0 引言

光学显微成像是一门兼具悠久历史和发展前景的学科。自1590年荷兰籍学者Hans and Zacharias Janssen两父子发明出最早的光学复式显微镜至今四百余年来，光学显微成像技术经历了很大的进展。近年来，人类对微观世界求知欲的不断膨胀也加快了显微成像技术的发展步伐，使之成为生命科学等领域的重要研究手段[1]，科学家们在其分辨性能、工作效率及三维成像等方面不断改良优化[2]。而后，各种先进独特的显微技术被相继提出，如定量相位成像技术(quantitative phase imaging，QpI)[3-9]、太赫兹成像技术[10]以及结构光照明显微成像技术(structured illumination microscopy，SIM)[11]等。此类技术可以实现非侵入、无损伤、高效率、高质量的显微成像，在半导体材料表征、生物组织诊断、无损检测和安检等方面有着极其广泛的应用。如：生命科学领域对生物大分子、活体细胞以及组织切片等的无损成像和动力学行为分析[9,12]。

本文首先对高相干激光、低相干光、太赫兹波以及结构光这四类不同光源的无标记显微成像技术进行简介，叙述各类技术的适用范围、原理特征，介绍几类显微成像技术的背景及国内外研究现状，并做比较分析，然后讨论其优缺点及改良方向。最后展望了显微成像技术的发展动向。

1 各类显微成像技术的原理特征

传统显微成像技术是基于光透过观测物体时发生振幅和波长变化来实现的，生物细胞的无色透明特性致使传统显微成像技术无法对其进行成像。但其实透射细胞的光相较于通过环境液的光在相位上会发生一定的偏移(相移)，光透过环境介质和细胞不同位置时的相移情况也都是有差别的。QpI正是基于相位差异化分布的原理实现对生物细胞的清晰成像。QpI以高相干激光和低相干光为主要光源，是一种由传统光学显微技术演变而来的新兴成像手段，具有无损伤、无侵入、可动态检测等优势，应用前景广阔[3-12]。实现方式无需对样品进行标记、染色、固定等复杂处理程序，成像过程简单且处理速度快。获取的相移信息被电感耦合器件(CCD、CMOS)采集并转换为可接收处理的电信号最终由计算机运算成像。相位图携带有细胞微米甚至纳米量级尺度的振幅和相位等信息，由此可以获取物体的三维形态分布以及内部亚结构等信息[13,14]。获取的此类信息不仅能作为区分细胞种类和大小的依据，还能反映出细胞的亚结构形貌特征。近年来，QpI的飞速发展不断打破其应用领域的技术瓶颈，利用相位进行生物细胞形态检测、特征识别等研究已成为该领域一个极具生命力的发展方向。对形态学、生理学、细胞生物学、遗传学、分子生物学以及临床医学等生命科学研究工作的深入开展意义深远[15,16]。

太赫兹(1 THz=1×1012Hz)指处在红外和微波频率范围间的特殊电磁波[17-20]。其成像技术原理与QpI类似，但实现方式更简单。太赫兹波通过透射样品携带其强度及相位等信息，由探测器采集记录并传送至计算机，经相应的程序运算即可获得样品的图像信息。像源与太赫兹时域谱一一对应，通过对时域谱进行傅里叶变换又可得到每一点的太赫兹频率响应谱[21]。太赫兹特性优异，首先是穿透力强，透视成像方面兼具X射线和超声波成像的优点，且获取信息更全面。其次太赫兹光子能量仅为4.1 meV，相较于X射线低7-8 个数量级，非常适于生物活体样本的无损检测。太赫兹波还具有指纹谱性，不同分子在太赫兹的吸收色散等作用后展现出特有的“指纹谱”，能够对样本的外部形态成分进行辨别。另外太赫兹波的相干性也很好，可以提升成像的空间分辨率和景深。一系列优势使得太赫兹技术近年来在军事、医疗、成像等领域飞速发展。

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2005年，Gustafsson从实验上进一步论证了SpEM技术的有效性，得到了50 nm左右的空间分辨率，并将此技术命名为饱和结构光照明显微技术[70](saturated structured illumination microscopy, SSIM)。不过该技术中饱和荧光激发所需的高激发光强会损伤样品，所以该技术不适于活体细胞检测研究。2008年，Hirvonen等提出一种损伤性较低的新技术，其结构光的获取方式改用可逆光转换荧光蛋白[71]，此类非线性光源无需高光强激发光进行荧光饱和，从原理上讲是一大进步。但直到2012年，Gustafsson研究小组才用实验证实了该理论。只不过他们虽然通过此方式获得了非线性结构光照明，但实验结果的空间分辨率仍然停留在约50 nm [72]。值得一提的是，早期的结构光照明显微系统均使用衍射光栅产生结构照明光场，随着SLM等新兴器件在光学波前调控领域的广泛使用，2009年，Hirvonen等首先采用早期的SLM替代光栅产生结构光条纹，成功实现了活细胞二维超分辨成像[73,74]，如图14所示。激光器发出的光经调制传输至反射式SLM接收面，形成的结构光条纹通过透镜组调整经二向色镜DM向下反射携带样品信息，最后向上传输被CCD接收。

