0 引言

核酸酶是在核酸分解的第一步中，将聚核苷酸链的磷酸二酯键切断的酶。核酸酶属于水解酶，作用于磷酸二酯键的P－O位置[1]。不同来源的核酸酶，其专一性、作用方式都有所不同。根据底物糖基不同，核酸酶分为DNA核酸酶、RNA核酸酶和非特异糖基核酸酶[2]；根据核酸酶切割底物方式的不同，又可以分为外切酶和内切酶（如图1所示）。外切酶又可以分为5'－3'核酸外切酶和3'－5'核酸外切酶。生物体基因组稳定性很大程度上依赖修复机制的精确性，大多数修复机制都包括核酸酶切除过程。核酸酶水解脱氧核糖核苷酸和磷酸基团之间的磷酸二酯键，产生3'端磷酸基和5'端OH基。在错配修复、核酸切除修复、碱基切除修复和双链断裂修复中，DNA核酸酶参与切除损伤和错配碱基过程[3]。在复制过程中，聚合酶具有3'－5'核酸外切酶活性，能够校正新生合成的链，切除错配碱基[4]。

基于核酸酶辅助的信号放大技术，具有操作简便、反应条件温和、反应迅速、特异性高等优点，在生化分析中得到了迅速发展。基于核酸酶辅助的信号放大策略主要有两大类，一类由限制性内切酶辅助，该策略有序列依赖性；另一类由核酸外切酶辅助，该策略无序列依赖性。该文简单概述了限制性核酸内切酶和核酸外切酶，并分别介绍了两类基于核酸酶辅助的信号放大策略在分析检测中的研究进展。

  

图1 核酸酶分类示意图Fig.1 Schematic representation of the classification of nucleases

1 核酸内切酶及其在核酸传感器中的应用

核酸内切酶（Endonuclease）是可以水解DNA链中磷酸二酯键的一种酶。有些核酸内切酶仅水解5'磷酸二酯键，把磷酸基团留在3'位置上，称为5'－内切酶；而有些仅水解3'磷酸二酯键，把磷酸基团留在5'位置上，称为3'－内切酶。还有一些核酸内切酶对磷酸酯键一侧的碱基有专一要求。根据是否有特异识别的序列，将核酸内切酶分为两类：一类是非限制性内切酶，这类内切酶对切割序列没有特定要求，可以水解单链或双链DNA，产生单个或小片段的脱氧核糖核苷酸；另一类是限制性内切酶，这类内切酶可识别特定的DNA序列，并且从识别位点或位点附近切割双链DNA，产生一个切口。

1.1 限制性核酸内切酶的概念和来源

限制性核酸内切酶是一类可以识别DNA特异序列的特异性酶，并且可在识别位点或位点周围切割双链。它们可以将外来的DNA切断，限制异源DNA的侵入并使其失去活力，但又对自身的DNA没有损害作用，这样可以起到保护细胞原有的遗传信息的作用。因为这种特异性的切割作用在分子内部进行，故将其命名为限制性内切酶，简称限制酶。当外源DNA侵入细菌后，限制性内切酶可将其水解切成片段，从而限制了外源DNA在细菌细胞内的表达，而细菌本身的DNA由于在该特异核苷酸顺序处被甲基化酶修饰，不被水解，从而得到保护。

除了某些病毒以外，限制性内切酶只在原核生物中被发现，所有自由生存的细菌和古细菌似乎都能编码限制性内切酶。1968年，Meselson和Yuan首次从Ecoli.K中分离出限制酶，这种限制酶有特定的识别位点但没有特定的切割位点[5]。1970年，美国约翰霍布金斯大学的H.Smith于偶然中发现，流感嗜血杆菌能迅速降解外源的噬菌体DNA，其细胞提取液可降解Ecoli DNA，但不能降解自身DNA，从而找到HindⅡ限制性内切酶。最早被发现的限制性内切酶包括EcoRⅠ和EcoRⅡ（来源于大肠杆菌）以及HindⅡ和HindⅢ（来源于Haemophilus influenzae），这些酶可在特定位点切割DNA，从而产生可体外连接的基因片段[6]。

1.2 限制性核酸内切酶的分类和性质

因其亚基组成、酶切位置、识别位点、辅助因子等因素之间的差异，将限制性内切酶分为三大类：第一型（TypeⅠ）、第二型（TypeⅡ）及第三型（TypeⅢ）。

“呼……看样子他们没敢跟过来，你先在我家写作业。别怕，这种找事儿的人你越怕，他越欺负你。”王施凯拍拍赵明月的肩膀安慰道。

Ⅰ型限制性内切酶：既具有限制性又具有修饰酶活性。第一种限制性内切酶能够专一性识别核苷酸序列，结合于识别位点并且在识别位点附近的核苷酸上随机切割DNA中的双链[7]。这种限制性内切酶（如Eco K、Eco B等）因其不能产生确定的限制片段和明确的凝胶电泳条带，所以在基因工程和DNA重组技术中并没有很大的用处，无法用于分析DNA的结构。

