRNA生物化学领域，tRNA研究受到关注 [5]。Kumazawa等研究显示应用线粒体tRNA基因在研究爬行动物系统发育问题具有较高的置信度 [6]，Macey等认为线粒体tRNA二级结构的复制滑移可导致其平行进化[7]。本文通过PCR大兴安岭地区的貂熊线粒体基因组，获得了貂熊线粒体全序列，并对其tRNA基因序列及其二级结构进行了研究分析，丰富了鼬科动物线粒体基因组数据库，对研究貂熊线粒体基因组结构、组成特点及探讨线粒体起源和进化有重要意义。

1.2.2 观察组 在对照组的基础上，为患者发放糖尿病自我管理手册，并针对患者的病情、健康知识的需求，使用手册中相关内容对患者进行宣教。

1 材料与方法

1.1 实验动物与基因组DNA提取

实验动物为齐齐哈尔龙沙动植物园中养殖的貂熊，系野外救助所得。取样为新鲜血液，采用非损伤性取样法，从其后肢采集静脉血液5ml置于枸橼酸钠抗凝管内，4℃冰箱内保存备用。

貂熊线粒体基因组的组成及其排列顺序与目前已知的鼬科动物相同，这体现了线粒体基因组在进化上的高度保守性。貂熊线粒体tRNA基因序列中，碱基含量为A含量最高，G含量最低，存在显著的AT偏爱，与其他动物具有相似的。

1.2 引物设计和PCR扩增

根据GenBank已经公布的貂熊（登录号：AM71190） 和日本貂 （Martes melampus）（登录号：AB291076）的线粒体基因组全序列，利用CLUSTALX1.8软件和Blast软件进行序列比对，再用DNAStar软件设计可覆盖貂熊线粒体基因组全序列的引物，引物委托北京三博志远生物技术有限公司合成。

PCR反应体系为：10×扩增缓冲液5ul，dNTP混合液（各2.5umol/L）4ul，上下游引物各2ul（10umol/L），模板 DNA1 ul，Taq DNA 聚 合 酶 （5u/ul）1ul， MgCl2 15mmol/L，加双或三蒸水至50ul。PCR扩增的反应条件：95℃预变性 5min；然后 95℃变性 40s；57℃退火30s，72℃延伸 3min，共 35 个循环；72℃延伸 10min。PCR扩增产物通过2.0%琼脂糖凝胶电泳回收，纯化后作测序反应，进行测序（ABI 3730全自动测序仪）。

1.3 序列分析和结构预测

DNAstar统计序列全长、碱基含量，通过与GenBank已公布的鼬科动物mtDNA比较，利用DNAstar分析定位蛋白编码基因、12S rRNA基因、16S rRNA基因22种tRNA和D-loop区。使用t RNAScan-SE 1-21和RNA structure5.6对22种tRNA的二级结构进行预测。

2 结果与分析

2.1 貂熊的基因组组成与排列

利用PCR方法和测序技术获得貂熊线粒体基因组全序列，其全长为16575bp，提交GenBank登录号：KR 611313。貂熊的线粒体基因组成和大多数脊椎动物相似，包括13种蛋白质，22种tRNA和2种rRNA和1个控制区。1个蛋白质编码基因（ND6）和8个tRNA （tRNA-Gln，tRNA-A1a，tRNA-Cys，tRNA-Asn，tRNA-Tyr，tRNA-Ser，tRNA-Glu，tRNA-Pro） 基因位于L链，其余基因均位于H链。

参考文献：

2.2 貂熊线粒体tRNA基因序列

3、生物柴油。生物柴油的生产是指将植物油、动物油脂、废食用油以及油料作物等为原料，在以甲醇或乙醇为催化剂作用下，将温度加热到230-250℃下进行酯化反应，生辰生物柴油的过程。

接下来按照网站建设的思路，逐一设计制作各个页面。图1为课程“Photoshop图像处理”的微网站效果图。

貂熊的线粒体tRNA基因全长为1462bp，其碱基组成为：A＝32.17%、G＝16.02%、T＝28.13%、C＝20.68%；AT含量（63.30%）＞CG含量（36.70%），而其基因全序列组成为 A＝32.18%、G＝14.26%、T＝26.75%、C＝26.18%；AT含量（58.93%）＞CG含量（41.07%），均存在显著的AT偏爱。

2.3 貂熊线粒体tRNA基因二级结构预测

动物RNA基因的二级结构很相似，呈现典型的三叶草茎环结构。貂熊线粒体基因组含有22个tRNA，其中14种位于重链H链上，8种位于轻链L链上，基因长度为61-75bp之间。其中包括俩个t RNA-Ser和t RNA-Leu，其余都仅有一个，利用t RNAScan-SE 1-21和RNA structure5.6对其二级结构进行预测（图1）。结果显示：在22种tRNA基因中只有tRNA-lys缺少二氢尿嘧啶环，其他21种tRNA都能折叠成典型的tRNA三叶草结构，包括氨基酸接受臂（Acceptor stem）、反密码子臂（Anticodon arm）、反密码子环（Anticodon loop）、双氢尿嘧啶（DHU）臂、TΨ C 臂、TΨ C 环（TΨ C loop）。tRNA-lys（TTT）的二级结构缺乏双氢尿嘧啶（DHU）臂。在预测的22个tRNA二级结构中，氨基酸接受臂长度为固定的7 bp，DHU臂长度为3-4bp，TψC臂长度为4-5bp，反密码子臂长度为4-5 bp，反密码子环均由7个碱基组成。三叶草结构的茎区相对保守，环区变化则相对较大。总共出现35处错配，其中有25对为GU错配，2对AC错配，5对UU错配，3对AA错配，而这些出现在tRNA基因中的错配均有可能通过RNA编辑机制得以修复。

