循环肿瘤核酸（ctNA）是肿瘤细胞释放到患者血液中的一种新型癌症标志物。ctNA检测作为一种实时无创的肿瘤诊断方法，最常用的方法是DNA测序和定量PCR。但是，DNA测序成本高、耗时长，PCR方法易受临床样本复杂环境影响而产生假阳性，需要娴熟的操作技能和繁琐的样本预处理，不可避免地阻碍其广泛的临床应用。最近，多伦多大学Shana O.Kelley课题组报道了一种基于组合探针的电化学方法直接检测患者血清中的突变基因[1]。 该成果发表于Angewandte Chemie杂志上。

 

该方法结合芯片和3D微电极技术[2－3]，利用PNA“夹”分子限制野生型核酸和突变序列的交叉反应，设计组合探针筛选所有可能的突变基因，高通量检测患者血清样本中的突变序列。组合PNA探针的设计如下：等摩尔A、C、G、T随机组合设计组合探针的可变位置，组合探针和突变基因的结合能力强于野生型基因，DNA“夹”进一步消除野生型基因的干扰。检测器的设计如下：在玻璃片上选择性修饰金接触垫和电引线，用铬、金和正性光刻胶层预涂。在金接触垫的顶部，沉积SU－8形成绝缘顶层，在其顶部打开15 μm大小的孔，与引线尖端连接。在开口处电沉积金形成非均质的微针状3D微电极。由于纳米结构能够增加检测灵敏度，该课题组利用Pd薄层包裹金结构形成纳米微电极（NME）。通过巯基固定组合PNA探针到检测器上，靶标结合和清洗后，靶标核酸与检测器表面的探针结合，[Ru（NH3）6]3+静电吸附到核酸的负电荷磷酸骨架上，被还原成[Ru（NH3）]62+，产生电化学信号，电极偏向于还原电位。 [Fe（CN）6]3－氧化[Ru（NH3）]62+回到[Ru（NH3）6]3+，进一步放大信号。该方法能够应用于检测非小细胞肺癌患者血清样本中的EGFR基因突变，检测范围涉及到40多种临床相关变化，包括缺失、插入、点突变。该方法甚至可以检测已知基因相同区域的任何未知突变，具有操作流程简单，样本损失少，更适用于小样本分析等优势。与定量PCR和DNA测序方法相比，缩短到30 min的分析时间使这种电化学检测方法在临床检验中更具竞争力。这种血清水平的ctNA检测在某个领域有潜力替代肿瘤组织活检，为测定药物反应和治疗效果提供了一种新方式。

参考文献

[1]Das J，Ivanov I，Safaei T S，et al.Combinatorial probes for high－throughput electrochemical analysis of circulating nucleic acids in clinical samples[J].Angewandte Chemie，2018，57：3711－3716.

[2]Das J，Ivanov I，Montermini L，et al.An electrochemical clamp assay for direct，rapid analysis of circulating nucleic acids in serum[J].Nature Chemistry，2015，7（7）：569－575.

[3]Das J，Ivanov I，Sargent E H，et al.DNA clutch probes for circulating tumor DNA analysis[J].Journal of the American Chemical Society，2016，138 （34）：11009 －11016.