2 定量相位显微成像技术

随着对生物细胞的深入研究，尤其是近十年来数字全息和显微技术的快速发展，各种QpI被相继提出。此类技术能在微米甚至纳米量级获取活细胞振幅、相位等多类信息，在生命科学领域备受关注。在光源使用上以高相干激光和低相干光为主，接下来分别进行介绍。

2.1 激光光源定量相位显微技术

激光具有相干度高、光束能量集中、光斑质量优良以及易获取等优点，是光学显微研究运用最为普遍的光源之一。在工业生产、通信传输以及显微成像等领域都有广泛应用。尤其在对生物细胞及活体组织显微成像方面，其透过性良好，且不会对样品的生物活性带来不良影响。常用波段有：632.8 nm红光、532 nm绿光以及488 nm蓝光等。

3)2626隔离开关控制规则，分闸条件：262断路器分闸。合闸条件：262断路器分闸、26230接地开关分闸、26240接地开关分闸、26260接地开关分闸。

2.1.1 同轴干涉下的相位显微技术

杜克大学Adam Wax教授研究小组于2010年提出平行同轴全息相位显微技术[27]，相位成像系统简单，且相位恢复过程仅需两幅干涉图相减即可消除背景项[28]。基本光路如图1(a)所示，成像系统主要包含一个马赫-曾德尔(Mach-Zehnder，MZ)干涉仪和一个成像分束器。光束经MZ系统发生干涉，最后经过Wollaston棱镜和两透镜组成的4f系统将不同光束分离出两个垂直的偏振分量，最后在CCD上发生干涉，得到相移差值π/2的两幅图像。

2011年，中国科学院郜鹏等利用偏振相移原理代替时间相移原理也提出了一类同步相移干涉显微技术[29-30]。同样基于MZ光干涉原理，利用两个相同的相位光栅构成同步单元对物光和参考光进行分光，以便在CCD上同时采集到相移量为π/2的两干涉图样。基本光路如图1(b)所示。

同轴相位显微技术相位成像稳定性好，相位恢复运算简便，但是空间相移控制要求高，不适于细胞的动态成像研究。

参考前人的计分方法(Bering et al., 2005)，结果分为如下3类：功能继续(Capacity)即儿童承认老鼠宝宝已经死亡，却还认为某些功能依然存在，计分为0。功能停止(Cessation)指儿童认为老鼠宝宝死后，某些功能的丧失，计分为1。含糊不明(Unscoreable)指答案和原因不匹配，或儿童表示对此问题不清楚、不知道，计分为0。分数越高，表示儿童越倾向于做出死后功能停止的判断。

同年，Jun Takayanagi等提出一种太赫兹飞行时间三维成像技术[62]，基本原理如图12(a)所示。该技术通过记录样品不同层面的光波信号进行三维形态解构，信噪比高且动态范围更广，纵向分辨率可达300 μm。但是，受扫描方式影响，系统成像时间较长。基于传统手段分辨率低、成像耗时长的弱点，华中科技大学姚建铨院士等于2013年提出了太赫兹相干层析成像技术[49]。该技术辐射源具有相干性低、光频带宽等特点，可实现高精度的纵向扫描成像。如图12(b)所示，该技术以频率输出范围1～20 THz的中压汞灯作为辐射源。选用厚度为500 μm镀金反射镜和300 μm的低阻硅作为待测物体，实验结果证明其纵向分辨率可达100 μm，成像能力优于其他太赫兹三维成像技术。

QpI根据记录全息图时两光场是否存在夹角又可分为同轴干涉下的QpI、离轴干涉下的QpI以及轻微离轴干涉下的QpI。另外还有衍生的双波长技术等。

2011年美国的Martin等[55]通过对13.5 GHz和16.0 GHz毫米波进行多次倍频后获得0.66～0.76 THz的可调谐太赫兹辐射波，其平均功率约50 μW。成像实验光路如图9(a)所示。装置采用离轴干涉的方式，通过探测器二维扫描来获取全息图。另外由于信息处理中选用频域滤波和角谱法，实验图避免了零级衍射的干扰，最小分辨率为2 mm。哈尔滨工业大学可调谐激光技术国家级重点实验室在 2011年进行了2.52 THz数字全息成像实验[56]，其装置如图9(b)所示。实验装置中四个镀金离轴抛物面镜用于对太赫兹波的水平调节，实验中以分辨率板为样品来检测系统分辨率，实验图显示0.4 mm条纹完全可以分辨。后又通过减小物体到探测器距离，达到了0.2 mm的分辨能力。