 

表1 貂熊线粒体tRNA基因序列组组成

  

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3 讨论

基因组DNA的提取按酚—氯仿法，通过脱水，SDS/蛋白酶K裂解，离心和酚/氯仿提取等步骤提取基因组DNA，采用琼脂糖凝胶电泳检测。-20℃保存。

貂熊的线粒体tRNA的二级结构均符合据Kumazawa等提出K-N模型。对貂熊线粒体tRNA基因二级结构的预测显示：22种tRNA除tRNA-lys外均能折叠成典型的三叶草结构，碱基错配情况在氨基酸臂和DHU臂出现较多，而TψC臂和反密码子臂错配较少。碱基配对大部分符合Wasten-Click互补配对原则，是由于RNA是生物体内重要的遗传物质，在系统发生重建中RNA序列发挥着重要的作用，tRNA需要保证其二级结构尤其是茎结构不能改变来维持tRNA的正常生理功能，而tRNA只要茎结构中的一个碱基发生改变，则与之配对的另一个碱基也需要补偿性的改变。

福柯的全景敞视主义理念来源于18世纪英国功利主义思想家边沁提出的“全景敞视监狱”的概念。这一构造的基本原理是：监狱的四周是一个环形建筑，中心是一座瞭望塔。瞭望塔里有一圈大窗户，对着环形建筑；环形建筑被分成许多小囚室，所有囚室都对着中心瞭望塔。每一个囚室都有一前一后两扇窗户，一个对着里面，与塔的窗户相对，另一个对着外面，能使光亮从囚室的一端照到另一端。在中心瞭望塔中会安排一名监督者，每一个囚室关进一名犯人。通过逆光效果，人们可以从瞭望塔的与光源恰好相反的角度，观察四周囚室里被囚禁者的小人影。但是在瞭望塔中的百叶窗使得囚犯不能看到塔中的情况，他们只能被观看，而不能观看。

貂熊基因组中tRNA错配中出现较多的为GU错配，这与其他哺乳动物相似，研究认为经由G-U→G-C或G-U→A-U的途径发生突变，从而不受互补配对原则的限制，具有一定的稳定性。部分错配可通过RNA 的编辑得以校正[8，9]。

  

图1 貂熊线粒体基因组部分tRNA基因二级结构图

通过问卷星软件发放《校企合作问卷调查表（学生用卷）》，收到问卷为268份，其中2016级学生占145人，2015级学生占123人，2014级学生2人；通过问卷星发放《校企合作问卷调查表（企业用卷）》，回收问卷为60份。调查问卷显示大学生期待改革大学英语教学模式，加强英语听说能力培养，以及掌握专业英语学习。企业希望校企合作能够对大学英语教学改革有启示作用，也显示了企业所需的英语人才标准，以及强调大学生的英语听说能力培养。

[2]朱世兵.基于迁移行为、食性分析的貂熊冬季生境利用和评价[D].东北林业大学，2015.

[1]马逸清.黑龙江省兽类志 [M].黑龙江科学技术出版社，1986.

貂熊的mtDNA序列与其他动物相同，包含了22个tRNA，分散排列在线粒体基因组的整个序列中，其中14个位于H链，8个位于L链。在22个tRNA基因序列中共有8个间隔，最大间隔9bp，最小1bp，共有2个重叠分别为3bp和1bp。其组成见表1。

2018年戏曲百戏（昆山）盛典于10月29日拉开帷幕，并一直持续到12月7日。全国共有120个戏曲剧种、122家单位的155个剧目参演。由福建省文化厅组织选送的梨园戏、莆仙戏、高甲戏、打城戏、竹马戏5个本土剧种的1部传统经典大戏和6折代表性经典折子戏入选此次全国性戏曲展演，分别是福建省梨园戏传承中心梨园戏《吕蒙正》、莆仙戏剧院莆仙戏《杀狗记·迎春牵狗》、仙游县鲤声艺术传承保护中心莆仙戏《敬德画像》、厦门市金莲陞高甲剧团高甲戏《审陈三·探牢》、晋江市高甲柯派表演艺术中心高甲戏《骑驴探亲》、泉州打城戏传承中心打城戏《目连救母·代母绕枷》、漳浦县竹马戏（芗剧）传承保护中心竹马戏《唐二别妻》。

[3]Saccone C,Giorgi C D,Gissi C,et al.Evolutionary genomics in Metazoa:the mitochondrial DNA as a model system[J].Gene,1999,238(1):195-209.

[4]Boore J L.Survey and summary.Animal mitochondrial genomes[J].Nucleic Acids Research,1999.

[5]Hopper A K,Phizicky E M.tRNA transfers to the limelight.[J].Genes&Development,2003,17(2):162.

[6]Kumazawa Y,Nishida M.Variations in mitochondrial tRNA gene organization of reptiles as phylogenetic markers[J].Molecular Biology&Evolution,1995,12(5):759-72.

[7]Macey J R,Larson A,Ananjeva N B,et al.Replication slippage may cause parallelevolution in the secondary structures of mitochondrial transfer RNAs.[J].Molecular Biology&Evolution,1997,14(1):30-39.

[8]Kumazawa Y,Nishida M.Sequence evolution of mitochondrial tRNA genes and deep-branch animal phylogenetics[J].Journal of Molecular Evolution,1993,37(4):380-98.

[9]Kunzmann A,Brennicke A,Marchfelder A.RNA editing have to precede tRNA 3′processing in plant mitochondria.Proc Natl Acad Sci USA[J].Proceedings of the National Academy of Sciences,1998,95(1):108-113.