（1）开设专业英语课程的愿望。有1 611人（84.9%）认为本科阶段有必要开设专业英语课程，286人（15.1%）认为没有必要开设，且不同院系、性别、专业课平均成绩的学生开设课程愿望的差异有显著性（P=8.698×10-9，P=4.236×10-8，P=3.626×10-4），而不同年级和不同任职情况的学生之间差异无显著性（P=0.263，P=0.227）。

Ⅱ型限制性内切酶：是一种分子量比较小的单体蛋白。这种限制性内切酶不仅能够专一性识别脱氧核苷酸序列，还能在该序列内特定位置切割DNA双链。第二种限制性内切酶（如EcoRⅠ、NotⅠ和HindⅢ）能够产生确定的限制片段和明确的凝胶电泳条带，可用于DNA分析和克隆。Ⅱ型限制性内切酶由一群来源和性状都不相同的蛋白组成，因而它们的氨基酸序列可能截然不同。这些酶很有可能是独立进化产生，而并非同一来源[8]。Ⅱ型限制性内切酶一般以同源二聚体的形式结合在DNA上，能够特异性识别对称序列[9]，少量Ⅱ型限制性内切酶（如BbvCⅠ）以异二聚体形式结合在DNA上，识别非对称序列。

Ⅲ型限制性内切酶：既具有限制性又具有修饰酶活性。这类限制性内切酶也能够专一性识别脱氧核苷酸序列，并且在识别序列附近的几个任意脱氧核苷酸对的特定位置上切割DNA中的双链[10]。因此，由第三类限制性内切酶切割所产生的一定长度DNA小片段，是具有各种单链的末端，不具备实用价值。

1.3 限制性核酸内切酶的作用

除了对DNA的检测外，RNA尤其是microRNA的检测也非常重要。Huang小组[23]设计了一种茎内不匹配的发夹探针，称为错配保护的长茎发夹探针（mLSHP），并将其应用于切割内切核酸酶（NEase）辅助的microRNA荧光生物传感，如图3所示。此传感器中，受益于高稳定茎环结构的特异性和亲和力，mLSHP可实现高选择性目标识别。此外，茎中的单碱基错配可以保护mLSHP免于不希望的茎侵入和NEase切割，由此对背景进行抑制。mLSHP还可以以受控和预测模式引入多级放大系统，以获得更高的灵敏度和更快的反应速率。探针设计的灵活性，过程控制的简单性和扩增模式的可扩展性使得智能生物传感器在基因诊断中具有进一步发展和更广泛应用的潜力。

1.4 基于核酸内切酶的信号放大传感技术

由于核酸内切酶可以识别特定的DNA序列，并且从识别位点或位点附近切割双链DNA，许多性能优越的生物传感器利用限制性内切酶这一特性而设计[15－19]。

Hu等[20]通过靶标诱导的链置换和核酸内切酶信号扩增，设计了一种简单、超灵敏和特异性的电化学生物传感器用于检测特定DNA序列。实验原理如图2所示。生物传感器由捕获探针（CP）和信号探针（SP）两组分组成。CP 通过 Au－S键修饰在金电极（GE）表面。二茂铁（Fc）修饰的SP通过与CP部分杂交而固定在GE表面上。在没有目标DNA（TD）的情况下，Fc远离电极表面并且只能获得微弱的法拉第电流。在TD存在下，TD部分取代SP与CP杂交，释放了SP的Fc末端，使Fc与电极表面碰撞并发生电子转移。同时，核酸内切酶N.BstNBI可以在形成识别位点后对DNA进行切割。CP被切断，释放出TD。游离的TD与另一个双链杂交并进行第二个切割循环。理论上，每个TD可以与许多CP进行杂交，引起酶切循环信号放大。因此，越来越多的Fc快速接近电极表面从而获得显著的电流。这种方法对DNA的检出限达到0.08 fmol/L。

  

图2 电化学生物传感器的示意图和测定原理[20]Fig.2 Schematic representation and assay principle of the electrochemical biosensor[20]

1967年我路过北京去大东北，只在崇文门火车站的水泥地睡了一夜，早上醒来脚背冻得肿出了鞋面。北京对于我几乎是陌生的。这一次，我踽踽独行到天亮，不记得是否遇见过行人。我静听脚步在空谷般的幽暗的胡同里踏出的响声，一点也不觉得孤单。我在这座城市有了许多师长，他们让我人生的前景充满了全新的色彩。

限制性核酸内切酶在基因研究中有许多作用。首先，可以利用限制性核酸内切酶确定DNA复制终点或起点：DNA复制开始后，将分离出来的DNA用限制性核酸内切酶处理，用电镜可观察到复制的起始位置[11]。同理，也可以确定RNA在DNA上的转录位置。其次，可以利用限制性核酸内切酶进行基因的甲基化研究：HpaⅡ酶和MspⅠ酶均识别并切割双链DNA分子中CCGC序列，前者的序列中C必须是未甲基化的，而后者的序列中C必须是甲基化的。利用这一对限制性内切酶，可以对基因的甲基化进行研究[12]。另外，DNA体外重组也可以利用限制性核酸内切酶：DNA体外重组是将不同来源的DNA片段进行共价连接。DNA体外连接主要依靠T4 DNA连接酶连接限制酶处理过的DNA片段[13]。最后，限制性核酸内切酶在基因分离中也能起到很好的作用：使用限制性核酸内切酶是基因分离的一个重大突破。限制酶将一定DNA序列切断成许多小片段，在某一小片段DNA中可能恰好保存了所需基因[14]。