离轴干涉下的QpI成像效率高，但却不能充分利用CCD的分辨率和空间带宽，而且在相位恢复过程中需要通过高通滤波消除背景像，容易造成高频信息的缺失。

2.1.3 轻微离轴干涉下的相位显微技术

鉴于同轴、离轴两类QpI各有所长，一类结合相移技术的轻微离轴干涉下的QpI被提出。2009年美国杜克大学Adam Wax教授通过控制两偏振片实现了两步轻微离轴干涉[34](slightly-off-axis interference)，实验装置如图3所示。透镜两两组成的4f系统保证了样品相位信息和振幅信息的完整性，旋转调节两波片可以引入不同相移，相应CCD上可记录得到两幅干涉图，最后将实验所得的两幅干涉图导入计算机完成相位恢复。此方法不需要通过高通滤波就能消除背景项，能最大限度确保相位信息的完整性。但是相移需要事后通过拟合背景条纹确定，一定程度上增加了相位恢复的复杂性。

2.1.4 双波长干涉下的相位显微技术

农村发展需要大量的资金支持，但是我国传统的四大银行大都选择在城市发展，撤离农村地区，以至于农村地区覆盖的金融机构比较少，主要为小镇上的农业银行、农村信用社或者邮政储蓄。个别农村地区建立了新型金融组织，但农民获取贷款资格条件高，贷款的相关程序繁琐，整个农村地区金融服务供给存在不足，导致农村出现大量的民间借贷，具有较大的风险。

从原理上讲，成像系统的分辨率取决于光波长和物镜数值孔径(NA)的大小。根据阿贝衍射定律，传统光学显微手段极限横向分辨率约为200 nm，导致显微技术对小于光源波长特征尺度的微观物质结构难以观测。近年来，生命科学逐渐成为主流的研究方向，在该领域纳米尺度成像需求的推动下，伴随着光源、信号探测设备等新型器件的不断进步，新的成像理论接踵而至[63]。其中可突破衍射极限的SIM可将系统分辨率提高到100 nm以内，甚至达到50 nm左右，被视为活体生物细胞观测最有效的手段之一[64]。

  

图1 (a)平行同轴全息相位显微技术；(b)光栅分光同步相移干涉显微技术Fig.1 (a) parallel on-axis holographic phase microscopy; (b) Simultaneous phase-shifting interference microscopy by a grating

  

图2 (a)希尔伯特相位成像技术；(b)衍射相位显微技术Fig.2 (a) Hilbert phase microscopy (HpM); (b) Diffraction phase microscopy (DpM)

  

图3 轻微离轴干涉技术Fig.3 Slightly-off-axis interference

  

图4 (a)实时双波长干涉技术；(b)双波长衍射相位显微技术Fig.4 (a) Real-time dual-wavelength digital holographic microscopy; (b) Dual-wavelength diffraction phase microscopy (Dw-DpM)

2007年，瑞士Kuehn等报道了可对样品快速变化现象和动态性能进行研究的实时双波长全息成像技术[35]，基本光路见图4(a)。该技术利用两不同波长的参考光波，通过调整他们的传播方向，使得两波长干涉下的空间载频方向互为正交，这样非常有利于信息的提取，且仅需CCD单次拍摄。

2014年，韩国学者Jafarfard等将双波长技术应用到共光路的DpM下，实时测量了二氧化硅的折射率和厚度[13]，如图4(b)所示。该技术相较于传统技术不仅具有单次曝光特性，还可以通过滤波变换等运算同时恢复两幅干涉图样，进而得到空间物体的相位信息，获取速度高达毫秒量级，光路稳定且分辨率可达亚纳米量级。不仅适用于活体样品动力学分析，多波长优势还可用于无解包成像等研究。

2.1.5 三维定量相位显微技术

在相位体三维QpI方面，以层析相位显微技术[36-40](tomographic phase microscopy， TpM)为代表。2007年，美国Choi等人运用该技术首次获得了活体海拉细胞的三维图像[38]。其实验装置如图5(a)所示。该技术同样基于MZ的光干涉原理。电控扫描反射镜调节油浸聚光透镜与物镜间产生多角度的样品透射光线，并在CMOS接收面上发生干涉。再应用相移干涉技术计算出每个透射角度对应的相位信息。得到多角度下的样品相位信息后，计算机通过运行相应的相位恢复算法即可重建样品的三维形态分布。2016年Hassaan等人同样用多角度照射的方式重建了小鼠白细胞的三维相位分布[40]，基本原理见图5(b)。系统采用激光共聚焦的方式对样品进行透射采样。其照射角度被电流计旋转镜(GM)所精准控制，对样品进行扫描透射。样品被不同角度的光照射以获取不同角度下的样品全息图。这一系列全息图最终被装置的图像传感器Camera记录下来，通过对应的相位恢复程序--光衍射层析算法(optical diffraction tomography，ODT)整合获取的样品相位信息并完成三维形态重建。

