1 引 言

锌离子(Zn2+)是生命体系内含量位居第二的金属离子，在激素分泌、神经传导、细胞分裂和生长、基因表达、酶活性、核酸和蛋白质的合成等生命过程中发挥着重要的作用[1-4]，因此Zn2+代谢失常会影响人体的生长发育和多种疾病的发生[5-6]，如癫痫症、脑缺血、白内障、夜盲症、老年痴呆症等。另外，伴随着金属锌在机械制造、合金制造、电池电极和电镀防腐等领域广泛应用，大量的锌以Zn2+形式进入环境，成为污染离子[7-8]。因此，快速、高效预警Zn2+的研究对医学、化学、生物学、农学和环境学领域具有重要的研究意义。

随着课程改革的不断深入，广大小学语文教师越来越意识到第一课时阅读教学的重要性。然而，怎样才能提高第一课时阅读教学的效率呢？这一问题已经成为小学语文界关注的热点。笔者现结合多年的阅读教学实践，谈谈自己的几点做法。

目前，对金属离子的检测方法有原子吸收光谱法、质谱法、比色法、电化学法、色谱法和荧光探针法等[9-12]，其中荧光探针法由于高灵敏度、高选择性、简便快捷、开-关可调和原位检测等优点，广泛应用于分子和离子的检测。近年来，报道了许多Zn2+荧光探针，如喹啉类、苯并咪唑类、罗丹明类、蒽类等[13-17]。然而，尽管有些Zn2+荧光探针性能优良，但合成步骤复杂、水溶性较差、具有一定的毒性，限制了它的实际应用。

席夫碱类化合物易与金属离子配位，常用作设计金属离子探针。其中，酰腙类席夫碱化合物比酰肼类化合物螯合能力强、毒性低、抗菌和抗病毒，具有一定的生物活性，深受医学界、生物化学和药物化学界的重视[18]。另外，酰腙类荧光探针由于结构中含有亚胺结构，在激发态时—CN—发生异构化导致探针无荧光或显示较弱的荧光，当与特定金属离子配位后，—CN—键得到固定刚性增大，荧光会大大增强，有利于对特定金属离子的检测，因此应用酰腙类化合物的亚氨基衍生各种官能团，利用其多种配位模式去选择性地结合金属离子，可以达到对目标离子检测的目的[19-20]。本文在对氨基苯甲酰肼的两侧衍生了荧光团丹磺酰氯和螯合基团2-羟基-1-萘醛，合成了基于丹磺酰胺荧光基团的酰腙类Zn2+荧光探针HM，详细研究了其对Zn2+的识别过程。

隐匿阴茎病理解剖学改变主要为阴茎皮肤和皮下筋膜组织的发育异常[4]。阴茎皮下筋膜组织中纤维条索的形成和筋膜纤维脂肪变性，使筋膜组织僵硬，缺乏弹性，进而固缩阴茎体。另一个病理改变是阴茎皮肤发育异常，包括阴茎皮肤与阴茎体的附着不良，以及阴茎皮肤的不对称分布。包皮口狭窄环是内板和外板的分界线，隐匿阴茎患者狭窄环距离阴茎根部近，导致内板多、外板少的不对称状态。部分患者合并有蹼状阴茎，进而使得阴茎皮肤背侧多于腹侧。具体病变学特点如图4所示。

2 实 验

2.1 主要试剂与仪器

Find five peanuts（花生），nine sunflower seeds（葵瓜子），nine pine nuts（松子），and four walnuts（核桃）.They are healthy to eat.

仪器：HPLC-Q-Tof MS 型质谱仪、Varian INOVA-400MHz核磁共振仪、Elementar varioEL Ⅲ元素分析仪、HP8453紫外-可见光谱仪、JASCO FP-6500荧光光谱仪、HPLC-Q-Tof MS 型质谱仪。

2.2 Zn2+荧光探针HM的合成

将荧光探针HM配制成1.0×10-3 mol/L的DMF溶液，金属离子配制成2.0×10-2 mol/L的水溶液，用于光谱测试的溶液根据需求由上述高浓度溶液稀释得到，探针HM的稀释溶剂为DMF/H2O(9∶1，v/v)的混合溶剂、金属离子的稀释溶剂为水溶液。

