胸腺素是一类小分子多肽，由Goldstein等[1]于1966年在胎牛胸腺蛋白中首次发现。根据蛋白等电点(PI)的不同，可以把胸腺素分成α、β、γ三个家族，其等电点分别为 PI＜5、5＜PI＜7、PI＞7[1-3]。其中胸腺素β是一段含有40～44个氨基酸且保守性很高的多肽，至今为止发现了15种，广泛存在于脊椎动物和无脊椎动物之中[4]。胸腺素β的功能很广，具有一个能与肌动蛋白结合的结构域(LKKTET)，与肌动蛋白结合后，使得肌动蛋白能以单体的形式存在于细胞内[3]。除此之外，胸腺素β4还有促进血管生成[5-6]、创伤愈合[7-8]、抑制炎症[9]、修复心肌损伤[10]、促进角膜修复[11]、调节肿瘤转移和细胞迁移[7,12]、参与机体免疫和抗菌[13-14]、降低体内活性氧[15]和促进毛囊生长[16]等作用。胸腺素β4的研究主要集中在癌症、血管修复、角膜修复和心肌损失修复等医学研究方面，在水生生物中的研究有机体免疫和抗菌、文昌鱼(Branchiostoma belcheri)的发育[17]、斑马鱼(Barchydanio rerio)的脑[18]和心脏[19]等，尚未见合浦珠母贝(Pinctada fucata)中的研究。

1.效益最高:在优化时以利润数值最大化为目标。在选择以效益最大化为目标时，通常情况下是以企业当前的利润为主要考虑因素，兼顾长远的效益。

合浦珠母贝又称马氏珠母贝，属于软体动物门、双壳纲、珍珠贝科，是中国用于海水珍珠人工培育的主要贝类。在珍珠培育过程中会出现育珠贝死亡率高、留核率低等问题。为了解决这些问题，在养殖过程中一般会对育珠贝进行术前处理和术后暂养。术前处理是通过促进育珠贝排精产卵或抑制性腺发育和降低生理机能使得其处于一个适合插核手术的状态，为珍珠囊发育提供空间和降低育珠贝对插核小片的拮抗作用[20]，而术后暂养同样是为了降低育珠贝对插核小片的排异能力，增加留核率[21]。虽然这些措施会明显降低死亡率和提高留核率，但如果能对育珠贝伤口修复的分子机制进行研究，了解伤口修复过程各种分子的变化及其所起的作用，且找到一些比较重要的基因并加以利用，使伤口恢复更快或珍珠囊形成更快，将对进一步降低死亡率和提高留核率有积极作用。胸腺素β4具有抑制炎症，促进创伤愈合，参与免疫反应等功能，研究其在合浦珠母贝伤口修复过程中所起的作用具有很大的意义。本文通过荧光定量实验对胸腺素β4在合浦珠母贝的不同组织和插核手术后(血细胞和伤口组织)不同的时间点进行表达分析，对其在伤口修复分子机制中所起到的作用进行初步研究，以丰富合浦珠母贝伤口修复分子机制的研究资料。另外，有报道[17]指出胸腺素β4在文昌鱼的胚胎中可能发挥了保护的作用，因此同时开展了胸腺素β4在合浦珠母贝的5个不同发育时期的表达分析，为进一步探讨其功能奠定基础。

自古以来，蓝宝石就有“帝王之石”之称。传说蓝宝石可让佩戴者免遭人妒忌，并可蒙受神灵垂爱，于是古代国王就在颈间配戴蓝宝石，作为避免受伤的强力防御物。19世纪，正是由于一颗被世人誉为“拥有它者必为王”的卡鲁大帝的护身蓝宝石，改变了拿破仑一世和爱妻约瑟芬的命运。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验于2016年12月在海南省陵水县新村热带水产研究开发中心进行。随机取10只合浦珠母贝[(47±1.25) mm，12月龄] 的性腺、消化盲囊、闭壳肌、鳃、外套膜、足、肠和血细胞用于基因克隆与各组织表达分析。合浦珠母贝不同发育时期的样品参照王珍珍等[22]的实验方法，在合浦珠母贝卵细胞受精后第8小时、第24小时、第14天、第20天和第24天取5个不同发育时期(担轮期、D型期、壳顶期、眼点期、变态期)的样品，每个时期收集3管，每管不少于500个幼虫[育苗时温度(27±3) ℃，盐度30]。取70只贝进行插核手术，但只插入小片不插入珠核，并于第0、第2、第4、第6、第12、第24和第48小时各取10只贝的血细胞(6 000 g离心5 min收集血细胞)和伤口组织(伤口周围2 mm)用于基因在插核手术后各小时血细胞和伤口组织上的表达分析。组织样品中加入Sample Protector for RNA/DNA (TaKaRa)后，置于液氮中保存。