  

图3 （A）mLSHP－NESA原理示意图 （B）mLSHP的功能区域[23]Fig.3 （A）Schematic for the principle of mLSHP－NESA.（B）Functional regions of mLSHP[23]

Yin等[24]设计了一种用于启动酶级联促聚合反应的集成 “生物学电路”，通过酶信号放大对miRNA进行高灵敏和高特异性的检测，并展示了其在生物样品中的实际应用。Miao等[25]报告了一种使用核酸内切酶信号放大的电化学方法，对miRNA进行超灵敏分析。

哈哈，雪人做好啦！咦，不对，好像还少了一点什么？哦，想到了，雪人头上还少了眼睛、鼻子、嘴巴。于是，我赶紧跑到家里拿了我的花瓣玩具当雪人的眼睛，一根胡萝卜当雪人的鼻子，还拿了爸爸钓鱼的草帽当雪人的帽子，妈妈洗碗的手套插上树枝成了雪人的手臂……大功告成，我做的雪娃娃真是越看越可爱。

  

图4 基于级联信号放大策略的腺苷检测电化学适体传感器示意图[26]Fig.4 Schematic illustration of electrochemical aptasensor for adenosine detection based on cascade signal amplification strategy[26]

重金属离子性质相对稳定，很难被生物降解，且毒性高，严重危害环境及生物的生存，检测意义重大。

中国教育学学科的发展从20世纪初的“引进来”开始，经过数代人的努力，教育学的中国化已经取得显著的成效。教育学学科理论的发展离不开我国的教育改革和教育学教材编写的推动，从翻译和介绍国外教育学著作，到编写具有中国特色的教育学教材，我们从来没有停止探索的脚步。2017年11月22日，围绕教育学教材编写和学科发展的问题，我们专门向郭文安先生求教。他从教育学的学科属性和发展、教材编写的性质和功能、《教育学》的理论基础与作用方式及其内在逻辑和完善空间等四个方面，提出我们应重视教育学教材的编写，积极推动教育学的学科发展。

  

图5 电化学生物传感器用于Hg2+检测的实验原理[27]Fig.5 Experimental principle of the electrochemical biosensor for Hg2+detection[27]

He等[28]首次尝试将自切割核酶（DNAzyme）与涉及切割底物延伸的聚合酶/内切核酸酶反应循环结合，开发了一种新型酶级联荧光核酶机器用于Cu2+的信号放大检测，如图6所示。在Cu2+存在下，Cu2+核酶链水解其底物链，产生的底物链片段充当引物触发Klenow片段聚合，形成完全互补的双链。Nb.BbvCI核酸内切酶对双链进行切割，从而形成新的复制位点。复制再生的完全互补双链DNA引发新一轮的切割、聚合和置换。最后，荧光染料SG插入DNA双螺旋中产生荧光增强。该方法对Cu2+的检测限达到了亚纳摩尔级。

Chen等[27]开发了一种基于亚甲基蓝（MB）和切割核酸内切酶（NEase）的新型信号放大方法用于Hg2+检测，如图5所示，发夹探针（PA）5'修饰巯基，3'修饰MB，NEase的识别序列被嵌入PA的环路部分。首先，PA通过Au－S键固定在金电极表面，因其3'MB产生较大的电信号。在存在Hg2+的情况下，PA与探针B通过形成稳定的THg2+－T结构杂交，从而打开环，形成NEase识别位点。PA被切割，MB标记的片段从Au电极表面解离。释放的探针B和Hg2+可以重新启动下一个循环，更多的电活性指示剂与电极表面分离，导致信号显著减小。在最佳条件下，该方法实现了0.087 nmol/L的检测限，并有很好的选择性和满意的回收率。

基于类似的原理，Zou等[21]通过核酸内切酶辅助的纳米粒子扩增，运用比色法检测DNA。不存在目标DNA时，金纳米颗粒发生聚沉；而存在目标时，金纳米颗粒不发生聚沉。通过金纳米颗粒是否聚沉而表现出不同的颜色来特异性检测目标DNA。此外，Xu等[22]将核酸内切酶辅助纳米粒子扩增与滚环扩增结合，实现双重放大检测DNA。

2 核酸外切酶概述及其在核酸传感器中的应用

  

图6 基于酶级联的荧光核酶机器的过程示意图[28]Fig.6 Schematic illustration of procedures for enzymatic cascade based fluorescent DNAzyme machines[28]