图1 荧光探针HM的合成示意图

Fig.1 Synthetic route of fluorescent probe HM

Zn2+荧光探针HM的合成：在甲醇溶液中，将中间产物A3与2-羟基-1-萘醛在冰醋酸催化下反应24 h，冷却、除去溶剂后得到的产品为黄色粉末，产率为82%。产品的ESI-MS质谱如图2所示。从图中可以观察到2个主峰，分别为m/z=537.2归属于 (HM-H)-，m/z=573.0归属于(HM+Cl)-；元素分析计算值：C，66.90%；H，4.87%；N，10.40%；实验值：C，66.92%；H，4.86%；N，10.36%。 1H NMR谱(d6-DMSO)如图3所示，从指认结果得出谱图信息与探针HM的结构相符。

图2 荧光探针HM的ESI-MS谱图

Fig.2 ESI-MS of probe molecular HM

图3 荧光探针HM的1H NMR谱图(d6-DMSO)

Fig.3 1H NMR spectrum of fluorescent probe HM in a solution of d6-DMSO

2.3 光谱测试

2.3.1 配制溶液

锌离子荧光探针HM的合成路线见图1。以对氨基苯甲酸为原料依次进行酯化、酰化、肼解，最后与2-羟基-1-萘醛进行席夫碱反应得到。中间产物A1、A2和A3的合成方法见前期工作[21]。

荧光光谱测试：移取2 mL探针HM溶液(50 μmol/L)加入到比色皿中，用Zn(NO3)2水溶液滴定，直至平衡，用波长396 nm的光激发，测定400～750 nm范围内的荧光光谱。

2.3.2 光谱测试

其中，A0 是探针HM的吸光度值，A是在探针HM中加入一定量的Zn2+后的吸光度值，Al 是在探针HM中加入过量Zn2+的吸光度值，n为加入Zn2+的倍数，K为平衡常数。线性拟合的相关度R为0.998，平衡常数K=4.05×106L·mol-1。

“母肥儿壮”从干奶期（头胎牛怀孕后期）产前60天开始，母牛日粮中的能量、蛋白、微量元素和维生素配比，应平衡避免产出弱犊。炎热潮湿暑期奶牛饲养过程中，尽量避免应激的发生，要与产奶牛一样对待，排风扇、淋浴一样不能少。规范的管理和满足怀孕母牛的营养需要，可提高改善奶牛初乳质量，结合良好的初乳饲喂规程，能有效降低犊牛腹泻的发病率。

作为深度学习在计算机视觉领域应用的关键技术，卷积神经网络是通过设计仿生结构来模拟大脑皮层的人工神经网络，可实现多层网络结构的训练学习。同传统的图像处理算法相比较，卷积神经网络可以利用局部感受野，获得自主学习能力，以应对大规模图像处理数据，同时权值共享和池化函数设计减少了图像特征点的维数，降低了参数调整的复杂度，稀疏连接提高了网络结构的稳定性，最终产生用于分类的高级语义特征，因此被广泛应用于目标检测、图像分类领域。

3 结果与讨论

3.1 HM-Zn2+的电喷雾质谱分析

在实验室色谱条件下，取混合对照品溶液与心肌组织样品溶液进样分析，心肌组织色谱图中各目标物质峰形良好，未知物质峰与目标峰分离度良好，各物质峰纯度扫描其纯度因子均在995.000以上，说明各目标物质峰专属性良好，心肌组织中其他未知物质对目标物质检测无干扰。前期预实验发现，由于部分心肌样品中，肌酸在该色谱条件下的色谱柱中几乎无保留，在前面溶剂峰处出峰，与其他未知峰分不开，因此，该项研究中未将肌酸纳入考察范围。混合对照品溶液与心肌组织样品的典型谱图如图1所示。

图4 HM-Zn2+的ESI-MS质谱

Fig.4 ESI-MS of HM in the presence of Zn2+

将上述2个峰值用Isopro3.0 program软件进行模拟，可以看出实验结果与理论值相吻合，说明荧光探针HM与Zn2+以1∶1的模式配位，并且形成的配合物HM-Zn能够在溶液中稳定存在。

