杜仲Eucommia ulmoides Oliv为杜仲科落叶乔木，是我国特有经济植物，主要分布于湘、桂、川、滇及长江中下游流域等[1-2]。据《本草纲目》记载，杜仲皮为名贵滋补药材，而杜仲树剥皮后容易死亡，制约了杜仲的药用价值推广[3]。现代研究发现，杜仲叶与杜仲皮具有相同的功能成分和药理功效，杜仲叶中活性成分绿原酸含量高达5%，且富含京尼平苷、桃叶珊瑚苷等[4-5]。绿原酸具有抗肿瘤、抗氧化、抗病毒、保护心血管和清除体内自由基等作用[6-7]，对治疗血液、消化及生殖系统等方面的疾病有显著效果[8]。因此，杜仲中绿原酸的提取开发成为研究者关注的热点[9-11]。

绿原酸属于极性有机酸，一般采用极性较强的水提取杜仲叶中绿原酸[12-13]。然而，绿原酸在强极性溶剂和高温下容易发生水解和分子内酯基迁移现象[14]，从而异构化形成新绿原酸和隐绿原酸，导致新绿原酸和隐绿原酸含量升高，绿原酸含量下降。为了强化提取效率和缩短提取时间，研究人员采用微波辅助提取法[15]、超声波辅助提取法[16]和生物酶法[17]等进行提取，这些方法在一定程度上改善了提取效果，但由于设备投资大，运行成本高，不适合工业化生产。除此之外，采用水提取法所提取绿原酸的杂质较多，加大了后续分离的成本。为此，有人尝试用极性适中的有机溶剂提取法，有机溶剂能够抑制植物酶对绿原酸的催化分解作用，减少水溶性杂质的溶出[18]。同时还发现，绿原酸在乙醇体系中比在甲醇、丙酮等有机体系中更加稳定，乙醇成为提取绿原酸的首选溶剂[19]。传统的单因素和正交设计试验误差较大，已不能满足杜仲叶的绿原酸提取工艺优化要求[20-21]，基于数学与统计学结合的响应面分析法不仅能够缩短优化时间，而且建模速度快，工程应用的可信度高[22]。为此，本文中以乙醇水溶液作为提取溶剂，在单因素试验基础上，通过响应面法分析乙醇浓度、料液比、提取温度等工艺参数对杜仲叶中绿原酸提取率的影响，旨在为优化杜仲叶绿原酸的提取工艺提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

杜仲叶（湖南广源生物科技有限公司），绿原酸标准品（北京盛世康普化工技术研究院），其他试剂为分析纯（国药集团）。

1.1.2 主要仪器设备

UV-5100型紫外分光光度计（上海元析仪器有限公司），BT25S型电子天平（赛多利斯有限公司），101-2AB型电热鼓风干燥箱（天津市泰斯特仪器有限公司），FW135型中草药粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司），TDL-40B型高速离心机（上海安宁科学仪器厂），HWS-12型电热恒温水浴锅（上海一恒仪器有限公司）。

1.2 方 法

调查方法参照农药田间药效试验准则(一)(GB/T17980.28-2000)于每次施药前和第三次施药后7天各调查一次，全期共调查4次。每小区随机取4点调查，每点查2株，每株调查全部片叶，记录发病程度，计算病情指数和防效。

特别，若ai=0,bi=+∞，则C={x∈Rn:xi≥0}。对∀u∈Rn，PC(u)=(max(xi,0))i。

参考相关文献[23]，精密称取10.4 mg的绿原酸标准品，用40%乙醇溶液定容至10 mL，配制1.04 mg/mL的母液，再将母液分别稀释成5.2、10.4、15.6、20.8、31.2、41.6 μg/mL 的标准溶液。测定各标准溶液在325、345 nm的A325、A345值，求得ΔA。以吸光度ΔA为横坐标，绿原酸浓度C为纵坐标，绘制标准曲线，C＝47.281 0ΔA－0.510 5，R2＝0.999 3，说明标准曲线线型相关性良好。

果树成熟期的变化、举办观光采摘节庆所追求的目的、意义等因素发生改变，观光采摘节庆的时间、地点、主题和活动内容也会随之改变，所以统计时以最近一两年的信息为准。如果官方和网络都没有关于首届举办时间的准确数据，就以百度搜索最早出现的年限作为首届举办时间。