  

图5 (a)层析相位显微技术；(b)旋转照明光束式层析光路示意图Fig.5 (a) Tomographic phase microscopy (TpM); (b) The tomographic phase microscopy (TpM) setup by rotating the light

2.2 低相干光光源定量相位显微技术

激光这类光源相干度高，成像时带来的散斑效应会影响系统分辨率。而低相干光源的相干长度都比较短，能有效地抑制成像系统的相干噪声，提高成像分辨率和重建信息精度。常用的低相干光源有：发光二极管(LED)、超辐射二极管(SLD)以及卤钨灯等。

低相干光源的发展史也很久远。1934年荷兰籍学者Zernike提出了相差显微技术(phase contrast microscopy, pCM)，利用相位板改变物光场的相位频谱，从而实现透明样品的清晰成像[41]。pCM在微观显微成像领域发展进程中具有里程碑式的意义，其光源即是低相干光。2004年美国Gabriel popescu教授提出傅里叶相位显微技术[42](fourier phase microscopy，FpM)，如图6(a)所示。SLD作为光源出射光束,之后样品的散射光与非散射光分别作为物光和参考光，最终在CCD上发生干涉。该技术通过引入相移，采集多幅干涉图以实现相位成像。该课题组于2011年提出与此类似的空间光干涉显微技术[43](spatial light interference microscopy，SLIM), 如图6(b)所示。该技术的特殊之处在于其成像光源采用低相干卤钨灯，相干度仅有1.2 μm，很大程度上提高了图像的对比度，成像效率高，且分辨率高达纳米量级。此技术的显微对象不仅可以是血细胞及其亚类细胞，甚至对其他类生物细胞、浮游微生物以及生物组织都可以实现成像。测量精度媲美原子力显微镜。SLIM的问世有助于细胞内部结构观测、细胞增速测量以及细胞质流动探测等研究的深入推进[44-46]。

  

图6 (a)傅里叶相位成像技术；(b)空间光干涉相位显微术Fig.6 (a) Fourier phase microscopy (FpM); (b) Spatial light interference microscopy (SLIM)

低相干光源在离轴全息中也有运用。2012年，Basanta等提出了白光衍射相位成像技术[14](white light diffraction phase microscopy，wDpM)，如图7(a)所示。利用光栅的衍射特性在不牺牲稳定性的前提下，实现了快速成像。但它与其他离轴干涉不同之处在于,白光光源的引入有效抑制了散斑效应，提高了成像系统的分辨率。值得一提的是，该小组提出的SLIM和wDpM虽分属不同干涉方式但却有其各自的优势，不足之处在于前者对光源要求较高，后者提升分辨率的同时牺牲了视野范围。2013年，白光傅里叶相位显微技术[47] (white light fourier phase microscopy，wFpM)被提出，它不仅继承了双方优点还在一定程度上弥补了它们的短板，基本原理见图7(b)。低相干卤素白光作为照明光源，低时间相干性抬升了其空间灵敏度，共几何光路有助于光路抵抗噪声干扰。该技术的成像速率高达每秒12.5 帧，空间灵敏度高，横向分辨能力强，创新性的运用同轴技术检测动态相位信息。

从上文分析可以看到，现在适用权利用尽理论的主要经济体，除了美国已经否定了该规则的区别适用理论之外，德国、日本及我国都还多多少少保留着区别适用的情况。

众多的QpI在对生物细胞显微成像和结构特征分析方面产生了深远影响。其优异特性是传统光学显微镜和诸多电子显微镜等成像手段无法比拟的。尤其是“相位”这一概念的提出为生命科学研究注入了新的活力，具有很大的发展潜质。比如传统临床血液检测往往基于流式细胞光散射原理，只有分类计数等基本功能。结合QpI之后，血液检测还可以对单一细胞进行病理分析，为医疗诊断提供更有力的依据。在成像质量方面，如今多数QpI分辨率只能达到微米量级，对于生物细胞的成像研究还停留在形态检测和分类识别阶段。低相干QpI虽说不受散斑效应的影响分辨能力优于激光QpI，但技术尚不成熟，在成像效率和稳定性方面仍有提升空间。所以目前研究对象以红细胞等均质细胞为主，分辨率限制了对于细胞复杂内部结构的定量表征。另外由于相位恢复需要耗时的数据运算，其成像效率也会受限。

  

图7 (a)白光衍射相位成像技术；(b)白光傅里叶相位显微技术Fig.7 (a) White light diffraction phase microscopy (wDpM); (b) White light fourier phase microscopy (wFpM)

