近年来，随着中药国际化进程的加快，中药对于某些疾病良好的治疗效果得到国际上广泛认可，并且在欧美国家出现“中药热”现象。有研究发现，龙芩草因含黄芩苷、甘草苷、天冬氨酸、谷氨酸等对H1N1流感病毒有一定的抵抗作用［1］；黄连、黄柏、白头翁、秦皮及马齿苋等中药可提高机体细胞免疫功能并能促进多种细胞因子的分泌［2-6］，常用于治疗或辅助治疗感冒等疾病。中性粒细胞可分泌弹性蛋白酶（NE）和组织蛋白酶（CG）调控机体炎症反应［7，8］，溶菌酶（LYS）和内源性抗菌肽（rCRAMP）是天然的具有抗菌活性的蛋白质，中性粒细胞（PMNs）分泌LYS和rCRAMP 是其能够杀灭细菌的原因之一［9，10］。 由于黄连、黄柏、白头翁、秦皮及马齿苋5味中药对PMNs作用的影响未见详细报道，故为探究以上5味中药对脂多糖（LPS）刺激RIMVECs后PMNs释放杀菌酶和表达rCRAMP的影响，本研究以RIMVECs和PMNs为研究对象，在成功建立大鼠RIMVECs-PMNs的Transwell体系基础上，运用ELISA和Western Blotting（WB）试验方法，较系统地阐述以上5味中药对PMNs在炎症反应中的影响，为黄连、白头翁、秦皮等中药在兽医临床中应用以及作为饲料添加剂等提供科学的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

SD大鼠，北京维通利华实验动物技术有限公司。rCRAMP抗体，OmnimAbs公司；NE、CG 和 LYS检测试剂盒，上海酶联生物技术有限公司；白头翁、黄连、黄柏、秦皮和马齿苋，北京同仁堂药店。

早餐是父亲做的，煎蛋、豆浆，还有几个热乎乎的包子。我一眼便认出那几个包子是原来上中学时，校门口那家的。我非常喜欢吃他们家的包子，后来上大学，偶尔回来，父亲一大早便骑上自行车，给我买回来。现在，父亲老了，骑不动车子了，一定是早上赶了好远的路才买回来的。

1.2 仪器设备

CO2培养箱，SANYO公司；电泳仪，BIO-RAD公司等。

1.3 方法

1.3.1 黄连、白头翁、黄柏、秦皮和马齿苋的煎制处理 取以上5种中药各50 g，分别放入药罐中，加10倍体积去离子水浸泡30 min。快火熬药，待水沸腾后，调慢火维持沸腾30 min，收集药液，使用200目筛趁热过滤。加入8倍体积去离子水煎煮1 h，收集药液，趁热过滤。加入4倍体积去离子水煮1 h，收集药液，趁热过滤。将3次收集的药液合并过滤，利用旋转蒸发仪，将5种中药水煎液的浓度浓缩至1 g／mL，于80℃真空干燥箱中干燥处理，冷却后密封，于-20℃冰箱备用。

当LPS刺激RIMVECs后，测定不同中药对RIMVECs迁移PMNs及正常未跨越RIMVECs的LYS分泌量，并绘制标准曲线（图5），依据试剂盒使用要求R2大于0.95，即绘制的标准曲线可用。与LPS+DMEM组相比，LPS+HL和LPS+BTW组PMNs的 LYS 分泌量极显著增加（P＜0.01）；LPS+HB 和LPS+QP组PMNs的LYS分泌量增加，但差异不显著（P＞0.05）（图 6）。

1.3.5 数据处理与分析 本试验数据使用Graphpad Prism5进行统计分析。数据以平均数±标准差（x±s）表示，采用独立样本t检验，P＜0.01表示差异极显著，P＜0.05 表示差异显著， 有统计学意义；P＞0.05 表示差异不显著，无统计学意义。

1.3.3 对 PMNs 迁移 RIMVECs 后释放 NE、CG 和LYS的检测 将细胞上清液以3 000 r／m离心10 min去除颗粒物，依据试剂盒说明书操作步骤进行NE、CG和LYS检测，绘制标准曲线，计算NE、CG和LYS分泌量。

当LPS刺激RIMVECs后，依据不同中药对RIMVECs迁移PMNs及正常未跨越RIMVECs的PMNs的NE和CG的分泌量绘制标准曲线（图1、图2），R2均大于0.95，根据试剂盒使用要求，绘制的标准曲线均可用。与LPS+DMEM组相比，LPS+HL和LPS+BTW 组 PMNs的 NE 分泌量显著增加（P＜0.05）；与LPS+DMEM组相比，LPS+HL组PMNs的CG分泌量极显著增加（P＜0.01），LPS+BTW 组 CG 释放量显著增高（P＜0.05），其余中药组没有显著变化（图 3、图 4）。

