入侵植物光梗蒺藜草ISSR遗传多样性分析
光梗蒺藜草(Cenchrus calyculatus)是禾本科蒺藜草属,又名疏花蒺藜草、少花蒺藜草、草狗子、草蒺藜,1年生旱生草本植物,原产于北美洲和热带沿海地区[1]。光梗蒺藜草标本最早采集于1979年辽宁省,目前在我国吉林、内蒙古、北京、福建、台湾、广东、香港、广西、云南、河北等省市区都有分布[2],但只有在内蒙古通辽和赤峰部分旗县演变为入侵植物种。在入侵地,光梗蒺藜草不但繁殖能力强,而且有耐旱、耐贫瘠、抗寒等适应性能力[3],因此具有极强的生命力。入侵后极易形成单优势种群落[4],不仅使草场牧草品质下降[5],严重地破坏当地的生态环境和生物多样性[6];又因其成熟颖果外带坚硬的刺苞,给当地人们的农事生产活动及畜牧业生产带来很大的危害[7]。2005年,光梗蒺藜草被国家林业局列为危险性林业有害生物(林业有害生物警示通报2005第2号)[8]。有关光梗蒺藜草的研究,目前主要集中于光梗蒺藜草的种子特性、开花结实习性[9-11]、入侵机制、防控措施、化感作用等方面[12-14],未涉及其遗传多样性的研究。随着分子标记技术的发展,ISSR已被广泛应用于外来入侵植物遗传多样性的研究。ISSR技术一个显著优点是不需预知被研究物种的基因组信息,有通用引物可供筛选使用,在其他外来入侵植物研究中有大量成功应用[15-17]。本研究采用ISSR分子标记技术对内蒙古地区的光梗蒺藜草14个种群进行遗传多样性及遗传分化分析,旨在揭示光梗蒺藜草的遗传多样性水平,种群间和种群内的遗传分化程度和基因流,并据此分析其遗传结构的形成原因,进而探讨光梗蒺藜草的入侵机制并为其管理和防除措施的确立提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
光梗蒺藜草采集于内蒙古通辽市和赤峰市,共计14个种群,285个样本,采集信息详见表1。材料采集后用变色硅胶迅速干燥带回实验室,常温下保存。
表1 光梗蒺藜草种群采样地信息Tab.1 Informations of sampling site of Cenchrus calyculatus population
种群编号采样地数量生境纬度/°经度/°1A通辽科左中旗前枕头村20玉米田边44.13123.322A通辽科左后旗哈伦胡顿20公路边42.94122.353A通辽科左后旗哈伦胡顿20沙地边缘42.94122.354A通辽科左后旗哈伦胡顿20农场42.94122.355A通辽科左后旗哈伦胡顿20沙地边缘42.94122.356A通辽科左后旗甘旗卡扶贫楼吉祥人家小区2042.97122.347A通辽科左后旗甘旗卡20公路边42.97122.348A通辽科左后旗甘旗卡满斗嘠查2242.95122.349A通辽科左后旗甘旗卡满斗嘠查21豆田与反枝苋混生42.95122.3410A通辽奈曼旗大沁他拉镇劳代三村21玉米田旁42.85120.6611A通辽奈曼旗大沁他拉镇劳代三村20玉米田42.85120.6612A通辽奈曼旗大沁他拉镇劳代三村2042.85120.6613A赤峰敖汉旗长胜镇北山根村20本村42.84120.1914A赤峰敖汉旗长胜镇北山根村21玉米田边42.84120.19
1.2 研究方法
1.2.1 模板DNA的制备
采用TaKaRa的植物基因组DNA小量纯化试剂盒,从光梗蒺藜草的成熟叶片中提取DNA,操作按说明书进行。
以精神科护士遭受暴力种类、暴力发生频次、暴力应对方式、医院态度等作为自变量,以护士职业倦怠3个维度分别作为应变量,进行多元线性回归分析,分析结果见表5~表7。
1.2.2 ISSR引物的选择、合成与筛选
中国梦涵盖了三个层面的内容,即国家富强、民族振兴、人民幸福。人民幸福是中国共产党的初心和使命,也是习近平幸福观的重要体现,同时,中华民族伟大复兴的中国梦也需要每个人脚踏实地、拼搏进取,依靠自己的双手去实现。
表2 不同引物序列及退火温度Tab.2 Different primer sequence and annealing temperature
引物编号引物序列(5′-3′)退火温度/℃816CACACACACACACACAT52827ACACACACACACACACG48849GTGTGTGTGTGTGTGTYA53855ACACACACACACACACYT53