3 太赫兹波成像技术

太赫兹成像是太赫兹技术较为基础的研究领域。由于太赫兹波在很多材料中传输性能良好，并且单光子能量极低，不会对生物组织产生有害的电离辐射等影响，因此太赫兹技术被广泛运用于材料探查、港口车站安检以及生物组织无损检测等成像领域[48]。太赫兹成像技术主要有：连续太赫兹波二维成像技术、太赫兹波(三维)相干层析成像技术[49]。

1)本自适应调节系统的静态仿真实验表明，系统控制的相对误差均在5%以内，其中当该系统工作在半量程区间时，有着较好的控制精度。

3.1 连续太赫兹波二维成像技术

2006年，英国的Mahon等在100 GHz波段对毫米波数字全息进行了相关实验研究[50,51]。如图8(a)所示采用的是离轴全息的成像模式。利用耿氏二极管振荡器产生太赫兹波，十字形定向耦合器实现物参光束分离。抛物面镜调节参考光角度与物光发生干涉，最后由点源探测器扫描记录图样完成信息采集。

  

图8 (a)毫米波数字全息技术；(b)自由电子激光全息成像技术Fig.8 (a) Millimeter-wave digital holographic configuration; (b) Digital holographic with free-electron laser

北京首都师范大学张岩团队于2008年对太赫兹光波的空域传输进行了数值仿真和实验研究[52]。该方法以角谱理论为原理，无需参考光干涉记录，通过飞秒激光抽运产生太赫兹波，由CCD记录太赫兹复振幅时域波形，最后整合数据得到全息图。2010年Knyazev等利用可调谐太赫兹自由电子激光器在130 μm和68 μm两波段进行了一系列的Gabor同轴数字全息实验研究[53,54]，基本光路如图8(b)所示。该实验装置可获得较大的成像视场，这主要是由于在信息采集时热影像板的引入，太赫兹辐射的二维数字全息图最后由CCD记录采集。

下表是赴菲游客对文化冲突、交通事故、食物中毒、涉水事故、枪击事件等8种主要潜在旅游风险类型发生的可能性、发生后果的严重性以及整体风险感知的调查结果。用以对赴菲游客就在菲旅游安全感知的评价和分析。

离轴干涉下的QpI具有单次拍摄特性，适用于物体的动态成像研究。2006年Gabriel popescu团队提出希尔伯特相位成像技术[31](hilbert phase microscopy，HpM)，它同样基于典型的MZ干涉光路，利用希尔伯特积分变换处理单幅干涉图以实现干涉相位成像，如图2(a)所示。然而此类技术双光束属于分离式干涉，稳定性较差，易受外界环境干扰。对此，共光路的离轴干涉相位成像技术被提出。如衍射相位显微技术[14,32,33](diffraction phase microscopy，DpM)以及它的延伸技术，利用光栅的衍射特性在不牺牲稳定性的前提下，即可实现快速成像，实验原理如图2(b)所示。携带样品信息的光束通过光栅后可得到包含图像全部空间信息的多级衍射，滤波器SF实现0级和1级衍射场的分离，使之作为参考光和物光在CCD上形成干涉调制图样。

2014年，李琦等以CO2激光抽运激光器为辐射源产生连续太赫兹波，进行了Gabor同轴数字全息成像实验[57]，待测物体选用聚四氟乙烯基底电路板，其分辨率分别为0.4 mm和0.6 mm，采集不同距离下的多组实验结果，最后运用对应的算法理论完成了图像重建。实验装置如图10(a)所示。同年，北京工业大学王大勇等提出了连续太赫兹同轴数字全息成像技术[58]，实验装置如图10(b)所示。辐射源同样选用CO2抽运连续太赫兹波激光器，频率参数为2.52 THz。太赫兹波从辐射源出射，首先通过两抛物面镜对太赫兹波进行扩束整形，之后太赫兹波透射样品携带信息，散射光和非散射光在记录面发生干涉最终被探测器采集。该系统达到了横向0.3 mm纵向0.4 mm的分辨能力。

  

图9 (a)Martin等的太赫兹数字全息记录技术；(b)哈工大的连续太赫兹波数字全息技术Fig.9 (a) Digital holographic recording configuration by Martin; (b) Continuous-wave terahertz digital holography by Harbin Institute of Technology

3.2 太赫兹波(三维)相干层析成像技术

太赫兹相干层析技术的主要原理与三维QpI[36-40]类似，即一束太赫兹波透射待测样品后通过控制样品移动，使太赫兹波多方位多角度透射待测样品，携带的样品信息最终被记录下来通过计算机运算处理以获得待测样品的三维形态。