核酸外切酶（Exonuclease）是一类能从多核苷酸链的一端开始按顺序催化水解3、5－磷酸二酯键，降解核苷酸的酶。核酸外切酶水解的最终产物是单个的核苷酸 （目标物为DNA时水解生成dNTP，目标物为RNA时水解生成NTP）。核酸外切酶可以维护基因组完整，在DNA代谢途径、生成复制以及基因修复重组等方面起着重要作用[29－30]。按作用的特性差异，可以将核酸外切酶分为水解双链的核酸外切酶和水解单链的核酸外切酶。

2.1 水解双链的核酸外切酶

2.1.1 大肠杆菌核酸外切酶Ⅲ（ExoⅢ）

大肠杆菌核酸外切酶Ⅲ（ExoⅢ）可切割双链DNA凹进去的3端或3端的平末端，按照3'到5'的方向从3'－OH末端依次释放5'－单核苷酸，而其对单链DNA和3端突出的双链DNA无剪切活性[31－32]。ExoⅢ通过酶切活性使双链DNA分子产生单链区，可与Klenow酶和带放射性同位素的核苷酸一起制备出特异性的放射性探针[33－34]。ExoⅢ在70℃加热20 min即变性失活。

2.1.2 λ噬菌体核酸外切酶（λexo）

λ噬菌体核酸外切酶最初是从感染了λ噬菌体的大肠杆菌细胞中分离纯化出来的[35]。该酶无法降解3'－OH末端，但能催化双链DNA从5'－P末端逐步降解，释放出5'单核苷酸。λexo核酸外切酶主要的用途有两个：从双链DNA分子中移除5'突出末端，方便采用末端转移酶进行加尾操作；将双链DNA水解成单链DNA，供以双脱氧法对DNA序列进行分析检测时使用。

2.2 水解单链的核酸外切酶

2.2.1 大肠杆菌核酸外切酶I（exo I）

除了核酸外，生物活性小分子在生命过程中也起着重要作用，对其进行检测也很有意义。Shen等[26]基于靶标－适体结合引发的核酸内切酶辅助链置换DNA聚合和滚环扩增（RCA）策略，开发了用于腺苷检测的简单且高度敏感的无标记电化学适体传感器，如图4所示。首先，磁珠（MB）修饰的腺苷适配体与信使DNA（mDNA）杂交互补配对。存在腺苷时，由于靶向识别，mDNA被释放，激活自主DNA聚合/切刻机器，连续释放信号DNA。随后，信号DNA与修饰在电极上的捕获DNA杂交，触发RCA过程，形成长单链DNA，可负载大量电活性物质 Ru（NH3）63+。 因此，通过结合两个信号放大策略，实现了对腺苷的灵敏检测，检测限为0.032 nmol/L。

近年来，通过结合新技术和新方法发展了大量的信号放大检测方法，这些方法通过增加标记探针的数量或增强标记物的信号强度提高检测的灵敏度，而无需对靶分子进行直接扩增，因而在生物化学分析和医学临床检测中发挥了极大的作用。核酸外切酶没有碱基序列依赖性，可以将单链DNA或双链DNA中的单链逐步水解，易于发展为通用平台，用于DNA或生物分子、金属离子等的检测，具有明显的优势[38－42]。

大肠杆菌核酸外切酶I具有从3'→5'方向水解单链DNA的外切酶活性[36]。由于exo I不降解双链DNA，因此完成PCR反应后，可将其用于水解剩余的单链引物。经核酸外切酶I（exo I）和磷酸酶（如CIP或AP）处理后的PCR产物可直接用于测序。

2.2.2 核酸外切酶VII（exo VII）

核酸外切酶VII有两个亚基组成单位，分别是xse A和xse B基因的编码产物，exo VII能从5'或3'端降解单链状态的DNA分子，使其生成短的寡核苷酸片段。并且，exo VII是一种耐受性很高的核酸酶，它是唯一不需要Mg2+的活性酶。核酸外切酶VII的主要用途是回收插入到质粒载体上的cDNA片段，也可以用来测定基因组DNA中某些特殊的间隔序列和编码序列的位置[37]。

1.3 图像后处理 采用GE公司提供的后处理工作站的Functool 9.4软件进行后处理，进行相位校正、基线校正、ppm转换后获得1H-MRS中各代谢物在波谱线中的峰下面积。在1H-MRS的图像中，横坐标表示共振频率，单位为ppm，纵坐标表示信号强度。以肌酸(Cr)为参考标准，将其他化学物质峰下面积与Cr峰下面积相比，计算右侧基底节区的乙酰天门冬氨酸/Cr(NAA/Cr)、NAA/胆碱(NAA/Cho)、乳酸/Cr(Lac/Cr)比值。