1.2.4 PCR扩增产物检测
PCR扩增反应体系25 μL含:0.5 μL的DNA模板,12.5 μL的PCR mix(Takara Premix Tap Version 2.0) ,1 μL(100 μm)引物,11 μL无菌双蒸水。PCR扩增程序为94℃预变性5 min,94℃变性30 s,52℃复性30 s(根据引物的退火温度不同设定不同的复性温度),72℃延伸90 s,38~40个循环,72℃延伸10 min;4℃保存。
1.2.3 ISSR反应建立
扩增产物在含有EB的2%的琼脂糖凝胶中电泳,电泳缓冲液为0.5×TAE,以DL2000(Takara)作为标准分子量对照,电压90 V,电泳50 min。电泳凝胶在紫外灯下观察,拍照记录。
利用4条ISSR引物对14个光梗蒺藜草地理种群扩增,共扩增出393条带,其中多态性条带289条,各个种群多态位点百分比(PPL)变化范围34.84%~83.78%,平均为55.57%,其中以赤峰敖汉旗长胜镇北山根村(13A)最低,以通辽科左中旗前枕头村(1A)、通辽科左后旗甘旗卡满斗嘠查(9A)最高。各个种群的基因多样性指数(H)的变化范围为0.1222~0.3343,平均为0.2054。Shannon (I) 变化范围是0.1938~0.4991,平均为0.3209(表3)。
1.2.4 统计学方法:采用 SPSS 18.0 (SPSS Inc. USA) 软件完成统计学处理,所有计量资料以±s表示,采用独立样本t检验进行差异性分析;P<0.05 为差异有统计学意义。
(1)强调团队协作,营造和谐氛围,保证职责分明而不影响亲和力,确保全体员工均能全身心投入。首先,应形成良好的合作意识,保证日常住宿与饮食,并提高自身责任心,同时,在不影响日常工作的基础上,丰富业余生活,以此进一步提高凝聚力。
2 结果与分析
2.1 ISSR-PCR扩增结果
利用筛选出的4条ISSR引物对每个地理种群内的光梗蒺藜草的DNA样本进行扩增,扩增片段大小在400~2 000 bp,引物849对光梗蒺藜草部分样本ISSR扩增结果见图1。
他突然想到了什么。是的,现实之痛。就是这四个字。在这座生活了三十多年的城市里,在这家比邻他居住的小区的酒店内,一个熟人若是突然出现在他面前,你真的能够毫不慌乱坦然面对?你怎么能够解释得了,为什么要出现在酒店?何况,身边陪着的一个女人?一个成熟的有着一双美目的漂亮女人?
图1 引物849对光梗蒺藜草部分样品ISSR扩增结果Fig.1 The ISSR amplified results of primer 849 on some samples of Cenchrus calyculatus
2.2 遗传多样性
1.2.5 数据统计
表3 基于ISSR标记的不同光梗蒺藜草种群遗传多样性Tab.3 Genetic diversity of different Cenchrus calyculatus populations based on ISSR marker
种群编号NaNeHIPPL1A1.91181.40300.26100.411483.78%2A1.74071.30770.19740.313354.05%3A1.48151.19670.12220.193835.14%4A1.74071.32130.19540.306854.05%5A1.57141.32900.18980.284943.24%6A1.73331.35540.22220.344659.40%7A1.73081.28160.19400.313451.35%8A1.78571.37210.22680.352059.46%9A1.91181.55910.33430.499183.78%10A1.71431.33320.20110.313054.05%11A1.69231.21930.14650.243548.65%12A1.85191.30840.20310.330762.16%13A1.56001.28380.16620.254534.84%14A1.76921.34940.21630.331654.05%平均1.72851.33000.20540.320955.58%
注:Na-观察等位基因数;Ne-有效等位基因数;H-Nei基因多样性指数;I-Shannon信息指数;PPL-多态位点百分比.
