0 引言

环境激素污染问题是当前世界各类水体共同面临的全球性环境问题，尤以发达国家为甚，迄今尚无行之有效的控制策略[1]。其中，17β-雌二醇（17β-E2）是主要来源于人类和动物排泄、工农业废水及污泥，在土壤、地表水甚至地下水等环境中分布最为广泛、雌性活性最强，且对生态系统及周边人群健康存在直接或间接严重威胁的天然甾醇类环境雌激素之一[1-2]，在环境学与生态学研究领域受到广受关注。

大量研究成果证实，以17β-雌二醇为代表的甾体雌激素污染对人类的健康和繁衍、生态系统的平衡与演替、甚至水体微生物种群结构及其环境功能均可构成严重影响。如，痕量（ng/L级浓度）17β-雌二醇即可引起男性精子质量和数量下降以及不育症、女性生殖器官肿瘤、儿童早熟等影响人类繁衍能力和生存质量的疾病[3]；亦可导致鱼类雌性化，雄鱼生殖腺退化、幼鱼变态以及野生动物繁殖能力降低等[4-5]，威胁生态系统的正常繁殖与演替。我们的研究表明，17β-雌二醇污染甚至对水体微生物活性及其种群结构演替存在规律性的影响[6-9]。因此，鉴于17β-雌二醇分布的广度和对人类及生态系统危害的深远影响[10-13]，美国等许多国家已将其列为致癌物和（或）优先控制污染物[14]。

值得关注的是，17β-雌二醇污染对水体甲烷的产生与释放存在规律性的影响，可能干扰水体中碳素的生物地球化学循环。我们的前期研究成果表明，在厌氧条件下质量浓度为1.0～1000.0 ng/L的17β-雌二醇的污染会对产甲烷菌的功能和微生物的活性产生促进作用；在好氧条件下质量浓度为5.0～100.0 ng/L的17β-雌二醇的污染会使水体微生物甲烷氧化功能随浓度的增加而增强。由于近年来不仅17β-雌二醇的污染范围逐渐扩大，而且其污染浓度在许多水域呈显著升高趋势，因此有必要在更广域的范围内探讨17β-雌二醇污染对水体微生物甲烷氧化功能的影响规律，并揭示其微生物生态学机理。

5G承载的挑战与技术方案探讨…………………………………………………………………李俊杰，唐建军 24-1-49

鉴于此，本研究于实验室模拟构建了好氧水体微生态系统，在更广域浓度范围内，分析在好氧条件下，不同浓度17β-雌二醇的污染对水体微生物甲烷氧化功能的影响规律，及其影响甲烷氧化菌环境功能发挥的微生物学和分子生态学机理，为丰富环境雌激素污染的生态毒理学理论奠定基础。

1 实验部分

1.1 实验室模拟水体微生态系统的构建

实验土样取自中国巢湖西湖中心水域，于实验室阴凉处自然风干，经碾磨、过筛、混匀后称取50 g装于200 mL的血清瓶中，注入100 mL无机盐培养液，以橡胶塞密封。每日于无菌操作台中打开橡胶塞1 h，置换新鲜空气后再次密封，然后以30 mL高纯甲烷（99.90%，南京特种气体有限公司，中国）置换等体积系统内上覆气体，于30℃恒温培养箱振荡培养（150 r/min）。如此构建21个相同的模拟水体微生态系统。

1.2 17β-雌二醇污染与样品采集方案

将上述21个模拟微生态系统随机分为7组，每组各设3个平行实验。分别向各组注入1 mL不同浓度的17β-雌二醇溶液，使各体系17β-雌二醇的添加质量浓度分别为 0，2000.00，4000.00 ，6000.00，8000.00， 10000.00，12000.00 ng/L。 继续恒温振荡培养。

从污染前24 h开始，每隔24 h分别用注射器采集各体系上覆气体样品10 mL，用气相色谱仪（Agilent，USA）分析其中甲烷的浓度，分析各实验组的甲烷氧化速率。然后，在无菌操作台中振荡混匀各体系，立刻采集混匀的泥水混合样品5 mL，8000 r/min离心弃上清液后置于-80℃冰箱中保存待测。如此连续采样9次。