3.2 紫外光谱

图5 向探针HM(20 μmol/L)中加入Zn2+的紫外滴定曲线

Fig.5 Absorption spectra of HM (20 μmol/L) upon addition of increasing amounts of Zn2+ in DMF/H2O (9∶1, v/v) solution

图5为向探针HM(20 μmol/L)的DMF/H2O(9∶1,v/v)溶液中加入Zn(NO3)2后的紫外滴定光谱图。从图中可以看出，探针HM在386 nm处出现2-羟基-1-萘醛的特征吸收峰，当加入Zn2+后386 nm处的吸收峰逐渐减弱，这主要是由于2-羟基-1-萘醛产生π-π*跃迁的结果。而且由于探针HM与Zn2+结合后形成新的配合物，产生的由金属锌到HM的电荷跃迁，在420 nm处出现了新的吸收峰，并且强度逐渐增大，直至达到平衡，等吸收点为396 nm。

为进一步验证HM与Zn2+的配位比例做了Job’s plot实验，保持HM和Zn2+总浓度为20 μmol/L，在420 nm处测定不同[HM]/[Zn2+]比值的吸收强度，如图6所示。从图中可以看出[HM]/[HM+Zn2+]值为0.5时吸收强度最大，说明HM与Zn2+的配位比例为1∶1，与电喷雾质谱数据结果一致(图4)。利用紫外吸收峰396 nm处吸光度值进行Benesi-Hildebrand数据拟合，计算平衡常数，如图7所示，具体过程如下：

(1)

紫外光谱测试：移取2 mL探针HM溶液(20 μmol/L)加入到比色皿中，然后向其中加入特定浓度Zn(NO3)2水溶液，直至平衡，测定300～500 nm范围内的紫外-可见吸收光谱。

向荧光探针HM中加入等量Zn2+后测定的电喷雾质谱如图4所示。从图中可以清楚地观察到2个峰，m/z 601.285 8，归属于物种[HM+Zn]+；m/z 664.303 2，归属于物种

试剂：丹磺酰氯、2-羟基-1-萘醛、对氨基苯甲酸、氯化亚砜、三乙胺、水合肼、冰醋酸、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜(DMSO)、甲醇、乙醚、丙酮、无水硫酸钠、乙腈、乙酸乙酯、乙醇、去离子水。

图6 探针HM与Zn2+配位的Job’s plot 曲线

Fig.6 Job’s plot analysis of probe HM with Zn2+ in a solution of DMF/H2O (9∶1, v/v)

图7 探针HM与Zn2+配位的平衡常数线性拟合曲线

Fig.7 Linear fitting of equilibrium constants for the coordination of HM and Zn2+. λex=396 nm.

3.3 荧光光谱分析

探针HM对Zn2+识别的荧光滴定曲线如图8所示，以396 nm为激发波长，发现荧光探针HM (50 μmol/L) 在发射峰为510 nm处有弱荧光，当向探针HM中引入Zn2+后在波长510 nm 处荧光强度逐渐增大，并且强度增大2.5倍，荧光量子产率为0.02(参比物为Ru(2,2-bpy)2(ClO4)2)。探针HM对Zn2+的识别过程主要是由于PET(光诱导电子转移机理)和CHEF(螯合荧光增强机理)共同作用的结果，当荧光探针HM的识别基团2-羟基-1-萘醛上的O、酰基O和席夫碱的N原子与Zn2+配位后不仅增大了荧光探针HM自身的平面刚性，同时导致识别基团供电子能力下降，进而抑制了识别基团2-羟基-1-萘醛向荧光基团丹磺酰胺的光诱导电子转移，被激发的电子直接跃迁返回基态，从而在510 nm处荧光强度显著增大。

图8 向探针HM中加入Zn2+的荧光滴定曲线，λex=396 nm。

Fig.8 Fluorescence spectral changes of HM with different concentrations of Zn2+ in aqueous solution. λex=396 nm.