2.3 种群间遗传分化
利用POPGENE 32软件分析,14个光梗蒺藜草地理种群总遗传变异Ht=0.3446,种群内遗传变异Hs=0.2205,种群间遗传分化系数Gst=0.3600,表明36%的遗传变异发生在种群间,64%的遗传变异发生在种群内,种群间遗传分化程度较高。种群间的基因流Nm=0.8889(表4)。
对照反应物在凝胶图谱上的位置,将PCR条带转为二进制数据,即有带记为“1”(包括模糊带),无带记为“0”,形成ISSR分析的原始数据矩阵。采用POPGENE 32软件计算遗传参数,包括多态位点百分比、Nei基因多样性指数(H)等。根据Nei遗传距离,利用NTSYS 2.1对14个种群的光梗蒺藜草地理种群进行非加权算数平均法聚类分析(UPGMA);利用Structure软件做遗传结构分析;利用MVSP做主成分分析;利用TFPGA软件对遗传距离与地理距离的相关性进行Mantel检验。
表4 光梗蒺藜草种群遗传分化Tab.4 Genetic differentiation of Cenchrus calyculatus populations
HtHsGstNm0.34460.22050.36000.8889
注:Ht-总的基因多样性;Hs-种群内的基因多样性;Gst-遗传分化系数;Nm-基因流.
2.4 种群间遗传结构
为进一步探讨内蒙古地区光梗蒺藜草群体间的遗传关系,利用Structure软件进行群体遗传结构分析。结果表明,ΔK=3时具有明显峰值(图2),因此将内蒙古地区的光梗蒺藜草划分为3个类群,绘制出供试品种群体遗传结构图(图3)。3个类群的固定指数依次为0.3336、0.6856、0.1421均大于0.05说明3个类群均能独立成群。第1个亚群通辽科左中旗(1A)、后旗(9A)2个种群;第2个亚群通辽科左后旗(3A、4A、5A、6A)4个种群、奈曼旗(10A、12A)2个种群、赤峰敖汉旗(13A、14A)2个种群;第3个亚群通辽科左后旗(2A)、通辽科左后旗甘旗卡(7A、8A)2个种群、通辽奈曼旗(11A)。分类结果与聚类分析和主成分分析结果有所差异,其中第2类群和第3类群个体材料有部分重叠,所属类群界限不明确。对285份光梗蒺藜草个体的Q值进行统计分析,有265个(93.0%)单株遗传组分相对单一(Q>0.6),并被划分到相应的3个类群中。其中Q值大于0.8和0.9的材料占有率为14.0%和60.7%,说明各个群体中有部分其他类群的遗传成分。
表5 光梗蒺藜草的遗传一致度(对角线以上)与遗传距离(对角线以下)Tab.5 Genetic identity (above the diagonal) and genetic distance (below the diagonal) of Cenchrus calyculatus
种群编号1A2A3A4A5A6A7A8A9A10A11A12A13A14A1A∗∗∗0.65000.58400.59840.65500.73320.58560.64870.87000.59110.54360.62270.60290.61722A0.4308∗∗∗0.80070.73720.77560.86870.77230.90030.76570.87060.70400.82740.81490.78473A0.53790.2223∗∗∗0.83220.84790.80410.73590.78090.63330.85140.70730.75510.81490.80334A0.51380.30490.1837∗∗∗0.83460.78690.75950.78840.67600.74680.90640.79110.85090.84715A0.42310.25410.16500.1808∗∗∗0.80430.72930.80840.71310.75340.73610.76520.82010.83346A0.31040.14070.21800.23970.2178∗∗∗0.66140.83620.81480.79420.71510.74710.73630.75057A0.53510.25840.30670.27510.31560.4134∗∗∗0.72670.65410.78810.67550.77000.84860.78008A0.43280.10500.24740.23770.21270.17890.3193∗∗∗0.73930.81990.75830.74170.75510.78229A0.13930.26700.45680.39150.33810.20490.42450.3020∗∗∗0.69810.68000.67910.68520.709210A0.52580.13860.16090.29190.28320.23040.23820.19860.3594∗∗∗0.65840.83620.87120.827611A0.60