1.3 样品DNA提取和PCR扩增

从24 h的DGGE图谱中可以看出各个泳道的条带数目在12～18这一范围内变化，且随着浓度的变化，条带的数目与亮度均未呈现出规律性的变化。其泳道之间的平均相似度为73%，见图5。

从质量浓度为2000和10000 ng/L的DGGE图谱中可以看出这2个污染浓度所有泳道的条带数目均在15～17之间变化。但是2000 ng/L污染质量浓度随着时间的增长，条带的亮度并未发生明显的变化。其相似性分析结果也表明各个泳道之间的相似度较高，平均相似度大于80%。而10000 ng/L污染质量浓度随着时间的增长各泳道中的条带的数目与亮度发生了规律性的变化，其中条带2，8，21，23总体上由亮变暗甚至消失，而条带13，16，17，19总体上由暗变亮逐渐增强且其聚类分析结果表明了污染前与染毒后48 h是一类，染毒后24 h是一类，其他时间是一类。其相似性分析结果表明各个泳道之间的平均相似度为68%，见图3和图4。

1.4 DGGE及其图谱分析

（1）从浓度效应分析，24 h时的DGGE图谱以及软件分析结果中可以看出甲烷氧化菌的生物量及其种群结构变化较为复杂，并未发生规律性的演替。但是24 h时各实验组微生物甲烷氧化速率与17β-雌二醇污染浓度之间却呈现显著地线性负相关，因此认为17β-雌二醇的加入对水体微生物的群体活性具有一定的刺激作用，使甲烷氧化菌的生存环境发生了改变，染毒后的前24 h，甲烷氧化菌还未适应被不同浓度17β-雌二醇污染的生存环境，属于微生物的应激反应，且其响应程度与17β-雌二醇污染浓度线性相关，从而降低了水体微生物对甲烷氧化功能。

1.5 割胶回收、测序

割胶回收并纯化DGGE凝胶中特异性条带，单独存储于1.5 mL试管中，加入35 mL的TE缓冲液，在4℃下过夜。然后对含有目标DNA的缓冲液进行PCR扩增、纯化并通过ABI3730XL DNA分析仪（Applied Biosystems公司，美国）进行测序。

1.6 数据处理与分析

采用Microsoft Excel 2014软件对本研究的数据进行统计学处理，并使用OriginPro 8绘制相应图表。

2 结果与分析

2.1 17β-雌二醇污染前土壤微生物均一性检验

17β-雌二醇染毒前3 d，各体系CO2产生速率算术平均值在 1.45 ～ 1.64 μg/（g·h）之间，其标准方差为0.086。对染毒前土壤细菌DGGE条带分析，其香农-威纳指数在1.90～2.12之间，丰富度指数在14～17之间，Pielou均匀度指数在0.69～0.79之间。由此可知，在雌二醇污染前各实验体系微生物种群结构、生命活动稳定，具有良好的均一性。

2.2 17β-雌二醇污染影响水体微生物甲烷氧化功能的浓度效应

一般认为，水体微生物的甲烷氧化功能的强弱主要取决于2方面：一是甲烷氧化菌的生物量及其种群结构；二是甲烷氧化菌及其酶的活性。

  

图1 17β-雌二醇污染对水体微生物甲烷氧化功能影响的浓度效应

进一步分析表明，当17β-雌二醇污染质量浓度在4000～12000 ng/L时，水体微生物甲烷氧化速率与雌二醇污染浓度之间存在显著性负相关，R2在0.85～0.88之间。值得关注的是，当17β-雌二醇污染质量浓度为2000 ng/L（24～192 h）对水体微生物甲烷氧化功能存在显著性促进作用，而当17β-雌二醇污染质量浓度为4000 ng/L（24～72 h）时却存在显著性抑制作用，其机理尚不清楚，有待于进一步研究。