当LPS刺激内皮细胞后，LPS+HL组rCRAMP的相对表达量显著升高（P＜0.05），LPS+BTW 和LPS+QP组rCRAMP的相对表达量也增加，但差异不显著（P＞0.05）。 结果显示在 rCRAMP 表达上，中药黄连的保护作用更明显（图7、图8）。

1.3.2 分组及处理 参考本实验室已建立的鼠RIMVECs-PMNs 的 Transwell体系［4］，利用 Transwell通透性支持物进行试验。当体系中RIMVECs汇合至80%～90%时，用D-hank’s清洗2次，将细胞分为 6组，即 LPS 对照组（LPS+DMEM）、LPS+黄连组（LPS+HL）、LPS+黄柏组 （LPS+HB）、LPS+白头翁组 （LPS+BTW）、LPS+秦皮组（LPS+QP）、LPS+马齿苋组（LPS+MCX）。分别加入 1.5mL 10μg／mL 的 LPS 预处理 4h，药物组分别加入 1.5 mL 上述中药（200 μg／mL 黄连、200 μg／mL 黄柏、100 μg／mL 白头翁、500 μg／mL 秦皮和1 mg／mL马齿苋，通过预试验获得药物安全浓度），LPS对照组加无血清的DMEM培养液，药物组分别加入2.6 mL DMEM培养液，置于37℃的5%CO2中培养24 h。各组中加入提取好的PMNs（5×106个／mL），同时加入 2.6 mL 2%1640 培养基，孵育 3 h后收集样品并标记。

2 结果与分析

2.1 不同中药对跨内皮细胞PMNs分泌 NE、CG的影响

  

图1 NE标准曲线测定

  

图2 CG标准曲线测定

1.3.4 对 PMNs迁移 RIMVECs后 rCRAMP 的表达提取细胞蛋白质，依据WB步骤检测rCRAMP表达量，以目的蛋白质与actin的灰度比值表示目的蛋白质相对表达量。

  

图3 不同组别NE释放量

  

图4 不同组别CG释放量

2.2 不同中药对跨内皮细胞PMNs分泌溶菌酶的影响

  

图5 LYS标准曲线测定

在管道对接过程中，所连接管道长短不一，因而机架带动管道移动所需克服的阻力不一致，在实际控制中，这个阻力应叠加到工艺参数压力上，得到实际使用压力（在焊接过程中不仅要确定压力，而且要检查加热板温度是否达到设定值）。

  

图6 不同组别LYS释放量

2.3 不同中药对PMNs跨内皮后rCRAMP表达的影响

  

图7 不同组别rCRAMP表达量

1.2 换药时间安排 两组患者治疗及换药方法相同，对照组清创缝合术后2～3 d首次换药;观察组清创缝合术后第1天首次换药。

3 讨论

NE是由PMNs分泌的炎症介质，正常剂量NE可缓解感染对机体的损伤，但高剂量NE可降解胶原蛋白、层黏连蛋白以及细胞外基质，并通过EGFR、p38MAPK、ERK等信号通路调节黏液蛋白的分泌［7］。CG是由PMNs和单核细胞分泌产生的丝氨酸亚型组织蛋白酶，其通过水解活化细胞因子调控炎症。当LPS刺激RIMVECs后，与LPS+DMEM组相比，LPS+HL和LPS+BTW组PMNs的NE分泌量显著增加（P＜0.05）；与 LPS+DMEM 相比，LPS+HL 和，LPS+BTW组 PMNs的 CG 分泌量极显著或显著增加（P＜0.01，P＜0.05），以上结果揭示黄连和白头翁通过修复RIMVECs后，使得PMNs被激活释放NE和CG，其作用机制可能为：黄连和黄柏含有丰富的黄连素、多糖等物质，而白头翁含白头翁素等有效成分，当LPS+黄连或白头翁等作用细胞后，黄连素和白头翁素可能与RIMVECs表面的受体相互作用进而激活胞内相关信号通路，被激活后的RIMVECs释放大量趋化因子，如IL-18、IL-1和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子等，这些物质会刺激并激活PMNs，激活后的PMNs将胞内颗粒释放到胞外，后者含大量NE和CG，能够诱导炎症反应［7］。

