0 引言

核糖体在高等植物的蛋白质合成中起着重要的作用，其主要由rRNA与蛋白质的复合物组成。rRNA根据沉降系数的不同划分，分别为 5S、5.8S、18S和28S rRNA，其中，5.8S、18S和28S rRNA共同组成 45S rRNA[1]。编码 rRNA的基因可分为 45S rDNA和5S rDNA。45S rDNA和5S rDNA均属于高度保守的重复序列家族，拷贝数可达几百个甚至是上千个[1]。在大多数植物中，5S rDNA与45S rDNA成簇分布于不同的染色体上。其中，45S rDNA通常位于核仁组织区，每个重复单元中由28S大亚基、18S小亚基、5.8S基因以及 2个外转录间隔区(External Transcribed Spacers，ETS)、2个内转录间隔区(Internal Transcribed Spacers，ITS)和1个大的非转录间隔区(Non-Transcribed Spacer，NTS)组成，而 NTS和 ETS共同组成基因间隔区(Intergenic Spacer，IGS)[1]。在不同的植物中，45S rDNA的重复单元的长度有所不同，约为7.8～18.5 kb，其拷贝数从几百到几万个不等。5S rDNA的结构类似于45S rDNA，是由一个高度保守的编码区和一个相对变异的非转录间隔区(Non-Transcribed Spacers，NTS)组成的串联重复序列。在不同的植物中，其拷贝数也有所差异，从1000～50 000个不等。

荧光原位杂交(Fluorescence In Situ Hybridization,FISH)技术能够快速且准确地将功能基因、重复序列等目标DNA序列定位在染色体上，FISH技术已经成为研究染色体结构、功能与进化的重要技术之一[2-3]。通过FISH技术将rDNA在染色体上进行定位，可以为携带rDNA位点的染色体提供有效的分子细胞遗传学标记(尤其是对于那些染色体较小且形态相近的物种)，并且对研究基因组间的关系、进化情况以及在基因组内对染色体类型进行区分具有重要意义[4]。D’Hont等利用5S rDNA和45S rDNA重复序列作为探针对甘蔗属割手密、大茎野生种和热带种进行FISH定位，准确地识别出甘蔗属的一套染色体组的2条不同的染色体，从而推测甘蔗属割手密的染色体基数为 x=8，而甘蔗属大茎野生种和热带种的染色体基数均为 x=10[5]。D’hont等和Jenkin等利用45S rDNA为探针，对染色体数目为2n=60的斑茅进行FISH定位，发现有6条染色体携带45S rDNA位点[6-7]。此外，Besse等利用45S rDNA为探针，对染色体数目为 2n=60的斑茅 E.arundinaceus进行 FISH定位，发现染色体数目为2n=20的蔗茅 E. elephantinus和 2n=40的蔗茅 E.procerus分别具有2个和4个45S rDNA位点[8]。因此，这一结果验证了蔗茅属的染色体基数为x=10。

现代甘蔗栽培品种的血缘主要来源于几个热带种和割手密，以血缘相似的亲本间的杂交选育种导致其遗传基础相对狭窄[9-10]，制约了甘蔗育种进程。蔗茅属(Erianthus)为甘蔗属复合体中重要的一员[11]，包括蔗茅、滇蔗茅和斑茅等。其中斑茅具有高生物量、生势旺盛、分蘖力强、宿根性好和耐涝、耐瘠、抗旱、抗病虫能力强等优异性状[6,12-15]。人们期待通过甘蔗与斑茅远缘杂交，将甘蔗近缘属野生种的优良基因渗透到甘蔗中，这样可以丰富甘蔗的遗传背景，因此，斑茅在甘蔗育种的利用备受甘蔗育种者青睐[16-17]。分子细胞遗传学研究表明，斑茅主要有3种不同的染色体数目，分别为2n=30，2n=40和 2n=60[18]。在中国，绝大多数蔗茅属的染色体数目为2n=40和2n=60[19]。其中，目前杂交利用主要是染色体数目为2n=60的斑茅。广州甘蔗糖业研究所海南甘蔗育种场的甘蔗育种家已成功地将斑茅血缘渐渗到甘蔗背景中，并获得一批高世代的材料，部分材料已开放作为全国甘蔗杂交制种基地的杂交亲本。本研究中的海南92-77和海南92-105为海南省当地的斑茅，是这些优异育种材料的原始亲本。因此，对这2个染色体数目为2n=60的斑茅开展分子细胞遗传学研究，探讨斑茅的rDNA的定位情况及其染色体基数具有重要意义。本研究中，我们利用5S rDNA和45S rDNA探针对斑茅海南92-77和海南92-105进行FISH定位，以期了解斑茅的rDNA的定位情况及其染色体基数。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料为斑茅海南 92-77 (2n=60)和海南92-105 (2n=60)，这些材料来自广州甘蔗糖业研究所海南甘蔗育种场。