1.2 总RNA提取和cDNA合成

用RNAiso Plus (TaKaRa)提取以上样品的总RNA，具体过程同说明书所述。用核酸微量定量仪NanoDrop-2000检测总RNA的浓度、纯度和A260/A280值。用M-MLV (TaKaRa)反转录酶进行反转录，合成cDNA链，用于cDNA序列扩增；用Prime-ScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser (TaKaRa)试剂盒得到cDNA链，用于实时定量PCR实验。

1.3 合浦珠母贝胸腺素β4基因验证

在合浦珠母贝转录组数据库中筛选出胸腺素β4序列。用Primer Premier 5设计引物Tβ4-1F(AAACCCATTACCGACCAAAGAAA)和 Tβ4-1R(TTGCTGGTTCACTCCACTGTCATAC)，以cDNA为模板进行PCR，反应总体系20 μL，内含引物各0.8 μL，cDNA模板1 μL。反应程序是94 ℃，3 min；94 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，32 个循环；72 ℃ 10 min。把目的片段进行胶回收(上海生工)，用pMDTM18-T (TaKaRa)克隆试剂盒进行连接，转化进DH5α (全式金)并挑取单克隆。菌液PCR筛选出阳性克隆并送至上海生工生物工程股份有限公司测序。

1.4 合浦珠母贝胸腺素β4基因生物信息学分析

BLASTX对基因序列进行注释；用ORF Finder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)预测开放阅读框；用BLASTN进行基因的相似性分析，下载其他物种的胸腺素序列用于进化树分析和多重序列比对；用SignalP 4.1 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)进行信号肽预测；用Ex-PASy的Protparam功能(http://web.expasy.org/protparam/)分析蛋白性质；TMpred (http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html)预测跨膜螺旋；跨膜结构域的预测用TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)；用 SWISSMODEL (http://swissmodel.expasy.org/)进行三维结构预测；用SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/smart/set_mode.cgi?GENOMIC=1)进行功能域预测；使用DNAstar进行蛋白的二级结构预测；运用PROSITE (http://prosite.expasy.org/)进行功能位点预测；磷酸化位点预测用Netphos 3.1 (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)；糖基化位点用NetNGlyc 1.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)预测；使用Clustal X和Texmaker进行多序列比对；用MEGA 5.0的邻位相连法(neighbor-joining，NJ)构建进化树。

1.5 实时荧光定量PCR

本研究使用SPSS 18.0软件进行统计学处理,计量资料以(±s)表示,若符合正态分布采用t检验,若不符合正态分布采用秩和检验,计数资料以率(%)表示,采用字2检验,等级资料采用秩和检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 合浦珠母贝胸腺素β4序列与生物信息学分析

  

图1 Pfthymosin β4基因cDNA序列展示加粗字体为起始密码子和终止密码子，下划线是“THY”特征模体，阴影部分为胸腺素β家族特征序列，方框表示磷酸化位点Fig.1 Exhibition of Pfthymosin β4 cDNAThe start codon and the stop codon are in bold. The underlined is the "THY" characteristic pattern, and the shadowed section is the thymosin β family signature sequence. The box represents the phosphorylation site.