2.3 基于核酸外切酶的信号放大技术在传感器中的应用

本来方玫去厂里没几个月，人还没混到多熟。再说，质检是按计件算工钱，谁陪着方玫去看病，谁的工钱就会变少。

Zuo小组使用发夹DNA分子信标作为信号探针，发展了一种核酸外切酶Ⅲ辅助的靶标循环信号放大技术用于DNA的高灵敏检测[43]，如图7所示。在分子信标的5'端标记CAL Fluor Red 610（FR610）荧光团，与5'端平齐的3'端中间位置标记淬灭基团BHQ，自杂交形成茎环结构后，荧光基团紧靠淬灭基团，其荧光被淬灭。当目标DNA存在时，分子信标被打开，形成具有3'平末端的双链结构。核酸外切酶Ⅲ沿双链的3'→5'方向逐步水解单核苷酸，并释放出荧光基团，荧光得到恢复。同时，被释放的目标DNA与另一个分子信标杂交，引起酶切循环信号放大。这种方法对DNA的检出限可达20 amol/L。

  

图7 基于核酸外切酶Ⅲ辅助的信号循环放大方法检测DNA的原理图[43]Fig.7 Schematic illustration of ExoⅢ－assisted signal amplification system for DNA detection[43]

Xiong等[44]基于双信号电化学比率方法和核酸外切酶III辅助目标回收扩增策略，开发了一种新型、简单和高选择性的电化学DNA生物传感器，用于灵敏检测目标DNA。该方法的检测限（4.16 fmol/L）远低于大多数已报道的电化学DNA生物传感器。此外，Shi等[45]通过整合无机－有机纳米复合材料的敏化效应和λ－exo核酸外切酶辅助靶回收，设计了一种双重信号放大策略，用于光电化学方法检测慢性粒细胞白血病（CML，b3a2型）的短DNA序列，检测限可达25.6 amol/L。

2）标准溶液浓度的不确定度。根据经验，由于稀释引起的不确定度很小，可忽略不计，故砷元素形态标准溶液配制的不确定度即为砷元素形态标准溶液的不确定度。

基于核酸外切酶的信号放大传感器也常用于对RNA进行检测。Wang等[46]利用T7核酸外切酶的特异性脱氧核糖核酸外切酶活性，提出了一种基于环状酶放大法（CEAM）的简单、灵敏、高选择性和无标记的microRNA生物传感器，如图8所示。首先，通过Au－S键将硫醇功能化的DNA探针组装到金纳米颗粒修饰的金电极表面，然后使探针DNA与目标miRNA杂交。随后，RNA/DNA双链体中的DNA被T7外切核酸酶消化，miRNA分子从电极表面释放并回到缓冲溶液中，释放的microRNA可以进一步与修饰在电极表面上的DNA探针杂交，在此基础上，实现了等温扩增循环。此方法实现了0.17 fmol/L的低检测限，且在区分单碱基错配的miRNA序列时表现出优异的特异性。而Huang等[47]使用核酸外切酶III进行信号放大对肿瘤细胞中的miRNA进行了检测，检测下限也达到了飞摩尔水平。

确定设防标准，收集小流域水文资料和实测资料，计算出行洪断面，预留沟道行洪宽度，确定沟道防洪治导线和生物砂堤具体位置。

  

图8 基于T7核酸外切酶辅助信号扩增的生物传感器制备和miRNA检测原理[46]Fig.8 Biosensor fabrication and miRNA detection principle based on T7 exonuclease assisted signal amplification[46]

  

图9 基于Exo T辅助目标循环扩增的电化学方法测定PSA的示意图[48]Fig.9 Illustration of the electrochemical approach for PSA assay based on Exo T－aid target recycling amplification[48]

蛋白质是基因表达的最终产物，与细胞代谢和调控息息相关。蛋白质表达异常引起人类疾病，因此，对蛋白质研究和分析具有非常重要的意义。Miao等[48]提出了一种基于核酸外切酶信号放大的超灵敏电化学适体传感器用于检测人血清中前列腺特异性抗原（PSA），如图9所示。在金工作电极的界面上构建了DNA四面体分子层，与末端修饰了氨基（NH2）的PSA适配体杂交。银纳米颗粒（AgNPs）可以附着在氨基上，在电化学检测中获得强氧化峰。然而，存在PSA时，PSA与其适体序列之间具有高亲和力，PSA将其适配体从双链DNA解离。而Exo T能够从3'到5'水解单链DNA，因此释放的适配体探针被切割并且释放出游离PSA进行适体识别和Exo T水解的新循环。通过这种扩增过程，大量适配体探针被消化，不能提供足够的NH2基团将AgNPs固定在电极表面。通过记录银氧化峰值的变化，可以对PSA进行定量检测。其检测限下降到0.11 pg/mL。Li等[49]将 DNA－Ag纳米团簇分子信标（AgMBs）应用于分析，并设计了基于核酸外切酶III信号放大的策略对转录因子 （Transcription Factors，TF）进行了测定。Yang等[50]引入RecJf核酸外切酶，构建了一种新颖且灵敏的电化学适配平台，用于检测乳腺癌生物标志物HER2。

本文拟分析英美澳三国共九家影响力较大的媒体对《战斗宣言》的编译（Baculinao 2016;Bodeen 2016;Conner 2016;The Guardian 2016;Hawken 2016;McDonell2016;Li2016;Ninemsn 2016;Taylor 2016），探究西媒运用了哪些叙事技巧，以期揭露西媒歪曲抹黑的伎俩，并为我国我军的外宣及相关翻译提供必要的借鉴。