借助量子化学软件gaussian09，采用DFT方法，B3LYP泛函，6-31G(d,p)基组，研究了Zn2+荧光探针HM的发光机制，结果如图9所示。在没有加入Zn2+之前，配位基团部分的HOMO 能级(-5.606 eV)恰好介于丹磺酰胺的HOMO能级(-5.608 eV)和LUMO(-1.559 eV)能级之间，使分子产生PET，荧光强度很弱；加入Zn2+后，配位基团部分的HOMO能级(-6.538 eV)降低，PET过程受阻，使丹磺酰胺LUMO能级的电子顺利回到HOMO能级产生荧光，实现了对Zn2+的识别。

在10 μmol/L探针HM的溶液中逐渐加入Zn2+，在最优化条件下，检测Zn2+的线性区间在0～20 μmol/L区间，如图10所示，线性回归方程为y=193.8530+67.5749x，线性相关系数为R=0.998，最低检测限达到1.0×10-5 mol/L。

图9 Zn2+荧光探针HM的PET过程

Fig.9 PET process of probe HM for detection of Zn2+

图10 Zn2+加入量与发射峰强度的线性拟合图

Fig.10 Linear fitting of the fluorescence intensity of HM with different addition amount of Zn2+. λ=510 nm.

3.4 选择性测试

荧光探针对金属离子的识别，其选择性尤为重要。图11为荧光探针HM对Zn2+选择性测试结果。从图中可以看出，在发射波长510 nm处探针HM仅对Zn2+具有特殊响应，而加入Li+、 Na+、K+、Ca2+、Cr3+、Mn2+、Ag+、Co2+、Hg2+、Ni2+、Pb2+和Cu2+等金属离子时荧光强度并没有增大，表明探针HM对Zn2+具有良好的选择性。原因可归结为在空间上探针HM对Zn2+具有合适的配位构型，并且对Zn2+螯合的平衡常数较大，在激发波长为396 nm时HM-Zn配合物具有较强的荧光发射，从而实现对Zn2+的高选择性识别。

图11 探针HM对Zn2+的选择性测试, λex=396 nm。

Fig.11 Fluorescence responses of HM upon addition of different metal ions(Li+， Na+， K+， Zn2+， Ca2+， Cr3+， Mn2+， Ag+， Co2+， Hg2+， Ni2+， Pb2+， Cu2+) in an aqueous solution of DMF/H2O(9∶1, v/v), λex=396 nm.

3.5 pH依赖测试

为了进一步确定荧光探针HM适用的pH范围，进行了pH依赖实验，如图12所示。从图中可以看出探针HM在pH 5.1～8.3之间能够很好地检测Zn2+，尤其在生理pH范围内对Zn2+的检测响应效果最佳，说明该探针有望在生理条件下使用，实用性较强。当pH<5.1和pH>8.3时，探针HM对Zn2+的响应效果较差，这是因为当pH<5.1时，—CN—基团与溶液中的质子结合，当pH>8.3时，Zn2+与溶液中的—OH生成沉淀，从而抑制了HM与Zn2+的配位。

图12 探针HM对Zn2+的识别的pH依赖测试

Fig.12 Fluorescence spectra of HM in an aqueous solution of DMF/H2O(9∶1, v/v) with different pH values

4 结 论

本文设计合成了一种新型酰腙类单三齿Zn2+荧光探针HM，该探针合成方法简单、 产率较高，能够与Zn2+形成1∶1的稳定配合物，平衡常数为4.05×106L·mol-1；在众多金属离子中，HM仅与Zn2+结合后在发射波长510 nm处荧光强度增强2.5倍。探针HM能够高选择性、高灵敏度地识别Zn2+，最低检测限达1.0×10-5 mol/L。

参 考 文 献：

[1] HANG L L, ZHANG M, MENG F L, et al.. ZNF217 expression correlates with the biological behavior of human ovarian cancer cells [J]. Chin. Germ. J. Clinic. Oncol., 2014, 13(11):539-544.

[2] TOSHIYUKI F, YAMASAKI S, NISHIDA K, et al.. Zinc homeostasis and signaling in health and diseases [J]. J. Biologic. Inorg. Chem., 2011, 16(7):1123-1134.

[3] YUSA K, YAMAMOTO O, IINO M, et al.. Eluted zinc ions stimulate osteoblast differentiation and mineralization in human dental pulp stem cells for bone tissue Engineering [J]. Archiv. Oral Bio., 2016, 71:162-169.

[4] A, MARET W. The biological inorganic chemistry of zinc ions [J]. Archiv. Biochem. Biophys., 2016, 611:3-19.