950.35100.34630.09830.30620.33540.39220.27670.38570.4179∗∗∗0.72360.78790.758812A0.47370.18950.28090.23430.26760.29160.26140.29880.38700.17890.3235∗∗∗0.89480.903413A0.50600.20470.16260.16150.19830.30610.16420.28090.37800.13780.23840.1111∗∗∗0.905914A0.48260.24520.21900.16600.18220.28710.24840.24560.34360.18920.27600.10160.0988∗∗∗
POPGENE 32软件计算结果(表5)可知,14个种群的平均遗传一致度为0.7452,平均遗传距离为0.2564。其中通辽科左中旗前枕头村(1A)和通辽奈曼旗大沁他拉镇劳代三村(11A)遗传一致度最小为0.5436,通辽科左后旗哈伦胡顿(4A)和通辽奈曼旗大沁他拉镇劳代三村(11A)遗传一致度最大为0.9064;通辽科左后旗哈伦胡顿(4A)和通辽奈曼旗大沁他拉镇劳代三村(11A)遗传距离最小为0.0983;通辽科左中旗前枕头村(1A)和通辽奈曼旗大沁他拉镇劳代三村(11A)遗传距离最大为0.6095。14个光梗蒺藜草的遗传相似度和遗传距离见表5。
选取同亚族植物狼牙草[18-20]使用的29条扩增效果良好的引物交由北京华大基因科技有限公司合成。基于“带行清晰、可辨、重复性好”的原则筛选出4条引物作为本实验用于遗传多样性的研究。引物退火温度见表2。
图2 利用ΔK推断参试材料的合理组群划分Fig.2 The rational group division of test materials judged with ΔK
注:图中灰、灰白和黑色分别代表类群Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ;相同的颜色代表同一个类群.图3 基于Structure分析的光梗蒺藜草14个种群的遗传结构Fig.3 Genetic structure of 14 populations of Cenchrus calyculatus based on Structure analysis
2.5 聚类分析
进一步用NTSYS 2.1软件计算不同种群之间的遗传相似性系数,得到UPGMA聚类图(图4)。大致可将14个种群分为三大类,第Ⅰ类科左中旗(1A)、后旗(9A)2个种群;第Ⅱ类通辽科左后旗(2A、3A、4A、5A、6A、8A)6个种群、奈曼旗(10A、11A、12A)3个种群、赤峰敖汉旗(13A、14A)2个种群;第Ⅲ类通辽科左后旗甘旗卡种群(7A)。
图4 14个光梗蒺藜草种群基于Nei的遗传相似度的UPGMA聚类图Fig.4 UPGMA cluster graph of genetic similarity based on Nei of 14 populations of Cenchrus calyculatus
2.6 主坐标分析
利用软件MVSP对光梗蒺藜草材料进行分类(图5),共分为3组,此结果与基于Nei的遗传相似度的UPGMA聚类结果一致。第1组通辽科左中旗(1A)、后旗(9A)2个种群;第2组通辽科左后旗(2A、3A、4A、5A、6A、8A)6个种群、奈曼旗(10A、11A、12A)3个种群、赤峰敖汉旗(13A、14A)2个种群;第3组通辽科左后旗甘旗卡种群(7A)。
图5 285份光梗蒺藜草ISSR标记主坐标分析图Fig.5 Principal coordinate analysis chart for 285 ISSR markers of Cenchrus calyculatus
2.7 Mantel检测
利用软件TFPGA进行光梗蒺藜草种群地理距离和遗传距离的检测(图6),得出地理距离和遗传距离有一定的相关性但不显著(r=0.4511,p=0.5030)。
图6 光梗蒺藜草种群地理距离和遗传距离的Mantel检测Fig.6 Mantel test on geographic distance and genetic distance of Cenchrus calyculatus populations
3 讨论与结论
3.1 光梗蒺藜草遗传多样性