另外，基于核酸外切酶的信号放大传感器也用于对腺苷的检测。Xu等报告了一种无标记的适体外切核酸酶III（Exo III）扩增比色适体传感器，用于高灵敏度和低成本检测腺苷[51]，如图10所示。该策略使用两种未标记的DNA发夹探针（HP1和 HP2），其中 HP1含有腺苷的适体，而HP2嵌入富含鸟嘌呤的序列（GRS）。在腺苷存在下，发夹HP1可与腺苷特异性结合并触发HP1发夹结构的展开。得到的腺苷－HP1复合物可以与HP2杂交，产生Exo III识别位点。Exo III辅助降解后，GRS从HP2释放，腺苷－HP1释放回溶液以结合另一个HP2，诱导循环扩增。经过多次循环后，释放的足够的GRS被诱导形成G－四联体，进一步催化TMB的氧化，产生颜色变化，最终反映在吸光度变化中。由于核酸外切酶的信号放大技术，检测下限达到17 nmol/L。该方法已成功应用于生物样品中腺苷的检测。

  

图10 基于G四联体的Exo III辅助信号扩增适体传感器用于比色检测腺苷的示意图[51]Fig.10 Schematic illustration of the G－quadruplex based Exo III－assisted signal amplification aptasensor for the colorimetric detection of adenosine[51]

重金属离子广泛存在于水、土壤和食物当中，然而其摄入直接损害人体健康，因此对重金属离子的监测极为重要。

基于核酸外切酶辅助目标循环和杂交链式反应（HCR）双信号放大策略，Bao等[52]开发了一种新型的电化学适体传感器用于Hg2+检测，如图11所示。Hg2+的存在诱导富含T的DNA通过THg2+－T部分折叠成双链结构，从而触发了Exo III的活性。Exo III水解含有多个T－Hg2+－T结构的双链DNA，而释放的Hg2+进行循环过程。在每个水解循环中，获得的水解产物将电极上的捕获DNA和辅助DNA连接起来，进行HCR过程并形成长的双链 DNA。 氧化还原指示剂[Ru（NH3）6]3+与双链静电结合并产生电化学信号。此双重信号放大策略显著提高了Hg2+的检测灵敏度，检出限达到0.12 pmol/L，并且可用于实际水样中Hg2+的灵敏检测。

3 结论与展望

  

图11 基于Exo III辅助目标循环和HCR双重扩增策略的电化学适体传感器用于检测Hg2+的示意图[52]Fig.11 Schematic diagram of electrochemical aptasensor for the detection of Hg2+based on Exo III－assisted target recycling and HCR dual amplification strategy[52]

综上所述，限制性核酸内切酶能识别特定DNA序列，并对其进行特异性切割，产生小的DNA片段。将限制性核酸内切酶用于分子生物学研究，可以确定DNA复制终点或起点以及RNA的转录位置、进行甲基化研究以及DNA体外重组和基因分离。而核酸外切酶能将DNA水解成单个核苷酸。基于限制性核酸内切酶和核酸外切酶的核酸传感器通过靶标循环实现信号放大，并且可以与DNA等温扩增、DNA自组装、功能化纳米材料信号放大等结合来超灵敏检测DNA、RNA、蛋白质、生物小分子、金属离子等目标物。因此，基于核酸酶的核酸传感器不仅可以实现对环境污染的监测，而且在基因诊断、生物医学研究和临床分析中具有广泛应用的潜力，为各种疾病的早期诊断提供了有效评估，在肿瘤的诊断和预后中具有潜在的应用价值。

参考文献

[1]贺淹才.基因工程概论 [M].北京：清华大学出版社，2008.

[2]Rangarajan E S，Shankar V.Sugar non－specific endonucleases[J].Fems Microbiology Reviews，2001，25 （5）：583－613.

[3]Marti T M，Fleck O.DNA repair nucleases[J].Cellular&Molecular Life Sciences Cmls，2004，61（3）：336－354.

[4]Shevelev I V，Hübscher U.The 3'－5'exonucleases[J].Nature Reviews Molecular Cell Biology，2002，3 （5）：364－376.

[5]Smith H O，Nathans D.A suggested nomenclature for bacterial host modification and restriction systems and their enzymes[J].Journal of Molecular Biology，1973，81（3）：419－423.

[6]Szybalski W，Blumenthal R M，Brooks J E，et al.Nomenclature for bacterial genes coding for class－II restriction endonucleases and modification methyltransferases[J].Gene，1988，74（1）：277－280.

[7]Bandyopadhyay P K，Studier F W，Hamilton D L，et al.Inhibition of the type I restriction－modification enzymes Eco B and Eco K by the gene 0.3 protein of bacteriophage T7[J].Journal of Molecular Biology，1985，182（4）：567－578.

[8]Koncz C，Kiss A，Venetianer P.Biochemical characterization of the restriction－modification system of bacillus sphaericus[J].European Journal of Biochemistry，1978，89（2）：523－529.