1.2.2 样品检测

将杜仲叶在鼓风干燥机中烘干后粉碎，过筛，称取粉碎后的样品20.0 g置于500 mL烧杯中，加入280 mL 40%的乙醇水溶液，放于60 ℃恒温水浴锅中回流提取30 min后，滤液真空抽滤，然后将提取液5 000 r/min离心5 min，取上清液稀释50倍。以40%乙醇溶液为参比，用紫外分光光度计测定A325、A345值，求出提取液中的绿原酸含量。

1.2.3 稳定性测定

1.2.1 标准曲线的制备

将待测样品置于室温下24 h，再进行吸光度测定，结果见表1。由表1可知，各样品在40%乙醇溶液中的吸光度值变化不大，说明各样品在40%乙醇溶液中表现稳定。

 

表1 样品放置24 h后吸光度变化Table1 Changes of absorbances of placed samples after 24 h

  

序号No. 0 h 24 h A325A345 ΔAA325A345 ΔA1 1.576 1.211 0.365 1.514 1.178 0.3362 0.923 0.585 0.338 0.874 0.557 0.3173 1.363 0.974 0.389 1.346 0.952 0.394

1.2.4 单因素试验设计

称取20.0 g杜仲叶粉末加入500 mL三颈烧瓶中，然后加入一定浓度的乙醇水溶液，加热至设定温度，回流提取一定的时间后，按照1.2.2方法检测提取液中绿原酸含量，分别考察乙醇质量分数（10%、20%、40%、60%、80%、100%）、 温度（30、50、60、70、80、90 ℃）、时间（30、45、60、75、90、105 min）、料液比（1∶ 6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14、1∶16）以及提取次数等因素对绿原酸提取率的影响。

由方差分析结果可知，该回归方程呈极显著性（P＜0.01），模型失拟项也呈极显著性（P＜0.01）。B、C2对绿原酸提取率的影响极显著（P＜0.01），B2对绿原酸提取率的影响显著（P＜0.05），A、C、AB、AC、BC、A2对绿原酸提取率的影响不显著（P＞0.05）。

在单因素实验基础上，确定料液比、乙醇质量分数、提取温度3个因素及水平值，运用Design-Expert 8.0软件进行Box-Behnken响应面设计和数据分析。料液比、乙醇质量分数、温度分别以A、B、C表示，每个因素的高中低水平分别以1、0、-1进行编码，各试验因素及水平值见表2。

 

表2 试验因素及水平Table2 Factors and levels of experiment

  

因素Factor 水平Level-1 0 1 A 1∶8 1∶10 1∶12 B 40 60 80 C 50 60 70

2 结果与分析

2.1 单因素试验

那么，在面临新的技术挑战时，我们是否从阿西洛马会议中吸取到了经验与教训，我们能否构建公众对于新技术的信任与合理的分配机制呢？

鲜叫花子没有被淹死。他是这地头的好水性，他能在寒冬腊月泅水爬到泊着的大帆船上去设局找事。鲜叫花子在下游不远处就起了水。他不想张满春还真胆敢把他扔下去。张满春几年前到城里来收账的故事，传得沸沸扬扬，鲜叫花子当时听说后就将信将疑。这下他才真正见识了那个乡巴佬的胆量。鲜叫花子自然是不肯善罢甘休。

在料液比1∶14、提取温度60 ℃、提取时间30 min条件下，考察不同乙醇质量分数对绿原酸提取率的影响，结果如图1所示。由图1可以看出，随着乙醇质量分数的增高，绿原酸的提取率呈先上升后下降的趋势，选择40%乙醇作为提取溶液质量分数。

  

图1 乙醇质量分数对绿原酸提取率的影响Fig.1 Effect of ethanol mass fraction on extraction rate of chlorogenic acid

2.1.2 提取温度对绿原酸提取率的影响

在料液比1∶14、乙醇质量分数40%、提取时间30 min条件下，考察提取温度对绿原酸提取率的影响，结果如图2所示。由图2可知，在30～60 ℃之间，绿原酸提取率随着温度的升高而增加，达到60 ℃后，随着温度的进一步升高，绿原酸的提取率呈缓慢下降趋势。绿原酸为热敏性物质，在高温下容易失去活性，所以适宜的提取温度为60 ℃。

利用Design-Expert 8.0 Trial软件对表3中数据进行多元回归拟合，得表4。

在料液比1∶14、乙醇质量分数40%、提取温度60 ℃条件下，考察提取时间对绿原酸提取率的影响，结果如图3所示。由图3可知，绿原酸的提取率随着提取时间的增加而迅速增长，60 min时提取率最高，之后随着提取时间的增加提取率迅速降低，可能是随着提取时间的延长，部分绿原酸在高温下分解。因此，选择提取时间60 min。