基于多态位点百分率和Shannon多样性指数评价光梗蒺藜草供试种群的遗传多样性高低。利用ISSR标记技术在不同入侵杂草植物的研究表明,中国入侵植物薇甘菊在物种水平的遗传多样性为60.23%[21],黄顶菊的PPL为72.22%[22],入侵杂草一年蓬的遗传多样性PPL为84.49%[23],紫茎泽兰的PPL为69.2%[24]。本研究表明,光梗蒺藜草在物种水平上具有较高的遗传多样性,其PPL平均为55.58%,基因多样性指数(H)平均为0.2054,Shannon指数(I)平均为0.3209。一个物种遗传多样性越高,其适应环境变化能力越强,能够快速进化适应新环境并扩展其分布范围[25]。Pappert 等认为导致入侵植物种群内高的遗传多样性的可能性有以下两个方面:一是现有杂草可能由多个不同来源的个体所建立,因此能保持较高的遗传多样性水平;二是一些杂草种群可能是由少数奠基者个体所建立,在植物种群发育的阶段中,由于花粉流、幼苗更新等可以引入额外的基因,从而导致种群具有高的遗传多样性。本文所研究光梗蒺藜草种子成熟后具刺总苞与小穗一起脱落,可借刺苞由动物或人等携带并广为传播[26],特别是刺苞附着在牲畜身上,随着牲畜放牧和流转[27]造成光梗蒺藜草反复入侵,从而使其具有较高的遗传多样性。
现阶段,各大高校始终将科学研究作为评价教师教育教学成果的主要内容,所以,很多高校教师通过减少专业课教学量来腾挪出大量时间供自己进行科学研究工作。虽然大部分教师比较认可科学研究工作的重要性,但专业课教育教学质量问题仍然是高等教育的不足之处。随着高等教育的逐步大众化,社会各界更加关注各专业教师的教学量以及教学质量。在供给侧结构性改革的形势下,各行各业对人才素质以及人才种类的需求出现了很大变化,这要求高校必须不断增强为国家创新驱动发展服务的能力。
教师专业化是教学达到目标的基本前提。思想品德课和政治课教学教师应具备从事本学科的专业知识和专业技能。要严把资质关,不是什么人都能教授这门课。
3.2 光梗蒺藜草的遗传结构
光梗蒺藜草种群间遗传分化系数Gst为0.3600,表明光梗蒺藜草种群间存在较高的遗传分化,且遗传变异大部分来源于种群内。这样的遗传结构与入侵海南和广东的假臭草种群的遗传结构相似[28]。由于外来物种不同种群的建群个体所携带的基因子集不同,入侵物种本身具有一定的遗传分化,光梗蒺藜草在入侵过程中由于其入侵方式导致种群定居和反复传播,同一个光梗蒺藜草的地理种群可能是由不同来源的不同个体组成,种群遗传分化较高。Baackd等[29]认为,不同遗传世系的个体的混和组成的入侵种群可通过杂交、基因渗入等产生新的基因型,而导致种群分化。同时,不同生境下的光梗蒺藜草由于选择压力的不同也会产生新的性状,进一步加剧了光梗蒺藜草地理种群的遗传分化。光梗蒺藜草种群间的基因流Nm为0.8889,一般认为,种群基因流>1时,可发挥均质作用,基因流<1时,则会突显遗传漂变作用加剧种群间的遗传分化[30]。光梗蒺藜草种群的基因流较小,这与其种群间遗传分化较高的结果一致。经过Mantel检测光梗蒺藜草种群间的遗传距离和地理距离之间存在一定的相关性但不显著(r=0.4511,p=0.5030),这可能与光梗蒺藜草的扩散方式有关。UPGMA聚类分析和遗传距离分析结果表明,光梗蒺藜草种群间的遗传距离较大(0.0983~0.6095),平均为0.2564。这可能从另一个侧面反映了光梗蒺藜草遗传基础较高,本研究得出的光梗蒺藜草的种群基因多样性较高(Ht=0.3446)也印证了此点。推测光梗蒺藜草整个物种较高的遗传基础和较小的基因流导致了其种群间的遗传距离较大和较高的遗传分化。光梗蒺藜草是恶性杂草,杂草化的植物一般都具有较宽的生理生态耐受性或可塑性[31];又有强大的种子库,种子具有顽强的生命力[32];同时具有较高的遗传多样性,这些条件促使光梗蒺藜草在入侵成功后能迅速地成为当地优势种群。
本研究中通过NTSYS 2.1和MVSP软件基于遗传相似系数将14个种群285份材料进行聚类,分成三大类,分别包括41、224和20 份材料,而Structure的群体遗传结构分析表明,这些材料分为3个亚群,分别包括41、182 和82 份材料,两者结果差异较大。聚类分析所依据是材料相互间的遗传相似系数,反映的是它们亲缘关系的远近,在进行类群划分时,人为主观因素对GS水平的选择影响较大;而群体遗传结构分析以亚群是否达到哈德温伯格平衡建立的数学模型进行聚类划分,计算材料相应的Q值即第i材料基因组变异源于第k群体的概率[33]。因此通过Structure软件分析,校正了285份亲本材料所存在的群体结构,可以避免人为因素对类群划分的影响,为后期关联分析奠定了基础。
本研究通过ISSR分子标记技术对光梗蒺藜草种群遗传多样性进行分析,但ISSR技术只能检测显性等位基因型。在今后的研究中可结合其他共显性分子标记技术如RFLP等进行分析,加以对比、相互补充更为准确。此外本研究只分析了内蒙古境内2个地区的光梗蒺藜草的遗传多样性水平,要真正揭示光梗蒺藜草作为入侵植物的一般遗传特征还需要研究更大范围更多数量的种群,今后的研究中应将全国范围内甚至原产地的光梗蒺藜草作为研究对象,查清光梗蒺藜草的入侵途径和历史,以期为光梗蒺藜草的防控提供基础。
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