[9]Szybalski W，Kim S C，Hasan N，et al.Class－IIS restriction enzymes－ a review[J].Gene，1991，100（1）：13－26.

[10]Meisel A，Bickle T A，Krüger D H，et al.Type III restriction enzymes need two inversely oriented recognition sites for DNA cleavage[J].Nature，1992，355 （6359）：467－469.

[11]Gimbrone Jr M A，Fareed G C.Transformation of cultured human vascular endothelium by SV40 DNA[J].Cell，1976，9（4）：685－693.

[12]Singer J，Roberts－Ems J，Riggs A D.Methylation of mouse liver DNA studied by means of the restriction enzymes msp I and hpa II[J].Science，1979，203（4384）：1019－1021.

[13]Alberts B M，Frey L.T4 bacteriophage gene 32：a structural protein in the replication and recombination of DNA[J].Nature，1970，227（5265）：1313－1318.

[14]Jiang P，Zucker P，Atkinson M R，et al.Structure/function analysis of the PII signal transduction protein of Escherichia coli：genetic separation of interactions with protein receptors[J].Journal of Bacteriology，1997，179（13）：4342－4353.

[15]Zou B，Ma Y，Wu H，et al.Ultrasensitive DNA detection by cascade enzymatic signal amplification based on Afu flap endonuclease coupled with nicking endonuclease[J].Angewandte Chemie International Edition，2011，50（32）：7395－7398.

[16]Xu W，Xue X，Li T，et al.Ultrasensitive and selective colorimetric DNA detection by nicking endonuclease assisted nanoparticle amplification[J].Angewandte Chemie International Edition，2009，48（37）：6849－6852.

[17]Zhao J，Liu T，Fan Q，et al.A new strategy for a DNA assay based on a target－triggered isothermal exponential degradation reaction[J].Chemical Communications，2011，47（18）：5262－5264.

[18]Yang L，Tao Y，Yue G，et al.Highly selective and sensitive electrochemiluminescence biosensor for p53 DNA sequence based on nicking endonuclease assisted target recycling and hyperbranched rolling circle amplification[J].Analytical Chemistry，2016，88（10）：5097－5103.

[19]Xue L，Zhou X，Da X.Sensitive and homogeneous protein detection based on target－triggered aptamer hairpin switch and nicking enzyme assisted fluorescence signal amplification[J].Analytical Chemistry，2012，84 （8）：3507－3513.

[20]Hu Y，Xu X，Liu Q，et al.Ultrasensitive electrochemical biosensor for detection of DNA from Bacillus subtilis by coupling target－induced strand displacement and nicking endonuclease signal amplification[J].Analytical Chemistry，2014，86（17）：8785－8790.

[21]Zou B，Cao X，Wu H，et al.Sensitive and specific colorimetric DNA detection by invasive reaction coupled with nicking endonuclease－assisted nanoparticles amplification[J].Biosensors&Bioelectronics，2015，66：50－54.

[22]Xu W，Xie X，Li D，et al.Ultrasensitive colorimetric DNA detection using a combination of rolling circle amplification and nicking endonuclease－assisted nanoparticle amplification （NEANA）[J].Small，2012，8（12）：1846－1850.

[23]Huang R，Zhou X，Zhang C，et al.High－specific micro RNA detection based on dual－recycling cascade reaction and nicking endonuclease signal amplification[J].Sensors&Actuators B Chemical，2018，264（1）：169－176.

[24]Yin B C，Liu Y Q，Ye B C.Sensitive detection of microRNA in complex biological samples via enzymatic signal amplification using DNA polymerase coupled with nicking endonuclease[J].Analytical Chemistry，2013，85（23）：11487－11493.

[25]Miao P，Wang B，Yu Z，et al.Ultrasensitive electrochemical detection of microRNA with star trigon structure and endonuclease mediated signal amplification [J].Biosensors&Bioelectronics，2015，63：365－370.

[26]Shen J，Wang H，Li C，et al.Label－free electrochemical aptasensor for adenosine detection based on cascade signal amplification strategy[J].Biosensors&Bioelectronics，2017，90：356－362.

[27]Chen D M，Gao Z F，Jia J，et al.A sensitive and selective electrochemical biosensor for detection of mercury （II）ions based on nicking endonuclease－assisted signal amplification[J].Sensors&Actuators B Chemical，2015，210：290－296.

[28]He J L，Zhu S L，Wu P，et al.Enzymatic cascade based fluorescent DNAzyme machines for the ultrasensitive detection of Cu （II）ions[J].Biosensors&Bioelectronics，2014，60：112－117.

[29]Schmutte C，Marinescu R C，Sadoff M M，et al.Human exonuclease I interacts with the mismatch repair protein hMSH2[J].Cancer Research，1998，58（20）：4537－4542.

[30]Szankasi P，Smith G R.A role for exonuclease I from S.pombe in mutation avoidance and mismatch correction[J].Science，1995，267（5201）：1166－1169.

[31]Riley D，Weintraub H.Nucleosomal DNA is digested to repeats of 10 bases by exonuclease III[J].Cell，1978，13（2）：281－293.

