中药免疫增强剂能增强机体免疫功能,我国的中药资源丰富,其中利用中药免疫增强剂提高免疫功能已取得显著效果。例如大黄(Rheum palmatum L.)、黄莲(Coptis chinensis Franch)能引起鲤鱼(Cyprinus carpio)免疫器官质量增加、溶菌酶活性增高和吞噬细胞吞噬能力的增强,可显著提高鲤鱼非特异性免疫能力(蔡中华等,1998)。采用不同剂量的灰树花多糖(Polysaccharide of Grifola frondosa,PGF)来检测其对鲤鱼血清凝集抗体效价的影响,试验组抗体水平明显高于对照组(王高学等,2006);分别用抗体对试验鳖进行浸泡和口服免疫,结果表明试验组免疫力大幅提高(庄政,2008)。添加不同水平的黄芪多糖(Astragalus polysaccharides,APS)饲喂异育银鲫(Carassius auratus gibelio),能显著提高异育银鲫的脾脏指数(P＜0.05) (胡兵等,2008)。利用含有 90%黄芪多糖的提取物饲喂感染嗜水气单胞菌的罗非鱼(Oreochromis niloticus),饲喂 0.10%黄芪提取物比饲喂基础日粮组显著提高白细胞吞噬活性,在第四周可以显著提高吞噬细胞的呼吸爆发活性(Ardó et al,2008)。在彭泽鲫(Carassius auratus var.Pengze)的日粮中添加紫锥菊提取物的研究表明,紫锥菊提取物能够促进彭泽鲫的生长,并提高其抗氧化能力(唐雪莲等,2012)。

从习总书记的讲话和《技校语文教学大纲》中可以得出结论：在全面推进素质教育的今天，人文素养是学校教育的核心，学生专业技能和职业素养的高低决定了能否在职业能力上有所提升，所以技校语文教学应重视人文素质培养，把语文课的特点与作用发挥到最佳程度。[3]

大量证据表明,渔用中药免疫增强剂可以成为增强水产动物抗病能力的有效途径。因此,开发一些新型的渔用免疫增强剂对促进水产养殖可持续发展具有重要意义。紫锥菊(Echinacea purpurea)是目前国际上普遍关注的一种免疫增强剂和免疫调节剂,其提取物及其制剂畅销美国医药市场(黄智慧等,2010),紫锥菊作为一种新型的免疫增强剂,在水产养殖中应用较少,任永林(2008)研究了紫锥菊提取物对鲤鱼的生产性能和免疫功能的影响,发现其能够显著提高抗病性能。唐雪莲等(2012)在彭泽鲫日粮中添加紫锥菊提取物,促进了其生长和抗氧化能力。目前还未见紫锥菊提取物在海水养殖动物中的应用情况。

大菱鲆(Scophthalmus maximus)是近年来推广的养殖品种,并逐渐成为我国重要的养殖品种(雷霁霖,2000;马爱军等,2002)。在欧洲,西班牙是最大的养殖国家(Cádiz,2015),目前中国已经成为世界上养殖第一的大国(FAO,2011)。但仍存在一些因素制约着大菱鲆的养殖,出苗率降低、生长速度减慢、抗逆性差等性状退化现象(雷霁霖等,2002),以及疾病等都造成了巨大的经济损失(雷霁霖,2005)。免疫能力低下是大菱鲆养殖期间高死亡率的重要原因之一。头肾是硬骨鱼类重要的造血器官(Press et al,1999),同时又是重要的次级淋巴样器官(Brattgjerd et al,1996),在特异性免疫反应等方面具有特殊作用,但有关中药提取物紫锥菊对它的作用效果尚未见报道。本试验通过研究紫锥菊提取物对大菱鲆头肾内非特异性免疫分子基因表达量的影响,从分子水平上进一步探讨其对大菱鲆非特异性免疫功能的影响。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验药物与试验动物 试验药物紫锥菊提取物(有效成分为 5.4%菊苣酸)由青岛市康地恩药业有限公司提供。试验用大菱鲆购于胶南通用水产有限公司。

汤翠准备离开，她不忍亲眼目睹铲掘机的魔爪伸向无花果。有人拉住她，手指着她家的废墟，嘴里呜里哇啦的。是哑巴。哑巴拉着她朝里面钻。谁不恋旧？连不会说话的哑巴都这样。

1.2 组织材料的准备

注射试验结束后,分别从高、中、低剂量组及空白对照组选出6尾大菱鲆,重击头部使其死亡,放入75%酒精中浸泡5min,然后在无菌环境中,分别取出高、中、低剂量组及空白对照组的大菱鲆的头肾于液氮中保存备用。