验证片段的测序结果与合浦珠母贝转录组数据中得到的胸腺素β4序列相同，将其命名为Pfthymosin β4(图1)。基因核苷酸序列已提交到NCBI，获得的基因序列号为MF807225。Pf-thymosin β4 的 5'非编码区 (UTR) 41 bp，3'UTR 94 bp，开放阅读框126 bp，共编码41个氨基酸。Protparam预测得知Pfthymosin β4的蛋白理论分子量为4 781.43 u，理论等电点(PI)是6.19，由14种氨基酸组成，其中赖氨酸(24.4%)和谷氨酸(14.6%)占比较大，半衰期为30 h，不稳定系数为31.58。经TMHMM、SignalP 4.1、NetNGlyc 1.0和TM-pred预测，Pfthymosin β4没有跨膜结构域、信号肽、糖基化位点和跨膜螺旋区。Netphos 3.1预测发现基因有7个磷酸化位点(2个丝氨酸、5个苏氨酸)。DNAstar软件预测蛋白二级结构有3个a-螺旋，4个β-转角和无规则卷曲。蛋白三维结构预测模型如图4所示。利用SMART和PROSITE预测发现，Pfthymosin β4蛋白序列中的第7和第40个氨基酸之间是典型的“THY”特征模体，第18和第29个氨基酸之间(LKKTETQEKNPL)的氨基酸序列是胸腺素β家族的特征序列。

(2)Teachers should strengthen familiarization of students to the importance of English,tell students the position and role taken by English in the whole high school,so as to enhance the students'motivation on English learning.

2.2 胸腺素β4基因序列比对与进化分析

多重序列比对表明，胸腺素β的保守性非常高(图2)。从氨基酸序列来看，胸腺素β家族的特征序列(LKKTETQEKNPL)和MSDKPD序列的保守性高；而从物种方面看，与其他物种相似性达到了90%以上(表1)，相似性最高是眼斑雀鳝(Lepisosteus oculatus)、双团刺胸蛙(Nanorana yunnanensis)、白颊长臂猴(Nomascus leucogenys)、南极岩斑鳕鱼(Notothenia coriiceps)、花溪鳉(Kryptolebias marmoratus)、海葵(Exaiptasia pallida)，相似性为95%；而一致性达到80%以上，最高是一致性90%的海蜗牛(Aplysia californica)，其次是88%的海葵和花溪鳉。从NJ系统进化树(图3) 中可以看到，Pfthymosin β4先与长牡蛎(Crassostrea gigas)的thymosin β聚为一支，再与南极岩斑鳕鱼聚为一支，最后与陆生动物、两栖类动物聚为群组。

2.3 Pfthymosin β4的时空表达及其对插核手术和不同发育时期的响应

Pfthymosin β4在合浦珠母贝的血细胞中的表达量最高，其次是足和鳃，性腺、消化盲囊、闭壳肌、外套膜和肠表达量最低，没有显著差异(图5)。在不同发育阶段中Pfthymosin β4均有表达(图6)，担轮期、壳顶期和眼点期的相对表达量没有统计学上的差异，D型期与之相比下调了约40%，相对表达量在变态期时达到最高，是眼点期的2.2倍(相对表达量均用平均值±标准误表示，n=4)。

在插核手术后，血细胞的Pfthymosin β4相对表达量在第2、第4和第6小时持续升高，并在第6小时达到高峰后下降，第24小时回复正常水平，第48小时升高1倍(图7–A)；而伤口组织的相对表达量开始时稍有下调，到第6小时突然上调达到最高，第12小时稍有下调，第24小时回复正常，第48小时下调，相对表达量最低(图7–B)。

大港油田主体位于滨海新区和渤海新区，储油凹陷面积不足1 万平方千米，扣除水库、村庄、城镇、盐田卤池和工业用地等，具备油田征地条件的陆地面积不足4000 平方千米。如何实现与地方共同发展、协调发展和绿色发展是摆在油田企业面前的难题。