1.2 方法

采用根尖分生区酶解去壁低渗法制备斑茅的体细胞染色体，质粒快速提取试剂盒(Promega，USA)提取5S rDNA和45S rDNA质粒。45S rDNA质粒由电子科技大学杨足君教授提供，45S rDNA探针是利用缺口平移法试剂盒(Roche，Germany)用生物素对45S rDNA质粒进行标记。5S rDNA探针是以斑茅基因组DNA为模板，利用PCR DIG Probe Synthesis Kit (Roche，Germany)进行PCR法对5S rDNA探针进行标记。其中扩增引物分别为上游引物：TCCTGGGAAGTCCTCGTGTTGCAT和下游引物：GGTCACCCATCCTAGTACTACTCT。然后用抗生物素的德克萨斯红(红色荧光)和抗地高辛的 FITC(绿色荧光)进行信号检测，最后用DAPI进行复染(蓝色荧光)。FISH 过程参考 D’Hont等的方法[5]，Carl Zeiss荧光显微镜观察。

以地高辛标记的5S rDNA序列和生物素标记的45S rDNA序列为探针，在染色体数目为2n=60的斑茅海南92-77和海南92-105的中期染色体和间期细胞核上进行FISH定位，结果表明在海南92-77和海南 92-105的中期和间期细胞中 5S rDNA和 45S rDNA均为6个定位位点，其中5S rDNA定位于染色体长臂上靠近着丝粒的位置(图1，绿色信号)，而45S rDNA则定位于染色体的短臂端部(图1，红色信号)。另外，我们注意到5S rDNA的6个信号位点大小差不多，但6个45S rDNA位点大小有所差异，即3个大的信号位点和3个小的信号位点，表明斑茅的5S rDNA的拷贝数相差无几，而45S rDNA的拷贝数则存在差异。

2 结果与讨论

楚墨回去以后，康芳便开始给静秋张罗对象了。静秋问康芳：“楚墨哪里不好？”康芳说：“哪里都不好。”静秋把康芳的话转给楚墨听，楚墨耸耸肩，说：“我不就抽了几根烟、喝了几瓶酒吗？”楚墨近乎弱智的乐观和自信让他失去了挽救这段感情的最佳时机。

如果瘙痒严重，外用药效果甚微者，需要口服药物，包括抗组胺药如氯雷他定、西替利嗪；严重影响睡眠时可以睡前口服扑尔敏或赛庚啶，也可以选择安全的中药；瘙痒剧烈不能缓解者，需到医院进行检查，由医生开具其他强效药物或使用其他治疗方法。