（2）杂交组合：无眼×无眼 预期结果：若子代中无眼∶有眼=3∶1，则无眼位显性性状；若子代全部为无眼，则无眼为隐性性状

2002年，Ferguson等首先提出一种太赫兹透射层析成像技术[59]。2004年，Simon等进一步发展了这一技术[60]，基本光路如图11(a)。实验通过改变样品的水平角度，太赫兹波从多个角度透射以获取样品不同角度下的光强相位等信息。但是若被测物体结构特殊对光波形成较大干扰，或是待测样品无法进行旋转等操作时，此技术将不再适用，故应用范围较小。2009年，Christian等提出一种快速主动式连续太赫兹反射层析成像技术[61]。如图11(b)所示，该技术基于雷达原理，通过连续波谱调制法来获取被测物体的形态、位置等信息。速度快，只需几秒即可获得物体的三维图像。该系统具有效率高、稳定性好等优势。

2.1.2 离轴干涉下的相位显微技术

  

图10 (a)李琦等的连续太赫兹波数字全息技术；(b)连续太赫兹波同轴数字全息技术Fig.10 (a) Continuous-wave terahertz digital holography by Li; (b) Continuous-wave terahertz in-line digital holography

  

图11 (a)太赫兹透射层析成像技术；(b)太赫兹反射层析成像技术Fig.11 (a) Transmission terahertz tomography; (b) Reflection terahertz tomography

从太赫兹波成像技术的发展进程可以看出，该研究最大的瓶颈在于如何获取稳定理想的太赫兹辐射波。获取方式有倍频、光电导或者激光震荡等。但是采用倍频或者光电导法的辐射源不容易达到辐射功率以及相干性等参量要求，而且这类方法辐射源的元器件较多，体积偏大，不利于实验运用。而激光震荡不仅可以产生连续的太赫兹波，而且辐射功率稳定、相干性良好，可以直接获取样品场复振幅。另外辐射源体积较小，相对廉价的实验成本更有利于广泛应用。当下主流的太赫兹激光器有：CO2抽运连续气体激光器、自由电子激光器以及量子计量激光器等等。虽然目前较为先进的太赫兹成像技术已经具有动态检测的能力，但由于波长较长，受限于阿贝原理，成像系统的分辨率不理想，只能达到几百微米。相较于其他成像技术，太赫兹波成像技术在分辨率上仍有一定的发展空间。

  

图12 (a)太赫兹飞行时间三维成像技术；(b)太赫兹相干层析成像技术Fig.12 (a) High-resolution time-of-flightterahertz tomography; (b) Terahertz coherent tomography

4 结构光超分辨成像技术

对于众多的QpI，从干涉图样中直接提取相位信息时，受到相位恢复算法本身的限制，往往需要对获取的相位信息进行解包处理，运算量大且抗噪声能力弱。而双波长以及多波长干涉技术从等效延长波长的角度入手可以很好地解决这一问题。

4.1 二维结构光超分辨成像技术

最早从事SIM研究的小组主要有美国的Gustafsson团队和英国伦敦的Heintzmann团队。1999年，Heintzmann等首先提出了横向调制激发显微镜[65](laterally modulated excitation microscopy，LMEM)的概念。他们利用水平方向激发的方式进行实验，所得的高分辨率实验结果印证了其高分辨率的成像能力，如图13(a)所示。LMEM即是后来SIM的雏形。2000年，Gustafsson等发展了LMEM，并称其为SIM，其基本思路是通过双光束干涉的方法，在显微物镜焦平面形成高空间频率余弦强度分布的条纹结构照明光场[66,67]。实验测得该技术的横向空间分辨率约为115 nm。2002年，Heintzmann等再次提出了饱和式激发显微技术[68](saturated patterned excitation microscopy，SpEM)。该技术运用非线性饱和荧光激发，成像空间分辨率再次提升，实验原理如图13(b)所示。第二年他们运用二维光栅对SpEM实验装置进行了优化，二维光栅能同时产生两个方向的结构光照明，通过计算机仿真运算，得到了57 nm的实验结果[69]。

结构光照明显微成像技术(structured illumination microscopy，SIM)是一种通过对照明光源改造以突破衍射极限提高分辨率的显微成像技术。有别于受激发射损耗显微技术(stimulated emission depletion，STED)[22]、随机光学重构显微技术(stochastic optical reconstruction microscopy，STORM)[23]以及光激活定位显微技术(photoactivated localization microscopy，pALM)[24]等技术的荧光特性(在对样品显微成像之前需利用特殊制剂对其荧光标定，该过程可能会引起光漂白、毒伤等副作用)。SIM可以通过空间光调制器(spatial light modulator，SLM)等器件改造光源来实现非荧光成像。在不断追求更高分辨率的大环境下，SIM以其超分辨的性能在显微成像领域独树一帜，原理如下：结构光源将被测物体的高频信息编码至低频区域，使其通过传统光学显微技术频域受限的通频带，再还原到高频区域，光学显微技术的频谱范围被拓宽，可获得更为精细的样品信息，即系统成像分辨率得到提高，不再受阿贝衍射极限的分辨率限制[1, 25, 26]。不仅如此，SIM在工业生产中也被涉及推广。以其大量程、大视场、高精度、光纹信息提取简单、实时性强及主动受控等特点，在三维视觉检测和机器人自主导引中得到了愈来愈广泛的应用。另外，当下炙手可热的智能手机面部识别功能也有不少基于SIM研发而来，实用价值很高。