3 讨论

生物信息学分析显示所克隆的Pfthymosin β4含有“THY”特征模体和胸腺素β家族的特征序列，表明所获得基因为胸腺素β家族成员之一。“THY”是胸腺素β家族成员特有的特征模体；特征序列LKKTETQEKNPL是一段在胸腺素β4家族中高度保守的氨基酸序列，涉及与肌动蛋白的结合[23]。胸腺素β4与肌动蛋白结合是胸腺素β4发挥作用的一个重要过程。经预测Pfthymosin β4缺少跨膜结构域、信号肽、糖基化位点和跨膜螺旋区，是一个结构简单的小分子蛋白。Pfthymosin β4的不稳定系数为31.58，可以推测出Pfthymosin β4能稳定存在于水溶液中。多重序列比对结果显示，合浦珠母贝胸腺素β4与其他物种相比一致性在80%以上，且与海蜗牛的一致性更是达到90%，说明胸腺素β4是一个保守性很高的蛋白。基于Pfthymosin β4较高的保守性可推测胸腺素β4在合浦珠母贝体内发挥的功能可能与它在其他物种体内相似，具有促进伤口愈合、血管生成、参与机体抗菌和降低体内活性氧等功能。从进化树中得出，Pfthymosin β4先与长牡蛎的thymosin β聚为一支，再与南极岩斑鳕鱼聚为一支，最后与陆生动物、两栖类动物聚为群组，这个趋势与生物学分类相符合。在已报道的文献中存在着相似的结果[24-25]，其所研究的基因都先与亲缘相近的贝类聚为一支，然后再与鱼类、两栖类和陆生生物聚为一支，但是在合浦珠母贝的OAR基因构建的进化树中，其与贝类聚类后先与节肢动物聚合后再与鱼类聚合，最后再与两栖类和陆生生物聚为一支[26]。

本实验通过实时荧光定量发现Pfthymosin β4在血细胞表达量最高，其次是足与鳃，而性腺、消化盲囊、闭壳肌、外套膜和肠的相对表达量与血细胞相比相差很大，所以其低表达的原因可能是由于组织中存在少量的血细胞，也可能是上述组织的Pfthymosin β4表达量相对于血细胞低很多。对皱纹盘鲍 (Haliotis discus discus)[27]、中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)[28]、九孔鲍 (H.diversicolor supertexta)[29]等研究结果与本研究相似，血细胞在各组织中表达量最高；且在免疫刺激后对组织进行荧光定量PCR实验发现其在免疫刺激后上调，表明参与了机体免疫反应；研究人员对香港牡蛎 (C.hongkongensis)注射胸腺素β4和溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)的混合物后发现其具有加速清除溶藻弧菌的功能[15]。合浦珠母贝属于软体动物，只有先天免疫，缺乏特异性免疫，机体发挥免疫功能主要依赖血细胞，通过Pfthymosin β4在血细胞里高表达的现象和之前报道过的现象，可以推测胸腺素β4在合浦珠母贝中很可能也参与了免疫反应。

 

表1 进化树和多重序列比对所用物种Tab.1 Species used in phylogenetic trees and multiple sequences

  

登录号accession No.海葵 Exaiptasia pallida thymosin beta-12 88 95 KXJ22858.1花溪鰆 Kryptolebias marmoratus thymosin beta-12 88 95 XP_017290006.1南极岩斑鳕鱼 Notothenia coriiceps thymosin beta-like 83 95 XP_010773615.1智人 Homo sapiens TMSB4X 83 92 AAH83509.1白颊长臂猴 Nomascus leucogenys thymosin beta-4 85 95 XP_012356370.1双团刺胸蛙 Nanorana yunnanensis thymosin beta 4 85 95 ABQ12775.1绵羊 Ovis aries thymosin beta-4 83 92 XP_014959023.1剑尾鱼 Xiphophorus maculatus thymosin beta-4 85 92 XP_005812264.1眼斑雀鳝 Lepisosteus oculatus thymosin beta-4 83 95 XP_006637965.1海蜗牛 Aplysia californica thymosin beta 90 94 NP_001191437.1杂色鰆 Cyprinodon variegatus thymosin beta-4 85 90 XP_015247492.1褐家鼠 Rattus norvegicus thymosin beta-4 83 92 AAA42246.1灰短尾负鼠 Monodelphis domestica thymosin beta-4 83 92 XP_001364937.1野骆驼 Camelus ferus thymosin beta-4 83 92 XP_006195381.1短嘴鸦 Corvus brachyrhynchos thymosin beta-4 83 92 KFO55790.1原鸡 Gallus gallus thymosin beta-4 83 92 NP_001001315.1长牡蛎 Crassostrea gigas Thymosin beta 85 92 AKC01246.1斑马鱼 Danio rerio thymosin beta-4 80 95 NP_001124169.1牛 Bos taurus thymosin beta-4 80 92 DAA33518.1非洲爪蛙 Xenopus laevis thymosin beta-4 80 92 NP_001084321.1西部锦龟 Chrysemys picta bellii thymosin beta-4 80 92 XP_005287825.1布氏鼠耳蝠 Myotis brandtii thymosin beta-4 83 92 XP_014400899.1物种名species基因gene一致性/%identity相似性/%positive