2.3 17β-雌二醇污染对水体微生物甲烷氧化功能影响的时间效应

对比两组患者干预前后的生活质量评分与肢体功能评分。其中生活质量评分依据为脑卒中专门化生活质量表，肢体功能评分依据为Fugl-Meyer评分量表。两个量表均为得分越高，质量越高。

  

图2 17β-雌二醇污染对水体微生物甲烷氧化功能影响的时间效应

2.4 17β-雌二醇污染影响水体底泥中II型甲烷氧化菌种群演替的DGGE指纹分析

基于上述结果，本研究选择17β-雌二醇添加质量浓度为 2000 ng/L（促进效应），10000 ng/L（抑制效应）2个实验组，分别采用PCR-DGGE的方法分析雌二醇污染对体系中II型甲烷氧化菌种群演替的影响。DGGE图谱及其Quantity One 1-D v4.6软件分析结果分别见图3和图4。

其中，PCR 反应体系为 50 μL， 包括 1 μL DNA模板，5μL 10×PCR buffer，1.4μL 2.5mmol/LdNTP，3 μL MgCl2，1 μL 25 μmol/L 533f-Am976 引物（533f： 5’-GTG CCA GCA GCC GCG GTA A-3’，Am976： 5’-GTC AAA AGC TGG TAA GGT YC-3’，上海生物工程技术有限公司， 中国），0.6 μL Taq 酶（Takara TaqTM）和水。PCR反应程序：95℃4min预变性；95℃60 s变性、60℃降到50℃60 s（每次循环降0.5℃）退火、72℃1.5 min延伸共20个循环；95℃60 s变性、50℃60 s退火、72℃1.5 min延伸共12个循环；72℃10 min延伸。

  

图3 2000 ng·L-1的17β-雌二醇染毒后的DGGE电泳、聚类分析及相似性分析

 

注：泳道1～9分别对应17β-雌二醇质量浓度为2000 ng·L-1的土样中未染毒，染毒后 24，48，72，96，120，144，168，192。

  

图4 10000 ng·L-1的17β-雌二醇染毒的DGGE电泳、聚类分析及相似性分析

 

注：泳道1～9分别对应17β-雌二醇浓度为10000 ng·L-1的土样中未染毒，染毒后 24，48，72，96，120，144，168，192。

采用 Fast DNASpin Kit for Soil（MP 公司，USA）提取各土样总DNA。选择533f-Am976为引物，PCR扩增各体系中Ⅱ型甲烷氧化菌的甲烷单加氧酶的部分特异性编码基因[15]。以DGGE电泳并进行功能基因多样性分析。

践行“四个最严”，推进重防、重律、重惩的监管新常态。全力推进全市学校食堂实施食材统一配送，建立一整套食材从基地到学生餐桌的管理办法与机制。严把农产品第一关，产地准出与市场准入无缝衔接。组建全省首家市级食品药品检验检测中心，全部基层所建立快检实验室，实现食品药品全抽检覆盖。实施供给侧3年提升工程，以餐饮“明厨亮灶”及食品药品经营规范化管理为重点，以农产品放心基地、放心市场等九项工作为载体，开展食品药品安全百姓放心单位示范创建。市县同步开展“放心使命天剑系列行动”，精准实施行政处罚，行政诉讼“零”发生。

  

图5 24 h时各浓度17β-雌二醇染毒后的DGGE电泳、聚类分析及相似性分析

 

注：泳道1～7分别对应24 h时17β-雌二醇质量浓度为0，2000，4000，6000，8000，10000，12000 ng·L-1的土样。

3 讨论

各时间段17β-雌二醇污染对水体微生物甲烷氧化功能影响的浓度效应见图1。由图1可知，17β-雌二醇污染后的前24 h各污染组水体微生物甲烷氧化速率均受到显著性（或极显著性）抑制作用，且呈现明显的剂量效应关系（R2＝0.9525）；在24～192 h，17β-雌二醇污染对水体微生物甲烷氧化活性影响的浓度效应趋势基本一致，即当17β-雌二醇质量浓度为2000 ng/L时,对水体微生物的甲烷氧化速率存在显著的促进作用；而当17β-雌二醇质量浓度为4000～12000 ng/L时，甲烷氧化速率随17β-雌二醇浓度的升高而降低，并趋于一恒定值。