  

图2 提取温度对绿原酸提取率的影响Fig.2 Effect of extraction temperature on extraction rate of chlorogenic acid

  

图3 提取时间对绿原酸提取率的影响Fig.3 Effect of extraction duration on extraction rate of chlorogenic acid

2.1.4 料液比对绿原酸提取率的影响

2.1.1 乙醇质量分数对绿原酸提取率的影响

射频热凝术的治疗是通过射频电极在椎间盘内形成高频电场,促使局部水分子共振产生人靓,气化椎间盘髓核组织,让突出的部位收缩回来,进而接触对相关神经根的压迫[5]。臭氧消融治疗则是将臭氧注入髓核之后,治疗本质都是促进髓核萎缩,抗炎、减压的作用。联合联合应用有利于患者病情的恢复。本次研究结果显示,研究组患者总有效率为92.00%,对照组患者总有效率为80.00%,差异具有统计学意义(P<0.05);研究组患者IL-6及TNF-α水平明显低于对照组患者,差异具有统计学意义(P<0.05),进一步说明,射频热凝术联合臭氧消融治疗腰椎间盘突出临床效果显著,有利于患者恢复。

2.1.5 提取次数对绿原酸提取率的影响

  

图4 料液比对绿原酸提取率的影响Fig.4 Effect of solid-liquid ratio on extraction rate of chlorogenic acid

取杜仲叶粉20.0 g，在乙醇质量分数为40%、温度为60 ℃、料液比为1∶14的条件下提取60 min，并提取4次，如图5所示，绿原酸的提取率在2次提取后趋于稳定，所以选择2次作为提取次数。

  

图5 提取次数对绿原酸提取率的影响Fig.5 Effect of extraction times on extraction rate of chlorogenic acid

2.2 响应面法试验

2.2.1 响应值结果及其拟合模型

采用Box-Behnken中心组合试验设计原理，结合单因素试验结果，固定液料比1∶14，提取次数2次，分析乙醇质量分数、提取温度和提取时间对绿原酸提取率的影响。试验设计及结果如表3所示。

 

表3 响应面试验设计及结果Table3 Design and results of the response surface experiment

  

Experiment No. A B C 提取率Extraction rate /%1 0 -110.730 214 21 -1 0 0.870 77930 0 0 0.785 533 411 0 0.523 264 5-1 0 -1 0.650 641601-1 0.470 641 7-110 0.554 424 8-1 -1 0 0.582 082 9-1 010.694 849 101010.579 52811 0 0 0 0.785 53312 0 0 0 0.785 53313 0 -1 -1 0.647 236 1410 -1 0.576 21815 0110.500 428试验编号

2.2.2 模型方程的建立及显著性分析

2.1.3 提取时间对绿原酸提取率的影响

 

表4 回归模型及其显著性检验Table4 Test of the regression model and its signiciances

  

方差来源Variance source平方和Sum of squares均方Mean square自由度Degree of freedom F值P值F value P value模型Model0.240 000 0 9 0.027 000 10.80 0.008 7 A 0.006 740 010.006 740 2.75 0.158 4 B 0.150 000 010.150 000 59.56 0.000 6 C 0.003 211 010.003 211 1.31 0.304 5 AB 0.000 098 510.000 098 0.04 0.849 1 AC 0.000 418 210.000 418 0.17 0.696 9 BC 0.000 707 310.000 707 0.29 0.614 4 A2 0.001 456 010.001 456 0.59 0.476 0 B2 0.012 000 010.012 000 5.07 0.074 2 C2 0.073 000 010.073 000 29.63 0.002 8残差Residual 0.012 5 0.002 455失拟误差Missing item 0.012 3 0.004 092纯误差Pure error 0 2 0总误差Total error 0.250 000 0 14

当P值小于0.05时，表示此项指标显著，说明自变量和响应值之间线性关系显著。各因素经回归拟合后，得回归方程：

在乙醇质量分数40%、提取时间60 min、提取温度60 ℃条件下，考察料液比对绿原酸提取率的影响，结果如图4所示。由图4可知，绿原酸的提取率随着料液比的增加而不断上升，当料液比为1∶14时提取率最大，随后趋于平稳。

 