1.3 总RNA的提取

按照生工生物工程股份有限公司 EZ-10Total RNA Mimi-Preps Kit试剂盒说明书进行总RNA的提取,提取的总RNA用GeneQuant核酸分析仪进行浓度的测定,用琼脂糖凝胶电泳测RNA的完整性。

4.创新(1998—2010年)：党委政府领导下的维护社会和谐平安的经验。进入新世纪，“枫桥经验”坚持发展与稳定并重，创造了“四前工作法”、“四先四早”等工作机制，创新实施了“分工负责，维稳责任具体化；分块实施，综合治理网格化；分层掌控，源头预防动态化；分级联动，矛盾化解即时化；分类治理，服务教育人本化”的矛盾化解“五分法”，努力做到小事不出村、大事不出镇、矛盾不上交，形成了党政动手、依靠群众、源头预防、依法治理、减少矛盾、促进和谐的新格局。

1.4 cDNA第一链合成

以总 RNA为模板,按照 EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix试剂盒说明书逆转录反应合成cDNA,逆转录产物置于–20℃保存备用。

1.5 琼脂糖凝胶电泳

(1) 电泳槽的处理:电泳槽清洗后,用无水酒精冲洗,干燥后,用3%双氧水室温处理10min,最后用RNase-free H2O彻底冲洗,插入梳子。

1.1.2 试验仪器 电泳槽:北京六一仪器厂,型号:DYCD-31D;核酸蛋白检测仪:上海康华生化仪器厂,型号:HD-93-1;高速冷冻离心机:德国SIGMA,型号:3K18;电泳仪:北京市六一仪器厂,型号:DYY-Ⅲ12;电子恒温水浴锅:北京长风仪器仪表公司,型号:HW.SY21-K;荧光定量PCR仪:罗氏诊断产品(上海)有限公司,型号:Light Cycler 480。

(1) 按表1下列组分配制PCR反应液(反应液配制在冰上进行)。

(3) 电泳:待凝胶凝固后,小心取出点样梳,在电泳槽中加入 1×TBE电泳缓冲液,将胶板放入电泳槽中,使电泳缓冲液没过胶面。在待测样品中加入1/6体积的6×上样缓冲液,混匀后,用移液枪点样,并记录样品点样顺序,220V电泳35min。

(4) 拍照:于凝胶成像分析系统观察、拍照。

在养老机构的构成中，民办养老机构的比例不到20%。由于投资民办养老机构的民间资本缺乏，与公办养老机构相比，民办养老服务机构的规模小、设施不足、设施更新速度明显落后，加上服务人员的素质、内部运营服务水平不高和管理不规范，使民办养老机构入住率普遍不高。

1.6 实时荧光定量PCR

采用SYBR® Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)(Code No.RR820A)进行Real Time PCR反应。PCR反应体系见表1,试验中所需引物见表2。

(2) 配制1%琼脂糖胶:称取0.25g琼脂糖,加入30mL 1×TBE电泳缓冲液中,微波炉加热使琼脂糖溶解均匀,待冷却到50℃左右,加入1.5μL 10mg/mL的E.B,混匀,倒入电泳凝胶板中,除去气泡。

 

表1 PCR反应体系Tab.1 The PCR reaction system

  

试剂 使用量 终浓度SYBR® Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus) (2×) 12.5μL 1.0×PCR Forward Primer (10μmol/L) 1.0μL 0.4μmol/L PCR Reverse Primer (10μmol/L) 1.0μL 0.4μmol/L RT反应液(cDNA溶液) 2.0μL dH2O(灭菌蒸馏水溶液) 8.5μL Total 25.0μL

 

表2 荧光定量PCR反应中所需引物序列及长度Tab.2 The sequence and length of the primers in fluorescence quantitative PCR reaction

  

目的基因 上游引物 下游引物 长度β-Actin ATCGTGGGGCGCCCCAGGCACC CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC 493bp Transferrin CTGTCGCTGTGGCGAAGAAGG CGATGGGCGCTGTGCTGTTAT 374bp Lysozyme AGCCTGGCCGACTGGGTTTG CGCAGCGACACACAGTGAAAGTAAAG 517bp TGF-β1 ACAAGCCGACGGGCTACCATG CAGCAGGGCTGGGCAGAGG 173bp IL-1h AAAGAATCTTACCTGTCTTG TGCTGATGTTCACGCCGGAGTC 168bp C3补体 CAACAACTATGCCACAAG TCCGTAGACAGAGCGTAG 123bp