LYS是一种天然抗菌蛋白，由PMNs等炎症细胞产生。主要针对革兰氏阳性菌有杀灭或抑制作用。rCRAMP是哺乳动物体内具有抗菌作用的小分子多肽类物质，不同物种间内源性抗菌肽具有功能上的高度保守，具有抑制细菌、真菌、病毒等作用，又能促进趋化因子释放，还可中和LPS并减轻内毒素性休克。rCRAMP是大鼠中惟一的内源性抗菌肽［9］，通过检测LYS分泌量和rCRAMP表达量可更好的评判PMNs跨内皮细胞后的抑菌或杀菌功能。当LPS刺激RIMVECs后，与LPS对照组相比，LPS+HL和LPS+BTW 组 PMNs的 LYS 分泌量极显著增加（P＜0.01），LPS+HL 组 rCRAMP 的相对表达量显著升高（P＜0.05），结果显示，在rCRAMP表达水平上，黄连的抑菌杀菌作用最明显。PMNs膜表面的整合素蛋白与RIMVECs膜表面的ICAM受体蛋白结合后，PMNs形态发生变化而穿过RIMVECs，PMNs吞噬LPS而被激活，释放出LYS和rCRAMP，而黄连和白头翁等中药的有效成分进一步促进PMNs释放出LYS和rCRAMP，所以表现出LPS+HL或BTW组PMNs释放LYS和表达rCRAMP显著增加。

黄连、白头翁、黄柏、秦皮和马齿苋对LPS刺激RIMVECs后 PMNs的 NE、CG、LYS和 rCRAMP表达均有不同程度的影响，其中黄连和白头翁的促进表达作用效果显著，说明以上两种中药可通过显著增加PMNs的溶菌酶释放和抗菌肽表达来提升保护效果，本研究为以上5种中药在兽医临床中的应用和作为饲料添加剂提供了理论依据。

2.加强科技研发，完善企业标准。要重新定位公司与分公司两级技术部门的主要职责和研发方向，形成公司技术部门以产品设计、研发和制订企业标准为主要方向，分公司技术部门以研究生产加工技术为主要内容的两级技术开发模式。要以产品标准化设计为重点开展技术研发，建立标准化产品的结构设计重量标准、外购件配置标准、质量检验标准、安装标准等产品企业标准。要对已完工的钢桥、钢结构雨棚和钢结构厂房等项目进行技术总结，提炼和编制满足国标、行业标准和设计要求的企业标准和作业指导书。

  

图8 不同组别rCRAMP相对表达量

参考文献：

［1］刘晓艳.复方龙芩草微乳液抗H1N1流感病毒的作用、物质基础及机制研究［D］.北京：北京中医药大学，2016.

［2］崔 岩，侯凤琴，祝国强，等.黄连解毒汤对雏鸡免疫功能及免疫器官的影响［J］.广东农业科学，2010，71（5）：135-137.

［3］张 婕，张宏伟，王秋红.盐炙前后黄柏多糖基本含量测定及对免疫功能的影响［J］.辽宁中医杂志，2017，44（6）：1263-1267.

［4］刘晓晔，张 涛，董 虹，等.白头翁汤对大鼠跨内皮迁移的中性粒细胞溶菌酶的影响［J］.畜牧兽医学报，2014，45（1）：142-146.

［5］赵婧晖，谢鲲鹏，隋佳琪，等.秦皮素通过抑制EGFR及其下游AKT信号通路抑制MCF-7细胞增殖及迁移［J］.中国生物化学及分子生物学报，2016，32（1）：56-63.

［6］郑丽明，殴江勇，黄秀云.马齿苋治疗复发性口腔溃疡的疗效及其对血清中 IL-8、TNF-α 的影响［J］.中国医药科学，2017，7（8）：25-27.

［7］易 阳，周国平，钟闻燕，等.中性粒细胞、白介素-8和弹性蛋白酶在急性毛细支气管炎发病中的作用［J］.临床儿科杂志，2009，27（2）：148-151.

［8］陈 驹，彭礼飞.组织蛋白酶G在炎症疾病发生发展中作用的研究进展［J］.山东医药，2017，57（21）：98-100.

［9］孙丛丛.内源性抗菌肽Cathelicidins在慢性阻塞性肺疾病病理改变中作用的研究［D］.济南：山东大学，2014.

［10］ BOBBY J，HOLLY P，CHARLES C.Mechanismsunderlying mouse TNF-α stimulated neutrophil derived microparticle generation ［J］.Biochemical and Biophysical Research Communications，2013，437：591-596.