其中，Y为提取率，A为料液比，B为乙醇质量分数，C为温度。

1.2.5 响应面法优化设计

我喜欢《水浒传》，是因为喜欢书中之人，觉得108将一个个是英雄豪杰，一个个都可敬可爱，连偷鸡的鼓上蚤时迁也不例外。可是，在近来的一天夜间，我忽然有了这样的问题：如果这108人不是在书中电影中电视中，而是在现实生活中，而且就生活在我们的身边，他们还是那么可爱可敬吗？不，不仅不可爱可敬，还会让我感到十分惧怕。

2.2.3 响应曲面分析

根据回归分析结果，做出响应面图，如图6～8所示。由图6可知，在各料液比中，随着乙醇质量分数的增加，绿原酸的提取率开始快速增加而后减缓。由图7可知，在各料液比中，随着提取温度的增加，绿原酸的提取率先上升后下降，可能是由于绿原酸为热敏性物质，随着温度的升高绿原酸分解，从而导致提取率下降。由图8可知，在乙醇质量分数较低时，随着温度的增加绿原酸的提取率先上升后下降；在乙醇质量分数增大为40%～60%时，提取率达最大；随着乙醇质量分数的进一步增加，持续提高温度，提取率下降。

不远处的空地上，燃着一大堆蓝色的火焰。族人们远远站在火堆的一侧，闭着眼睛，双臂于胸前交叉，与那图腾中的人形保持着同样的姿势，虔诚地低声祈颂。

  

图6 料液比和乙醇质量分数对绿原酸提取率的影响Fig.6 Effect of solid-liquid ratio and ethanol mass fraction on extraction rate of chlorogenic acid

  

图7 料液比和提取温度对绿原酸提取率的影响Fig.7 Effect of solid-liquid ratio and extraction temperature on extraction rate of chlorogenic acid

  

图8 乙醇质量分数和提取温度对绿原酸提取率的影响Fig.8 Effect of ethanol mass fraction and extraction temperature on extraction rate of chlorogenic acid

2.2.4 提取工艺条件检验

哈尔滨焊接研究院有限公司研发中心副主任黄瑞生先生做了题目为“厚壁铝合金窄间隙激光填丝焊接技术”的报告，报告重点介绍了针对5A06铝合金大厚板焊接需求，采用激光光束以一定轨迹运动的扫描焊接方法，研究了激光束不同运动轨迹对铝合金激光深熔焊接焊缝成形及气孔的影响，在此基础上应用扫描激光填丝焊接技术焊接了130mm厚5A06铝合金，并对焊接接头组织、性能进行分析。

考虑到实际情况，将提取工艺条件修改为料液比1∶11，乙醇质量分数40%，提取温度61 ℃。采用修正条件进行试验，得绿原酸实际提取率为0.870 8%，与0.872 8%相比，相差0.23%，说明此方程与实际情况拟合良好，所建模型可靠。

播种前应有效处理种子。在处理过程中，主要采用种子选择法和拌种法。这能保证大豆病虫害的防治，减少病虫害对大豆生长的影响，有效提高大豆的总产量。

3 结论与讨论

通过响应面优化杜仲叶中绿原酸的提取工艺，获得最佳提取条件：料液比1∶11、乙醇质量分数40%、提取温度61.42 ℃。在此工艺条件下绿原酸提取率为0.872 8%。3个工艺条件对绿原酸提取率影响程度由大到小依次为乙醇质量分数、料液比、提取温度。考虑到实际操作的限制，将提取工艺条件参数修改为料液比1∶11，乙醇浓度40%，提取温度61 ℃。采用修正条件进行试验，结果与理论预测值基本一致。

为了进一步提高杜仲叶中绿原酸的提取效率，除了微波和超声波辅助外，还可以通过一些生物技术来改善提取效果。如陈晓娟等[24]分别通过酶法和半仿生法从杜仲叶中提取绿原酸，提取率达到1.44%和1.29%；刘艺等[25]通过超临界流体萃取绿原酸，避免了提取过程中高温氧化分解绿原酸；余少冲等[26]采用罐组动态逆流提取技术提取绿原酸，提取率是传统单罐提取的2.3倍。温度对绿原酸的稳定性和提取效率起到双重影响的作用，一方面，温度的维持不利于绿原酸的稳定，另外一方面，升高温度有利于提高绿原酸的表观活化能，加快绿原酸扩散至杜仲叶颗粒表面，增加其在溶剂中的溶解度，进而提高绿原酸提取率[27]。因此，还需进一步探讨温度和乙醇对绿原酸的浸出动力学原理，绿原酸粗提工艺也需要向精提工艺转变。

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