(2) 进行Real Time PCR反应

采用ΔCt法自动进行目标基因的荧光定量分析,再应用SPSS17.0软件对获得的实验数据进行单因素方差分析和Duncan多重比较。显著水平选为0.05,若P＜0.05,则为差异显著,同时用Excel 2010软件为作图工具。

按两步法 PCR扩增,程序如下:预变性 95℃30s,1个循环;PCR反应:95℃ 5s,40个循环,60℃30—60s。

2 结果与分析

一边拎着棍子巡逻，一边在脑子里翻来覆去倒腾这些事，越倒腾越垂头丧气。看来，倒霉的事是喜欢扎堆的，一个上来，接着就是一群，像绿头苍蝇一样赶都赶不散。背，背，真她娘的背啊。

2.1 总RNA提取及检测

注射28d后大菱头肾中,所提取的总RNA,使用酶标仪对 RNA 的浓度进行测定,同时对其OD260/OD280的数值进行测量,如果该值在 1.9—2.2之间则证明所提取的 RNA的质量比较高,本实验采集样品所提取得RNA均在2.0左右,属于可以继续实验的范围。同时通过电泳检测 RNA的质量,结果如图1、图2、图3所示。每个基因的条带都清晰可见,后续实验结果的可靠性也得到保证。

  

图1 TGF-β1基因、IL-1h基因电泳图Fig.1 TGF-β1 gene,IL-1h gene electrophoresis chart

 

注:1号条带:TGF-β1基因,2号条带:IL-1h基因

  

图2 Transferrin基因、Lysozyme基因电泳图Fig.2 Transferrin gene,lysozyme gene electrophoresis chart

 

注:1号条带:Transferrin基因,2号条带:Lysozyme基因

  

图3 β-Actin基因、C3补体基因电泳图Fig.3 β-Actin gene,C3 complement gene electrophoresis chart

 

注:1号条带:β-Actin基因,2号条带:C3补体基因

2.2 肌肉注射紫锥菊提取物对大菱鲆头肾中Lysozyme基因相对表达量的影响

如图4所示,注射28d紫锥菊提取物对大菱鲆头肾中 Lysozyme基因相对表达量的影响显著(P＜0.05),高剂量组与中剂量组与其它两个剂量组差异显著(P＜0.05),低剂量组与空白对照组差异不显著(P＞0.05)。

  

图4 注射28d头肾中Lysozyme基因相对表达量Fig.4 The relative expression of lysozyme gene in head kidney after injection in 28d

2.3 肌肉注射紫锥菊提取物对大菱鲆头肾中 C3补体基因相对表达量的影响

如图5所示,注射28d紫锥菊提取物对大菱鲆头肾中C3补体基因相对表达量的影响极显著(P＜0.01),高剂量组与其它 3个剂量组差异极显著(P＜0.01),中剂量组和低剂量组与空白对照组差异不显著(P＞0.05)。

情，但是面对大量不认识的词汇和短语，往往找不到有效的方法，寻找不到规律，显得有点束手无策。相对而言，大二年级的学生由于在大一期间，有了一定的积累，同时为着备考英语四、六级做准备，词汇量有了一定的增长，但是词汇混淆度比较高，如何准确区分词汇的差别，以及部分单词出现记了又遗忘的现象。大三大四的学生由于通过四级考试后，没有保持继续学习的状态，英语水平反而更加下降，在词汇和词汇丰富度上存在种种问题。词汇量少，词汇容易混淆始终是困扰大学生英语学习的通病问题。

  

图5 注射28d头肾中C3补体基因相对表达量Fig.5 Relative expression quantity of complement C3 gene in head kidney after injection in 28d

2.4 肌肉注射紫锥菊提取物对大菱鲆头肾中Transferrin基因相对表达量的影响

如图6所示,注射28d紫锥菊提取物对大菱鲆头肾中 Transferrin基因相对表达量的影响显著(P＜0.05),高剂量组与中剂量组与其它两个剂量组差异显著(P＜0.05),低剂量组与空白对照组差异不显著(P＞0.05)。

  

图6 注射28d头肾中Transferrin基因相对表达量Fig.6 The relative expression of transferrin gene in head kidney after injection in 28d

2.5 肌肉注射紫锥菊提取物对大菱鲆头肾中TGF-β1基因相对表达量的影响

如图7所示,注射28d紫锥菊提取物对大菱鲆头肾中TGF-β1基因相对表达量的影响极显著(P＜0.01),中剂量组与其它 3个剂量组差异极显著(P＜0.01),高剂量组和低剂量组与空白对照组差异不显著(P＞0.05)。

  