图1 5S rDNA和45S rDNA的FISH定位结果

在真核生物中，5S rDNA和45S rDNA均属于串联重复序列，并且它们在真核生物的进化过程十分保守。45S rDNA通常位于核仁组织区，与核仁的形成直接相关，它在染色体上的物理位置比较保守，通常位于染色体的次缢痕处[20-21]。与45S rDNA与核仁组织区相联系明显特征不同，5S rDNA在染色体上的位置分布具有多态性。在一些真核生物中，5S rDNA和45S rDNA分别位于一个染色体组中的2条不同的染色体上。在这些真核生物中，根据其具有多少个5S rDNA和45S rDNA位点数，就可以知悉其倍性。D’hont等利用这一规律，通过利用 5S rDNA和45S rDNA对甘蔗属热带种、大茎野生种和割手密进行FISH定位，发现割手密的45S rDNA位于靠近着丝粒区域，而热带种和大茎野生种的 45S rDNA位于靠近染色体端部区域[5]。在甘蔗属这3个种中，5S rDNA则均位于染色体的靠近着丝粒区域。值得注意的是，D’hont等发现有一个十四倍体割手密(2n=14x=112)的45S rDNA位点数为10个，而5S rDNA位点数则刚刚好为14个[5]。这可能是在甘蔗属进化过程中，由于45S rDNA位于染色体短臂的端部，可能染色体发生变异造成甘蔗属部分种的45S rDNA位点丢失。相比于45S rDNA，5S rDNA更适合于鉴定甘蔗近缘属野生种的倍性水平。然而，在另外一些真核生物中，5S rDNA和45S rDNA则是位于一个染色体组中几对不同的染色体上或者相同的染色体上。因此，无法仅凭rDNA位点数对其倍性进行判断。例如，在圆锥麦(Triticum turgidum)中，45S rDNA位点分别位于1B和6B染色体短臂上，而5S rDNA分别位于1A、1B、5A和5B染色体短臂上[22]。在普通小麦(Triticum aestivum)中，45S rDNA位点分别位于1A、1B、6B和5D染色体短臂上，而 5S rDNA位点位于 1A、1B、1D、5A、5B和 5D染色体短臂上[23]。这些植物通常是由二倍体物种杂交和加倍，并且经历了长期进化而形成的异源多倍体物种。在异源多倍体物种中，某一物种的染色体组中的rDNA基因表现较为强势，可能会抑制另一物种的rDNA基因表现较为弱势，导致较为弱势的rDNA拷贝数减少，甚至是较为弱势的rDNA位点消失[24]。

长期以来，由于甘蔗杂交育种多是以属内种间或品种间杂交为主，造成甘蔗的遗传基础日益狭窄，可能导致后代退化，产量和品质日渐降低[9,25]。开发利用甘蔗近缘属野生种种质资源，通过属间远缘杂交的方法，将甘蔗近缘属野生种的优异基因导入到甘蔗背景中，是拓宽甘蔗遗传基础的一种十分行之有效的手段。斑茅为甘蔗近缘属野生种植物，具有诸多可利用于甘蔗遗传改良育种的优异性状，而备受青睐[6,12-15,26]。然而，对于斑茅的分子细胞遗传学研究仍比较匮乏。在本研究中，通过对染色体数目为2n=60的斑茅进行5S rDNA和45S rDNA的FISH定位，发现海南92-77和海南92-105的5S rDNA和45S rDNA的位点数均为6个，其中，45S rDNA定位到斑茅的一套染色体组中的一条染色体的短臂的端部，而5S rDNA则定位于斑茅的一套染色体组中的一条染色体的长臂的着丝粒附近。值得注意的是，45S rDNA位点大小存在差异，表明同源染色体间的45S rDNA的拷贝数存在明显差异，而5S rDNA位点的大小则相差无几，表明同源染色体间的 5S rDNA的拷贝数差异不大。因此，可以确定斑茅的染色体基数为x=10，与Jenkin等报道的斑茅的45S rDNA的FISH定位结果一致[7]。本研究结果有助于甘蔗育种者了解斑茅等近缘属野生种质资源中的rDNA的定位情况和染色体基数的确定，并为其后代染色体研究提供可靠的实验资料，有利于加快斑茅等近缘属野生种质资源在甘蔗遗传改良育种中的杂交利用进程。

已经四千多年了，古老的铜绿山还在继续贡献出宝藏，这一方厚重的沃土，该见过了多少历史的沧桑，见惯了多少生命的无常，那些逝去的生命或许重于泰山，或者轻于鸿毛。铜绿山仍是山崖依旧，山上的铜草花，花开花落，岁岁年年，几千年不绝如缕。

3 结论

45S rDNA和5S rDNA在斑茅海南92-77和海南92-105的染色体上均有 6个信号位点，但其定位位置有所不同，其中，6个45S rDNA位点均位于染色体短臂的端部上，这6个45S rDNA位点的拷贝数存在差异；6个5S rDNA位点均位于染色体长臂的着丝粒附近，这6个5S rDNA位点的拷贝数差异不大。因此，染色体数目为60的斑茅染色体基数为x=10。

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