纤维素(Cellulose)是一种具有良好生物相容性的可再生天然高分子材料，近年来广泛应用于生物材料领域[1-3]. 大豆分离蛋白(Soy protein isolate， SPI)是一种来源丰富的天然高分子植物蛋白质，具有很高的营养价值，近年来在生物医用材料方面的研究引起了广泛关注[4-6]. 前期的研究表明[7]，以纤维素和大豆分离蛋白为原料制备的复合膜材料具有较好的生物安全性和生物相容性，但其生物降解性有待进一步提高. 影响可生物降解材料降解性的因素主要包括内在因素和外在因素. 其中，内在因素包括材料的组成、结构以及材料的结晶状态；外在因素包括所处环境的温度、湿度、pH值以及时间等[8]. 本工作拟研究不同环境温度对纤维素/大豆分离蛋白复合膜体外降解性和生物相容性的影响，期望找到一种既能提高复合膜生物降解性、同时又能保持复合膜良好生物相容性的方法.

1 实验部分

1.1 原料和试剂

棉短绒(湖北，化纤集团)：粘均分子量(Mη)为1.01×105. 大豆分离蛋白(SPI，湖北，杜邦云梦公司)：平均分子量(Mw)为2.05×105. 棉短绒和SPI均在60℃下经真空干燥24 h后使用. DMEM培养基、胎牛血清(FBS)、3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)均购自Invitrogen公司(Gibco， USA). 小鼠成纤维细胞(L929)购自中国典型培养物保藏中心(CCTCC，湖北，武汉).

1.2 纤维素/大豆分离蛋白复合膜的制备

将纤维素和NaOH/尿素水溶液分别于-20℃冰箱内冷冻，当NaOH/尿素水溶液温度下降至-12℃时，将预冷的纤维素加入到NaOH/尿素水溶液中，并立即快速搅拌，得到纤维素溶液，于4℃下离心10 min脱气，离心力为7500 g. 同样，将SPI溶解于NaOH/尿素水溶液中，得到SPI溶液. 将纤维素溶液与SPI溶液按照一定比例共混，其中SPI固体含量的质量分数为30%. 共混物经搅拌混匀、离心脱气后，在玻璃板上流延、刮膜，并浸入5%醋酸水溶液凝固体系中凝固成型，5 min后取出即为纤维素/大豆分离蛋白复合膜(cellulose/soy protein isolate composite membrane，CSM)，流水漂洗备用. CSM经过紫外照射1 h后，分别置于37℃和80℃密封蒸馏水中10 d、20 d及30 d. 一定时间后，取出复合膜，清水漂洗，分别命名为：CSM-37℃-10 d、CSM-37℃-20 d、CSM-37℃-30 d 及CSM-80℃-10 d、CSM-80℃-20 d、CSM-80℃-30 d. 其中，CSM-0 d表示未经处理的原始膜.

1.3 纤维素/大豆分离蛋白复合膜结构与性能表征

根据ISO 527-3：1993测量标准，湿态的纤维素/大豆分离蛋白复合膜由CMT6503型万能电子试验机(深圳新三思试验设备公司)测定拉伸强度(σb，wet)和断裂伸长率(εb， wet)，拉伸速率为10 mm·min-1，平行测试3次以上，取平均值. 湿态的复合膜经液氮冷冻断裂，真空干燥、喷金、镀膜，由S-570型扫描电镜(SEM，Hitachi，Japan)观察其表面形貌结构. 干燥的复合膜由Lambda 25型紫外分光光度计(PE，USA)于280 nm处进行紫外光谱测定，平行测试3次以上，吸光度值取平均值.

1.金融结构通过技术创新影响产业升级的作用机制。张杰和刘志彪发现金融结构影响技术创新主要是通过影响实体企业的技术创新活动和高研发、高创新密度产业的金融资源配置来实现的，但是这种作用机制存在显著的阶段性和“门槛效应”。[10]Brown et al则通过分析欧洲高新企业R&D投入发现，金融市场主导的金融结构相对银行主导的金融结构在促进技术创新上更有优势。[11]

1.4 纤维素/大豆分离蛋白复合膜间接细胞培养实验(MTT法)

CSM浸提液的制备：根据ISO 10993-12：2002的标准[9]，样品质量(g)与浸提介质(mL)的比例为0.1 g/mL，取受试样品材料1 g，加10 mL无血清DMEM培养基，在37±1℃环境下浸提24 h，常温离心10 min，收集上清即为浸提液.