图7 注射28d头肾中TGF-β1基因相对表达量Fig.7 The relative expression of head kidney TGF-β1gene after injection in 28d

2.6 肌肉注射紫锥菊提取物对大菱鲆头肾中 IL-1h基因相对表达量的影响

如图8所示,注射28d紫锥菊提取物对大菱鲆头肾中 IL-1h基因相对表达量的影响极显著(P＜0.01),中剂量组与其它 3个剂量组差异极显著(P＜0.01),高剂量组和低剂量组与空白对照组差异不显著(P＞0.05)。

  

图8 注射28d头肾中IL-1h基因相对表达量Fig.8 The relative expression of IL-1h gene in 28d injection head kidney

3 讨论

斯沃琪集团一走，巴塞尔还要靠这些大品牌撑场面。Benjamin Clymer认为，很多大品牌还将继续参加巴塞尔表展，媒体、零售商和收藏家也还是会来。

3.1 肌肉注射紫锥菊提取物对大菱鲆头肾中Lysozyme基因相对表达量的影响

前期试验已证实,紫锥菊提取物能够提高大菱鲆的溶菌酶活力,本试验则在分子水平证实,紫锥菊提取物能提高大菱鲆头肾溶菌酶 mRNA表达量,注射28d后紫锥菊提取物对大菱鲆头肾中Lysozyme基因相对表达量的影响显著,高剂量组与中剂量组与其它两个剂量组差异显著,低剂量组与空白对照组差异不显著。说明在一定浓度内,紫锥菊提取物对大菱鲆头肾中Lysozyme基因相对表达量的影响随着浓度的提高而加强。研究表明,常用免疫增强剂黄芪多糖对仿刺参体腔细胞中Lysozyme基因相对表达量的影响显著(孙永欣等,2009),汤菊芬等(2011)研究黄芪多糖对吉富罗非色 C型溶菌酶基因表达量的影响也有类似现象。

紫锥菊作为水产动物中免疫增强剂已有报道,但多限于蛋白质水平检测,很少从分子水平上给与阐明,因此很多结论不够可靠。现已从贝类(Liu et al,2006)、虾(Sotelo-Mundo et al,2003)、海星(Bachali et al,2004)等多种海洋无脊椎动物中克隆出溶菌酶基因,这为开展水产无脊椎动物非特异性免疫力分子水平检测提供良好平台,也为证实免疫增强剂作用效果提供理论依据。本实验采用实时荧光定量 PCR对大菱鲆免疫基因 IgM、C3、IL-1、TGF、transferrin和lysozyme在空白对照组和免疫组大菱鲆在注射紫锥菊提取物28d后基因的相对表达量进行了分析。实验结果显示,紫锥菊提取物对大菱鲆头肾中的相关免疫因子基因的相对表达量有不同程度的促进作用。

3.2 肌肉注射紫锥菊提取物对大菱鲆头肾中 C3补体基因相对表达量的影响

补体系统是免疫系统的重要组成部分,参与多重免疫反应,是生物抵抗外界感染的第一道防线。大多数补体成分都是急性期反应蛋白,在适当的免疫刺激后补体水平表现出上调趋势。己有试验表明,当鲤鱼、虹蹲、斑点叉尾蛔、牙虾及斑马鱼等硬骨鱼受细菌处理后,体内的补体成分特别是补体成分3和补体因子B的表达水平显著升高(Steel et al,1994)。

上文主要总结了哈特利教授的《运动、体育休闲与法律》一书的诸多亮点，但这本书也不是完美无瑕的。笔者认为，它至少存在以下几点不足。

本研究拟建立330 MW亚临界直接空冷发电机组整体效率和冷端损失的物理模型，基于空冷岛换热面积变化的因素分析，设计和优化空冷岛的结构和性能参数，降低运行背压，提高机组整体效率。

本试验中,以紫锥菊提取物处理大菱鲆成体后,注射28d后紫锥菊提取物对大菱鲆头肾中C3补体基因相对表达量的影响极显著,高剂量组与其它3个剂量组差异极显著,中剂量组和低剂量组与空白对照组差异不显著。由此可以得出,低浓度紫锥菊提取物对大菱鲆头肾中C3补体基因相对表达量的影响有限。

3.3 肌肉注射紫锥菊提取物对大菱鲆头肾中Transferrin基因相对表达量的影响

转铁蛋白是脊椎动物体内重要的非特异免疫因子,对细菌的繁殖起抑制作用,是机体对抗细菌感染的重要因子(Liu et al,2003);也可以促进细胞的生长和增殖等(Oppenheimer,2001)。因此,转铁蛋白的功能可能十分广泛。