  

图13 (a)横向调制激发显微镜；(b)饱和样式激发显微技术Fig.13 (a) Laterally modulated excitation microscopy (LMEM); (b) Saturated patterned excitation microscopy (SpEM)

  

图14 Hirvonen等的结构光超分辨技术Fig.14 Structured illumination microscopy (SIM) by Hirvonen

2013年，Dan 等使用LED作为光源，数字微镜阵列(digital micromirror device，DMD)作为SIM开展成像研究，并实现了超分辨成像[75,76]。不同于传统的干涉式SIM，该技术采用单光束投影法，光路如图15(a)所示。DMD的作用在于产生高空间频率的结构光。由于该系统采用了LED照明，可在有效减弱激光照明所带来散斑问题的同时避免干涉式SIM系统中复杂的偏振控制，有利于仪器的小型化发展。此外该技术规避了机械移动带来的稳定性问题，且投影条纹的空间频率在一定范围内快速可调，进一步扩展了该系统的应用范围，在多波长激发的快速超分辨成像领域发展潜力巨大。

宫宝田是山东人，自幼家贫，入私塾读书四年后辍学，13岁那年由亲戚托人介绍到了北京的“元亨利”米房当学徒。这米店的老板很有后台，能够从大内弄到“正黄旗”龙票，可以接到皇亲国戚的订单，打出来的优质大米直供各王府。宫宝田这样的童工就是负责送米的。

上述基于散射成像的SIM，虽然不需要对样品进行荧光标定，但往往需要借助纳米金微粒辅助成像来提升图像对比度，应用范围受限。2013年华中科技大学陈建玲等将SIM应用于相衬显微成像[77](differential interference contrast，DIC)，提出了一种超分辨结构光照明相衬成像技术[26](structured illumination differential interference contrast，SI-DIC)，如图15(b)所示。采用LED作为照明光源，光束同样采用SLM产生结构光，光束经调制继续向前传输进入DIC显微镜内，最后由CCD接收。选用聚苯乙烯小球为实验样品测试系统分辨率，得到了190 nm左右的实验结果，相较传统DIC分辨率有着明显优化。虽然分辨率相对较低，但此技术结合了SIM的超分辨能力以及DIC对样品无损伤、无荧光标定的优点，实现了样品无侵入前提下较高质量的超分辨成像。

20世纪70年代，Nicodemus提出了BRDF的精确概念，并用来描述物体的各向异性[7-8]。定义BRDF为目标在某一方向(θr,φr)的反射亮度dLλ与入射方向(θi,φi)的照度dEλ的比值，其参数如图1所示。

4.2 三维结构光超分辨成像技术

Gustafsson团队于2008年实现了三维结构光照明超分辨荧光显微成像，其双向的三维成像分辨率都达到了100 nm，相较于传统显微技术分辨率有着2倍以上的提升[78-80]。装置采用偏振光栅产生结构光，光束照射样品携带信息并最终传输至CCD。基本光路如图16(a)所示。2009年，该研究团队用同样的方式，将物理光栅替代为SLM来产生结构光照明，无需机械移动任何光学元件，大大缩短了结构模式的切换时间，从而实现了活细胞的超分辨成像[81]。2011年，Shao等基于SIM 获得了活细胞3D超分辨图像[82]，并于第二年实现了双色3D活细胞超分辨成像[83]，该装置采用空间不连续多模态激光光纤作为光源，液晶器件(LC)可调节结构光的偏振状态，零级和一级衍射光可被旋转掩模装置选择，结构光在物镜后焦面汇聚携带样品信息，最终由sCOMS接收记录，实验光路原理如图16(b)所示。

IBD标准血清、抗原：标准抗原(批号：2013008)、阴性血清(批号：2013020)和阳性血清(批号：2013032)，由中国兽医药品监察所生产，阳性血清AGP效价1∶128.