[16]陈颖, 杨涛, 程波, 等. 胸腺素β4影响毛囊生长的研究[J]. 临床皮肤科杂志, 2011(8): 457-460.

  

图2 Pfthymosin β4与其他物种胸腺素β氨基酸序列的多重比对相似性用首行字母的大小表示，序列氨基酸数在右侧Fig.2 Multiple alignment of amino acid sequences of thymosin β from P.fucata and others speciesThe similarity is indicated by the size of the first line of letters and the number of amino acids on the right side of the sequence.

  

图3 基于Pfthymosin β4 氨基酸序列构建的NJ系统进化树Fig.3 NJ phylogenetic tree based on amino acid sequences of Pfthymosin β4

  

图4 Pfthymosin β4 基因蛋白三级结构的模型Fig.4 Protein tertiary structure model of Pfthymosin β4

在插核手术后，Pfthymosin β4在血细胞的相对表达量在第0～第6小时持续升高，并达到顶峰然后开始下降恢复到正常水平；而在伤口组织中相对表达量与在血细胞中相似，在第6小时上调达到最高。Bodendorf等[34]的研究证明，机体受到损伤后的伤口液里会存在大量的胸腺素β4，且在短时间内，细胞内的胸腺素β4会大量的减少。他推测胸腺素β4是转谷氨酰胺酶的底物，参与了胶原蛋白和纤维蛋白的交联，且因子Ⅺ Ⅱ会将胸腺素β4掺入到纤维蛋白的αC结构中。所以合浦珠母贝在受到创伤后的第0～第6小时相对表达量升高可能是因为血液和伤口组织在受到创伤后释放出了大量的胸腺素β4，导致细胞内的胸腺素β4减少。胸腺素β4的减少可能会引起细胞内与胸腺素β4结合的肌动蛋白单体和装配的肌动蛋白之间的平衡发生紊乱，导致了Pfthymosin β4的表达量升高，以恢复细胞内的胸腺素β4水平，维持肌动蛋白单体的平衡。另外，贝类的伤口修复包括发炎、细胞增殖和组织重塑3个过程[35]，伤口修复前期血细胞会清除伤口组织处受损的细胞，发生炎症，而胸腺素β4具有促进细胞迁移、细胞增殖、减低炎症等功能，所以Pfthymosin β4在插核手术后表达量升高可能是因为Pfthymosin β4增加了血细胞的迁移速度，使得血液中的血细胞数量增多且血细胞能更快地聚集在伤口处清除受损细胞，抑制或者防止过激的炎症。而且有学者研究发现，在香港牡蛎中注射重组的胸腺素β4后，血液中的血细胞在第6小时有所增加，而在第12小时达到最高，与空白组相比血液中增加了约1倍的血细胞，得出了胸腺素β4能增加香港牡蛎血液中的血细胞数量的结论[15]。

译文：Only those who are firm in their ideals and convictions will adopt an unequivocal approach towards major issues of principle, build “diamond-hard bodies” to withstand any corrosion.[2]463

  

图5 Pfthymosin β4基因在不同组织中的表达不同字母间表示差异显著(P＜0.05)，后图同此Fig.5 Relative expression level of Pfthymosin β4 in different tissues Significant different letters above vertical bars indicate significant difference (P＜0.05). The same case in the following figures.