图2显示了在37℃和80℃两种降解温度下纤维素/大豆分离蛋白复合膜在波长280 nm处的吸光度值(A280)与不同降解时间之间的关系. 结果显示，在两种温度的水溶液环境中，复合膜A280值均比原始膜CSM-0 d低，且在37℃环境中，CSM的A280值比在80℃环境中A280值低. 到第30 d时，在37℃水溶液条件下，CSM的A280值为0.80；在80℃水溶液条件下，CSM的A280值为1.12，分别为原始膜A280值(1.62)的49%和69%.

细胞生长率(%)=Atest/Acontrol×100

图1示出在37℃和80℃两种水溶液环境中降解前后的纤维素/大豆分离蛋白复合膜(CSM)的拉伸强度(σb， wet)和断裂伸长率(εb， wet). 图1显示，未经处理的原始膜CSM-0 d的σb， wet及εb， wet值分别为16.79 MPa和41.64%，在37℃水溶液中降解10 d、20 d和30 d复合膜的σb， wet及εb， wet值分别为11.43 MPa、39.50%；9.37 MPa、31.80%和8.63 MPa、25.54%，而在80℃水溶液中降解10 d、20 d和30 d复合膜的σb， wet及εb， wet值分别为13.19 MPa、41.42%；12.63 MPa、39.75%和11.38 MPa、35.35%. 由上述实验结果可知，在37℃和80℃两种水溶液环境中复合膜各个时间段的σb， wet及εb， wet值均比未处理的原始膜低，而且随着时间的增加，σb， wet及εb， wet值都呈下降趋势；在37℃水溶液条件下，CSM的σb， wet及εb， wet值均比在80℃水溶液中CSM的σb， wet及εb， wet值低，但即使到第30 d时，37℃水溶液中CSM的σb， wet及εb， wet值仍为原始膜的51%和61%.

1.5 纤维素/大豆分离蛋白复合膜表面直接细胞培养实验

蛋白质在波长280 nm处有共轭双键的吸收峰[13]，SPI为植物蛋白质，复合膜中SPI含量越高，对紫外光的吸收越强，吸光度值(A280)就越高. 紫外光谱检测结果显示，在37℃水溶液环境中CSM的A280值均比在80℃水溶液环境中的A280值低，贮存30 d后，其A280值为原始膜的49%. 说明纤维素/大豆分离蛋白复合膜在37℃水溶液环境中SPI的降解速度明显高于在80℃水溶液环境中SPI的降解速度，与37℃水溶液环境中大部分微生物活性最强有关.

2 结果

2.1 降解温度对CSM力学性能的影响

 

其中，Atest代表CSM浸提液在570 nm处的A值，Acontrol代表对照组在570 nm处的A值.

2.2 降解温度对CSM 280 nm处吸光度的影响

  

图2 不同温度下CSM在水中降解0 d、10 d、20 d及30 d后吸光光度值(A280)

MTT实验[10]：选择对数生长期的L929细胞，用0.25%胰酶常规消化，调整细胞悬液浓度至6.0×104 cells/mL；然后将L929细胞悬液接种96孔板，每孔接种100 uL，再在对应每孔滴加含10%FBS的DMEM培养基100 uL，即每孔里面的液体总量最终为200 uL，FBS的最终浓度为5%；最后，将96孔板放入37℃、 5% CO2细胞培养箱中进行培养. 24 h后取出，用CSM浸提液190 uL、FBS 10 uL代替原来DMEM培养基，继续培养. 其中，以200 uL含5%FBS的DMEM培养基继续培养为对照组. 24 h后取出96孔板，在每孔滴加MTT溶液(5 mg/mL)，使MTT溶液的终浓度为0.5 mg/mL，培养4 h后，倒掉培养基，再在每孔滴加二甲基亚砜(DMSO)150 uL，震荡10 min，在酶联免疫检测仪(Tecan GENios，Austria)上检测波长570 nm处的吸光度值(A值). 细胞生长率按以下公式计算[11]：