  

图15 (a)数字微镜结构光超分辨技术；(b)结构光照明超分辨微分干涉相衬显微成像技术Fig.15 (a) Structured illumination microscopy (SIM) by digital micromirror device (DMD); (b) Structured illumination differential interference contrast (SI-DIC)

  

图16 (a)Gustafsson的三维结构光照明超分辨成像技术；(b)双色三维活细胞超分辨成像技术Fig.16 (a) 3D structured illumination microscopy (SIM) by Gustafsson; (b) 3D structured illumination microscopy (SIM) for living cell with two-tone

SIM和QpI技术在光束调制模块都用到了SLM，但是调制的位置不同，QpI光束调制模块针对携带样品信息的干涉光，而SIM是针对光源发出的出射光。从实用性上讲，SIM同样具有低相干光QpI的优势，能够有效抑制散斑效应降低空间噪声，增大系统分辨率，提高成像质量，实现超分辨成像。从灵活性上讲，SIM还可以模块化，可与其他技术相结合拓展更多的功能。另外，在三维重构方面，SIM不需要QpI相位恢复、解包等操作程序，只需要将获取的多幅图片进行叠加操作，过程简单，耗时短，在生物细胞动态检测和动力学行为分析领域具有潜在优势。但当前SIM在对生物细胞成像时仍不能完全做到无损伤、无侵入，故需要在此方向上探究更安全的技术手段。

左小龙怔了几秒，突然发动摩托车，挂入空挡，然后拧大油门。瞬间，引擎和排气管的声音盖过了音乐。店老板一楞，不想左小龙还有这招，遂加大音量，但唱片机的音量在发动机面前还是显得调不成调，非常渺小。整个街道只听到左小龙摩托车引擎的高转速声音，仿佛雾气都被驱开了一些，空气也回暖了一些。

5 显微成像技术的发展趋势

随着生命科学及其相关学科的飞速发展，人们迫切关注人体疾病发病机理、疾病诊断及治疗手法等问题，生物细胞形态结构显微成像以及亚表面特征识别研究越来越显示出重要的意义与价值。在此过程中，科学家们不断优化探索手段和研究技术，以便于更加深入的了解各类生命现象的本质。在众多的探索手段和研究技术中，光学显微这一具有悠久历史的学科门类别具一格，已作为细胞检测的主要技术。这一方向的研究热度逐年升温，吸引着大批研究学者的目光。各类基于光学原理的显微技术纷至沓来，在细胞显微成像、特征识别、参数测定以及动力学行为分析等领域的大量运用，很大程度上助推了生命科学的迅猛发展。

当下，QpI的主要研究对象仍为结构相对简单的生物细胞，对此类细胞(如红细胞)可实现显微成像，定量分析。但对于内部结构较复杂的生物细胞(如白细胞、海拉细胞等)的研究还处于探索阶段。由于这类生物细胞结构形态的特殊性，行之有效的相位恢复算法尚未提出。所以复杂结构生物细胞的显微成像技术是一个发展方向。另外，相位体完整的三维信息解构才是技术发展的最终目标。TpM虽然能实现三维成像，还原样品的形态分布和亚结构，但多角度扫描速度慢、效率低，不适合细胞的动力学行为分析。由此发展高效的三维QpI也是显微成像技术的一个发展方向。

相较于其它光源显微成像技术，太赫兹波成像技术一定程度上可以获得更丰富的信息，在生物医学成像、无损检测、文物地质探测、安检甚至军事反恐等领域具有重要意义。但当下太赫兹辐射源种类繁多，有的辐射源体积庞大且价格不菲，大大限制了太赫兹成像技术的发展。提升其系统性能、优化实验操作的同时降低使用成本是此类显微成像技术的一个发展方向。另外，受限于波长的影响，太赫兹成像技术的分辨率较低(毫米量级)，无法满足生物组织与细胞高精度的观测需求，而且在医学光谱成像领域，还没有完善的太赫兹光谱和成像技术标准。所以改良优化太赫兹成像技术分辨率的同时探寻太赫兹波在生物医学诊断、生物细胞显微成像领域的应用也是此类显微成像技术的一个发展方向。

SIM可以打破衍射极限的限制，实现超分辨成像。不需要特别的荧光标记方法，分辨率较传统显微技术能提高一倍以上，在生物医学研究领域具有很好的应用价值。但对于100 nm以下尺度生物细胞亚结构，SIM的分辨率仍显不足。而且SIM在当前活细胞成像观测中还存在光漂白、光毒性以及时间分辨率低等问题。随着各类新型探针的发展，融合多种成像方式、优化正则图像重构算法，推进其在生物医学活体细胞动态成像方面的应用是显微成像技术的又一发展方向。

6 结束语

本文介绍了基于高相干激光、低相干光、太赫兹波以及结构光的四类无标记显微成像技术，对比分析了各类技术的原理及发展状况，这些技术能够提供微观粒子的结构和形态特征等信息，为人类的探索研究提供了有力手段。在显微成像技术的发展历程中，其成像性能不断提升，成像维度更加多元，应用范围也愈发广泛，取得了许多的研究成果。随着人们对生命科学研究的关注热度与日俱增，整合各类光源优势致力于生物细胞显微成像的发展将会是未来的研究重点。显微成像技术有望不断给生命科学、生物医学等领域的研究带来新的突破。

电-气互联综合能源系统多时间尺度动态优化调度//梅建春,卫志农,张勇,马洲俊,孙国强,臧海祥//(13):36

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