[5] FREDERICKSON C J, KOH J Y, BUSH A I. The neurobiology of zinc in health and disease [J]. Nat. Revi. Neurosci., 2005, 6(6):449-462.

[6] MILLETT C E, MUKHERJEE D, REIDER A, et al.. Peripheral zinc and neopterin concentrations are associated with mood severity in bipolar disorder in a gender-specific manner [J]. Psychiat. Res., 2017, 255:52-58.

[7] MOS B, KAPOSI K L, ROSE A L, et al.. Moderate ocean warming mitigates, but more extreme warming exacerbates the impacts of zinc from engineered nanoparticles on a marine larva [J]. Environment. Pollut., 2017, 228:190-200.

[8] CEGOWSKA A, SOKOOWSKA K, CYMERMAN A S, et al.. Copper and zinc in Elodea canadensis from rivers with various pollution levels [J]. Ecologic. Indicat., 2016, 67:156-165.

[9] NASCENTES C C, ARRUDA M A Z, NOGUEIRA A R A, et al.. Direct determination of Cu and Zn in fruit juices and bovine milk by thermospray flame furnace atomic absorption spectrometry [J]. Talanta, 2004, 64(4):912-917.

[10] RAO K S, BALAJI T, RAO T P, et al.. Determination of iron， cobalt， nickel， manganese， zinc， copper， cadmium and lead in human hair by inductively coupled plasma-atomic emission spectrometry [J]. Spectrochimica Acta Part B, 2002, 57(8):1333-1338．

[11] HABTE G, HWANG I M, KIM J S, et al.. Elemental profiling and geographical differentiation of Ethiopian coffee samples through inductively coupled plasma-optical emission spectroscopy(ICP-OES), ICP-mass spectrometry(ICP-MS) and direct mercury analyzer(DMA) [J]. Food Chem., 2016, 212:512-520．

[12] CHEN D M, GAO Z F, JIA J, et al.. A sensitive and selective electrochemical biosensor for detection of mercury(Ⅱ) ions based on nicking endonuclease-assisted signal amplification [J]. Sens. Actuators B: Chem., 2015, 210:290-296.

[13] GAN X P, SUN P, LI H, et al.. A conveniently prepared and hypersensitized small molecular fluorescent probe: rapidly detecting free zinc ion in HepG2 cells and Arabidopsis [J]. Biosens. Bioelectron., 2016, 86:393-397.

[14] DONG Z P, GUO Y P, TIAN X, et al.. Quinoline group based fluorescent sensor for detecting zinc ions in aqueous media and its logic gate behaviour [J]. J. Lumin., 2013, 134:635-639.

[15] NING P, JIANG J C, LI L C, et al.. A mitochondria-targeted ratiometric two-photon fluorescent probe for biological zinc ions detection [J]. Biosens. Bioelectron., 2016, 77:921-927.

[16] ZHANG N, TIAN X H, ZHENG J, et al.. A novel fluorescent probe based on the flexible dipicolylamine: recognizing zinc(Ⅱ) in aqueous solution and imaging in living cell [J]. Dyes and Pigments, 2016, 124:174-179.

[17] MEHTA P K, OH E T, PARK H J, et al.. Ratiometric fluorescent probe based on symmetric peptidyl receptor with picomolar affinity for Zn2+ in aqueous solution [J]. Sen. Actuators B: Chem., 2017, 245:996-1003.

[18] ROYZEN M, DURANDIN A, YOUNG V G, et al.. A sensitive probe for the detection of Zn(Ⅱ) by time-resolved fluorescence [J]. J. Am. Chem. Soc., 2006, 128:3854-3855.

[19] WU J, LIU W, ZHUANG X, et al.. Fluorescence turn on of coumarin derivatives by metal cations: a new signaling mechanism based on CN isomerization [J]. Org. Lett., 2007, 9(1):33-36.

[20] TIAN H, FENG Y L. Next step of photochromic switches? [J]. J. Mater. Chem., 2008, 18:1617-1622.

[21] WU H M, ZHOU P, WANG J, et al.. Dansyl-based fluorescent chemosensors for selective responses of Cr(Ⅲ) [J]. New J. Chem., 2009, 33:653-658.