  

图6 Pfthymosin β4基因在不同发育时期的表达Fig.6 Relative expression level of Pfthymosin β4 at different developmental stages

  

图7 Pfthymosin β4基因在手术处理后不同时间的表达A. 血细胞；B. 伤口组织Fig.7 Relative expression level of Pfthymosin β4 in different time after mantle-translate operation A. hemolymph; B. wound tissue

参考文献：

8月份的影响系统除了前文所述的台风和副高以外,我们还需要关注冷空气的影响,8月下旬开始冷空气逐渐活跃,有2次暴雨与之有关。

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用胸腺素β4的Tβ4-1F和Tβ4-1R引物，以合浦珠母贝的18S [18S-F(GAGAAACGGCTAC CACATCC)、18S-R(CACCAGACTTGCCCTCC AA)]作为内参基因，进行实时qPCR。按照TaK-aRa的SYBR Premix Ex TaqTM Kit (Perfect Real Time)说明书配制反应体系，反应程序是95 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s，53 ℃ 15 s，68 ℃ 20 s，40 个循环。每个样品3次重复，每次设置3个复孔。实验数据使用△CT法(2–△△CT)进行分析，最后用SPSS Statistic 17.0进行数据统计分析。

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在合浦珠母贝各个发育时期实时定量的结果中发现，Pfthymosin β4在担轮期、壳顶期和眼点期之间的表达量无明显变化，与之相比D型期发生了下调，而变态期突然上调2.23倍。变态期是贝类幼苗发育的关键时期，在这个时期幼苗的生活习性会发生改变，从浮游生活转为附着生活。贝类附着变态过程受到物理因子、化学因子和生物因子的影响。其中蛋白激酶属于能影响贝类附着变态的一种影响因子，蛋白激酶A和C通过打开离子通道，使细胞发生去极化，使得幼虫对外界诱导物的敏感性增强，从而参与幼苗变态过程中的形态发生途径和调控途径[30-31]。对于胸腺素β4与蛋白激酶A和C的关系暂时还未见有报道，但是有人报道过胸腺素β4能增强蛋白激酶B的活性和促进其磷酸化[32-33]，而蛋白激酶家族成员存在着一段相似的约270个氨基酸构成的催化结构域，所以胸腺素β4也可能存在着增强蛋白激酶A和C的活性和促使其磷酸化的能力，从而参与幼苗的变态附着。

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渠道设计流量1.08～0.32m3/s。设计基本地震加速度值0.10g，对应场地的抗震设防烈度为7°，渠道沿线为中软场地土，土层经验等效剪切波速Vs在140～250m/s之间，场地为Ⅲ类场地，该场地为一般场地［1］。

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董登新指出，其实大多数公司停牌的理由都是一样的：拟筹划重大事项。其实，股民也心知肚明，其目的就是躲避股灾，不过后来复牌仍躲不过“补跌”，因为股价变动是有比价效应的。

中国进入新时代，对党建工作也提出了新要求，为了贯彻习近平总书记“组织引导老同志讲好中国故事、弘扬中国精神、传播中国好声音”重要讲话精神，长沙市雨花军队离休退休干部休养所党委发挥军队离退休党员独特的政治、经验、学术优势，以所离退休党员为骨干成立了社会公益组织“老首长”工作室，打造群众宣传思想平台，为党和人民事业增添正能量。

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由此可见，无论是国外还是国内，高辍学率与低完成率已然成为MOOC发展中的突出现象，其中平台使用麻烦、学习支持服务不够完善、学习过程枯燥是主要原因，学生更愿意把大部分课余时间花在感兴趣的事情上，例如微信、QQ以及手机上。如何增强学习平台的粘性，优化学生的学习体验，使学生自主、有效地开展学习活动，提高学习质量，也就成为现代教育改革中要解决的一个难题。

如乐善秦腔表演中的秦剧《下河东·赶驾》中赵匡胤的大段唱腔：“河东城困住了赵王太祖，把一个真天子昼夜巡营，黄金铠每日里将王困定，可怜王黄骠马未解鞍笼，王登基二十载干戈未尽，手提上盘龙棍东打西征，五王八侯都丧命，朝廊里无人来领兵，——在河东王哭的珠泪倾，是何人又来统领兵。”这段唱词不仅反映了宋朝重文轻武的事实，这还唱出了天子因错用人，致使先行丧命，而朝中无人挂帅，自己亲自领兵昼夜巡营的痛苦心情。

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