[32]Sak B D，Eisenstark A，Touati D.Exonuclease III and the catalase hydroperoxidase II in escherichia coli are both regulated by the katF gene product[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1989，86（9）：3271－3275.

[33]Richardson C C，Lehman I R，Kornberg A.A deoxyribonucleic acid phosphatase－exonuclease from escherichia coli II.characterization of the exonuclease activity[J].Journal of Biological Chemistry，1964，239（239）：251－258.

[34]Linxweiler W，Hörz W.Sequence specificity of exonucleaseⅢ from E.coli[J].Nucleic Acids Research，1982，10（16）：4845－4859.

[35]Tolun G，Myers R S.A real－time DNase assay （ReDA）based on PicoGreen®fluorescence[J].Nucleic Acids Research，2003，31（18）：e111.

[36]Fijalkowska I J，Schaaper R M.Mutants in the Exo I motif of Escherichia coli dnaQ：defective proofreading and inviability due to error catastrophe[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1996，93（7）：2856－2861.

[37]Chase J W，Richardson C C.Exonuclease VII of Escherichia coli mechanism of action[J].Journal of Biological Chemistry，1974，249（14）：4553－4561.

[38]Tsourkas A，Behlke M A，Bao G.Structure－function relationships of shared－stem and conventional molecular beacons[J].Nucleic Acids Research，2002，30 （19）：4208－4215.

[39]Fan D，Zhu X，Zhai Q，et al.Polydopamine nanotubes as an effective fluorescent quencher for highly sensitive and selective detection of biomolecules assisted with exonuclease III amplification[J].Analytical Chemistry，2016，88（18）：9158–9165.

[40]He M Q，Wang K，Wang W J，et al.A smart DNA machine for carcinoembryonic antigen detection by exonuclease III－assisted target recycling and DNA walker cascade amplification[J].Analytical Chemistry，2017，89（17）：9292－9298.

[41]Taghdisi S M，Danesh N M，Ramezani M，et al.A novel colorimetric aptasensor for zearalenone detection based on nontarget－induced aptamer walker，gold nanoparticles and exonuclease－assisted recycling amplification[J].ACS Applied Materials&Interfaces，2018，10 （15）：12504－12509.

[42]Cui L，Li Y，Lu M，et al.An ultrasensitive electrochemical biosensor for polynucleotide kinase assay based on gold nanoparticle－mediated lambda exonuclease cleavage－induced signal amplification[J].Biosensors&Bioelectronics，2018，99：1－7.

[43]Zuo X，Xia F，Xiao Y，et al.Sensitive and selective amplified fluorescence DNA detection based on exonucleaseⅢ－aided target recycling[J].Journal of the American Chemical Society，2010，132（6）：1816－1818.

[44]Xiong E，Zhang X，Liu Y，et al.Ultrasensitive electrochemical detection of nucleic acids based on the dualsignaling electrochemical ratiometric method and exonucleaseⅢ－assisted target recycling amplification strategy[J].Analytical Chemistry，2015，87（14）：7291－7296.

[45]Shi X M，Fan G C，Shen Q，et al.Photoelectrochemical DNA biosensor based on dual signal amplification strategy integrating inorganic－organic nanocomposites sensitization with λ－exonuclease－assisted target recycling[J].ACS Applied Materials&Interfaces，2016，8（51）：35091－35098.

[46]Wang M，Fu Z，Li B，et al.One－step，ultrasensitive，and electrochemical assay of microRNAs based on T7 exonuclease assisted cyclic enzymatic amplification[J].Analytical Chemistry，2014，86（12）：5606－5610.

[47]Huang R C，Chiu W J，Li Y J，et al.Detection of micro RNA in tumor cells using exonucleaseⅢand graphene oxide－regulated signal amplification[J].ACS Applied Materials&Interfaces，2014，6（24）：21780－21787.

[48]Miao P，Jiang Y，Wang Y，et al.An electrochemical approach capable of prostate specific antigen assay in human serum based on exonuclease－aided target recycling amplification[J].Sensors&Actuators B Chemical，2018，257：1021－1026.

[49]Li B，Xu L，Chen Y，et al.Sensitive and label－free fluorescent detection of transcription factors based on DNAAg nanoclusters molecular beacons and exonucleaseⅢ－assisted signal amplification[J].Analytical Chemistry，2017，89（14）：7316－7323.

[50]Yang S，You M，Zhang F，et al.A sensitive electrochemical aptasensing platform based on exonuclease recycling amplification and host－guest recognition for detection of breast cancer biomarker HER2[J].Sensors&Actuators B Chemical，2018，258：796－802.

[51]Xu L，Shen X，Li B，et al.G－quadruplex based Exo III－assisted signal amplification aptasensor for the colorimetric detection of adenosine[J].Analytica Chimica Acta，2017，980：58－64.

[52]Bao T，Wen W，Zhang X，et al.An exonuclease－assisted amplification electrochemical aptasensor for Hg2+detection based on hybridization chain reaction[J].Biosensors&Bioelectronics，2015，70：318－323.