本试验将注射 28d紫锥菊提取物的大菱鲆头肾中Transferrin基因相对表达量做了相关分析,结果显示连续注射紫锥菊提取物 28d对大菱鲆头肾中Transferrin基因相对表达量的影响显著,高剂量组和中剂量组与其它两个剂量组差异显著,低剂量组与空白对照组差异不显著。说明低浓度的紫锥菊对Transferrin基因的表达影响甚微。

3.4 肌肉注射紫锥菊提取物对大菱鲆头肾中TGF-β1基因相对表达量的影响

动物体内多种细胞均可分泌非活性状态TGF-β1,活化后的T细胞或B细胞产生的TGF-β1比静止细胞明显增高,TGF-β1的活性很多,主要包括抑制免疫活性细胞的增值,对细胞表型的调节,抑制淋巴细胞的分化,抑制细胞因子的产生等,对机体的免疫功能起重要作用。

从对大菱鲆注射28d紫锥菊提取物TGF-β1基因的相对表达量可以看出,对大菱鲆头肾中IL-1h基因相对表达量的影响极显著,其中中剂量组基因相对表达量最高,而高剂量组基因相对表达量显著降低,但是高于空白对照组。经数据分析,低剂量组和高剂量组对IL-1h基因相对表达量的影响并不显著。

3.5 肌肉注射紫锥菊提取物对大菱鲆头肾中 IL-1h基因相对表达量的影响

从对大菱鲆注射28d紫锥菊提取物IL-1h的相对表达量可以看出,对大菱鲆头肾中IL-1h基因相对表达量的影响与对TGF-β1基因的相对表达量的影响变化趋势相类似,其中中剂量组基因相对表达量最高,而高剂量组和低剂量组对IL-1h基因相对表达量的影响并不显著。韩雯等(2014)利用皂角苷联合灭活疫苗免疫大菱鲆后对大菱鲆IL-1h基因表达量也有类似增强作用,说明紫锥菊提取物对大菱鲆头肾中IL-1h基因表达有显著的增强作用,目前影响机理尚不明确,需要做进一步研究。

4 结论

研究不同浓度紫锥菊提取物对大菱鲆头肾内非特异性免疫分子基因相对表达量的影响,本试验通过测定 Lysozyme、IL-1h、TGF-β1、Transferrin、C3补体等基因相对表达量试验结果表明,紫锥菊提取物对大菱鲆头肾内非特异性免疫分子基因相对表达量有一定促进作用,重新认证紫锥菊提取物能促进大菱鲆的非特异性免疫功能。

参 考 文 献

马爱军,雷霁霖,陈四清等,2002.大菱鲆产卵季节对卵子的生物学及生化特征的影响.海洋与湖沼,33(1):75—82

王高学,白 冰,崔 婧等,2006.灰树花多糖对鲫鱼免疫功能的影响.水产科学,25(1):9—12

任永林,2008.紫锥菊提取物对鲤生产性能和免疫功能的影响.雅安:四川农业大学硕士学位论文

庄 政,2008.嗜水气单胞菌亚单位成分卵黄抗体在鳗鲡养殖中应用.福州:福建农林大学硕士学位论文,10—11

汤菊芬,吴灶和,简纪常等,2011.注射黄芪多糖对吉富罗非鱼 c型溶菌酶基因表达量的影响.广东海洋大学学报,31(1):58—61

孙永欣,徐永平,汪婷婷等,2009.黄芪多糖对仿刺参体腔细胞中溶菌酶基因表达量的影响.水产科学,28(10):572—574

胡 兵,刘 军,侯永清等,2008.黄芪多糖对异育银鲫非特异性免疫力的影响.水利渔业,28(3):108—111

唐雪莲,付京花,李志华等,2012.紫锥菊提取物对彭泽鲫生长和抗氧化反应的影响.饲料工业,33(14):20—22

黄智慧,马爱军,2010.大菱鲆体表黏液细胞组化研究及高温胁迫对其类型和分布的影响.水产学报,34(5):719—725

韩 雯,王秀华,王玉娟等,2014.皂角苷对大菱鲆非特异免疫的增强作用.水产学报,38(7):999—1008

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雷霁霖,2005.海水鱼类养殖理论与技术.北京:中国农业出版社,321—322

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蔡中华,陈成勋,刑克智等,1998.四种中药对鲤鱼非特异性免疫功能的影响.天津农学院学报,5(2):31—34

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Bachali S,Bailly X,Jollès J et al,2004.The lysozyme of the starfish Asterias rubens.A paradigmatic type i lysozyme.European Journal of Biochemistry,271(2):237—242

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