有研究表明，在好氧条件下，湖泊底泥在前24 h对17β-雌二醇的分解较为旺盛[16]，但要使初始质量浓度为1000 ng/L的雌二醇的雌激素总体效应降低95%以上，即使在最佳试验条件下，雌二醇高效降解菌株也需要15 d才可以完成[17]。因此我们认为在染毒后的前24 h，17β-雌二醇会有一定的分解，但实验结束后体系中仍有大量残留的未被分解17β-雌二醇。

研究区出露地层为长城系星星峡岩群、下泥盆统阿尔彼什麦布拉克组、中泥盆统阿拉塔格组、下石炭统甘草湖组和第四系[9](图1b)。侵入岩主要为华力西中期晚石炭世花岗岩[10]。区内断裂构造极为发育，主要断裂阿其克库都克断裂、卡瓦布拉克断裂为NW—SE向，次级断裂多为NE—SW向分布。

结合本实验17β-雌二醇污染对水体微生物甲烷氧化功能的影响规律及其生态学机理的研究结果分析。

采用 D-code System（Bio-Rad，USA）对 PCR 扩增产物进行变性梯度凝胶电泳分析。其中，聚丙烯酰胺凝胶质量分数为6%，变性梯度范围为45%～60%。在60℃，80 V下电泳12 h。电泳凝胶以采用1∶5000（V/V）Gel-Red避光染色 20 min后，用凝胶成像系统（Bio-Rad，USA）观察，拍照。 以 Quantity One 1-D v4.6软件（Bio-Rad，USA）对 DGGE 图谱进行指纹分析。

本研究有以下优势：①所有Meta分析存在发表偏倚的可能性低，总体质量与可信度高。②评价员全面检索并分析，纳入研究的数据涵盖7个国家和地区，包括亚洲人和欧洲人在内，所以荟萃分析的结果适用于东西方国家。③纳入的研究均属于高质量的病例对照研究，减少了干预措施不一致所造成的干扰。然而，由于纳入的不同研究使用了不同抗体和不同版本的TNM分型，且NSCLC患者的组织学类型也不同，导致许多研究的异质性较大，希望今后可通过更加统一的、样本量更大的Meta分析进行进一步探讨。

将不同浓度17β-雌二醇污染组微生物的甲烷氧化速率与对照组相比，分析17β-雌二醇污染影响水体微生物甲烷氧化活性的时间效应，结果见图2。由图2可知，各雌二醇污染组在染毒后24 h甲烷氧化速率均受到显著抑制，处于最低点，而后所有浓度组甲烷氧化速率均有所回升，并各自趋于一稳定值。此稳定值存在组间差异。进一步分析表明，17β-雌二醇污染质量浓度为2000 ng/L的体系甲烷氧化速率的增值最终稳定在0以上，说明该浓度的17β-雌二醇污染促进了甲烷的氧化；其余大于该污染浓度体系甲烷氧化速率的增加值最终均稳定在0以下，说明该浓度的17β-雌二醇污染抑制了体系微生物的甲烷氧化功能，且抑制程度存在明显的剂量效应关系。

（2）从时间效应分析，2000，4000ng/L污染质量浓度甲烷氧化速率平稳增加，最终稳定；6000，8000，10000，12000 ng/L污染质量浓度甲烷氧化速率均在48 h达到顶峰，后均回落，最终稳定。这一现象是由于染毒后的前24 h，17β-雌二醇分解，24 h时中间代谢产物浓度达到顶峰，为甲烷氧化菌提供了充足的C源，促进了甲烷氧化菌的生长，增加了甲烷氧化菌的生物量，从而提高了甲烷氧化的速率。再结合其DGGE结果分析，2000 ng/L污染质量浓度的DGGE图中可以看出0，24，48 h这3个泳道中条带的数目和亮度未发生明显变化，说明甲烷氧化菌的生物量及其种群结构并未发生明显变化，而10000 ng/L污染质量浓度的DGGE图中可以看出0，24，48 h这3个泳道部分条带的亮度先变暗后变亮，说明甲烷氧化菌的生物量先变少，后变多。且其聚类分析结果也说明了染毒后48 h时的甲烷氧化菌的生物量及其种群结构与染毒前较为接近，甲烷氧化菌的生物量较24 h有所回升。因此48 h时甲烷氧化速率提高，形成了峰，之后17β-雌二醇中间代谢产物消耗殆尽，甲烷氧化速率又有所回落，并趋于稳定。这也与气象色谱所反映的结果相同。由于2000，4000 ng/L污染质量浓度低，中间代谢产物量较少，因此没有在48 h 形成峰，而 6000，8000，10000，12000 ng/L 的污染浓度高，中间代谢产物量较多，因此在48 h形成峰。之后，体系的甲烷氧化速率稳定，表现出2000 ng/L促进，4000～12000 ng/L抑制。而从总体上看，2000 ng/L的DGGE图谱中各泳道条带的数目和亮度未发生明显变化，因此甲烷氧化菌的生物量及其种群结构的影响并非决定性因素，从而推测出2000 ng/L污染质量浓度甲烷的氧化得到促进是由于该浓度的污染提高了甲烷单加氧酶的活性。而10000 ng/L的DGGE图谱中各泳道中条带的规律性变化表明该污染浓度甲烷的氧化受到抑制可能是由于甲烷氧化菌种群结构的改变、甲烷单加氧酶的活性受到抑制其中的一种因素或者二者共同作用所导致。

项目总预算约18.83亿元（其中中央财政约占64.9%，地方预算约占35.1%），按照3年基本建成、5年基本完善的原则安排进度。

4 结论

在本实验的研究浓度和时间范围内，不同浓度的17β-雌二醇污染对于甲烷氧化速率及甲烷氧化菌的种群结构演替确实存在着规律性的影响。根据实验结果，做出了以下结论。

截至目前，该县共有7933名农村党员参与到“共产党员示范林”创建活动中来，栽植山楂、苹果、柳树、油松、榆叶梅等14种苗木43816棵，绿化面积约758亩。从今年开始，该县将通过“国土绿化三年行动”，带动全社会力量再植树100万亩，使全县生态覆盖率达到60%以上。

（1）17β-雌二醇污染质量浓度为 2000 ng/L，可提高甲烷单加氧酶的活性，对于甲烷氧化速率具有一定的促进作用，而17β-雌二醇污染质量浓度在4000～12000 ng/L时，由于甲烷氧化菌种群结构的改变、甲烷单加氧酶的活性受到抑制其中的一种因素或者二者共同作用，导致其对甲烷氧化速率具有一定的抑制作用，且其抑制作用与污染浓度存在正线性相关。

（2）各污染浓度，在24 h时微生物均出现了应激反应，对甲烷氧化的速率产生了抑制，而后所有浓度组甲烷氧化速率均有所回升，最后趋于稳定，且最终的稳定值也与17β-雌二醇污染浓度呈现剂量抑制效应。

（3）在不同的污染浓度下，污染浓度越高，污染时间越长，17β-雌二醇对于甲烷氧化菌种群结构的影响越明显。

在希拉里的败选演讲中，希拉里作为演讲者对于语气表达的选择并不一定需要遵循一致式，如果能巧妙使用语气隐喻式的表达，那对于演讲者来说无疑是更有利的。在希拉里的这篇演讲者中所使用的皆为陈述语气和祈使语气，没有用到疑问语气。因此，本文将主要从陈述语气隐喻和祈使语气隐喻两个角度来探析希拉里的这篇败选演讲。

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