2.3 降解温度对CSM表面形貌的影响

环境温度，是影响可生物降解材料生物降解性的外在因素之一，主要是由于自然界中大部分微生物如细菌、霉菌等的活性与周围环境温度有直接关系. 在一定的温度(20℃～40℃)范围内，随着温度的上升，微生物的代谢活动逐渐旺盛，生长加快，对生物材料的降解效果明显，而大部分微生物在37℃左右时活性最强，有利于促进生物材料的降解. 当温度继续上升到80℃左右时，细胞内物质如蛋白质、酶、核酸等逐渐变性失活，可能对生物材料的降解性造成不利的影响，因此，温度对微生物的生长以及材料的降解效果具有双重的影响. 纤维素/大豆分离蛋白复合膜中大豆分离蛋白是一种亲水性的植物蛋白质，容易在水中溶胀和降解. 从拉力测试结果可知，在37℃水溶液环境中CSM的σb，wet值和εb，wet值均比在80 ℃水溶液环境中的σb，wet值和εb，wet值低，但贮存30 d后，其σb，wet值和εb， wet值仍接近原始膜的一半以上，分别为原始膜的51%和61%. 说明在37℃水溶液环境中CSM降解的主要原因可能是在特定温度下细菌、霉菌等微生物对纤维素/大豆分离蛋白复合膜的降解所致[8]. 而在80℃水溶液环境中CSM降解的主要原因可能与复合膜中蛋白质的溶胀、溶解有关[12].

  

图3 不同温度下CSM在水中降解0 d、10 d、20 d及30 d后的SEM

2.4 MTT实验

“我喜欢这一段描述，言之有物。泪水和雨水的并置，有互文之美。S这次是真的恋爱了？讨厌他玩世不恭的嘴脸，但看来也有纯真的一面。有点喜欢他了。”

  

图4 不同温度下CSM在水中降解0 d、10 d、20 d及30 d后间接培养L929细胞的MTT结果

2.5 直接细胞培养实验

图5显示了不同降解温度下纤维素/大豆分离蛋白复合膜表面直接培养L929细胞的SEM. 由SEM结果可知，与对照组相比，L929细胞在未经处理的原始膜和经过不同温度处理后的复合膜表面均能正常生长，细胞形态正常，且细胞数量有所增加，但细胞量在原始膜和经过温度处理后的复合膜之间没有明显差别. 经过L929细胞直接培养后复合膜表面的微观结构有所改变，可能与细胞自身分泌的一些细胞外基质以及代谢产物有关. 纤维素/大豆分离蛋白复合膜表面直接培养L929细胞实验结果说明温度对纤维素/大豆分离蛋白复合膜的细胞相容性没有影响作用，与MTT实验结果一致.

图4显示了不同降解温度下纤维素/大豆分离蛋白复合膜浸提液对L929细胞的活性影响作用. 由MTT实验结果可知，与对照组相比，未经处理的原始膜CSM-0 d浸提液和经过37℃和80℃两种温度处理的CSM浸提液对L929细胞均没有毒性作用，且对L929细胞的生长和增殖有一定的促进作用，但各组和各时间段之间CSM浸提液对L929细胞的促进作用没有明显的差别. 未经处理的原始膜浸提液对L929细胞作用后的细胞活性率(%)为106.87；在37℃水溶液环境中降解10 d、20 d和30 d的CSM浸提液对L929细胞作用后的细胞活性率(%)分别为108.45、123.08和114.26；而在80℃水溶液环境中降解10 d、20 d和30 d的CSM浸提液对L929细胞作用后的细胞活性率(%)分别为107.94、120.95和109.76.

  

图5 不同温度下CSM在水中降解0 d、10 d、20 d及30 d后直接培养L929细胞的SEM

3 讨论

图3显示了在两种不同降解温度下纤维素/大豆分离蛋白复合膜表面形貌结构. 由SEM结果可知，未经处理的原始膜CSM-0 d呈现多孔结构，表面结构平整. 在37℃水溶液环境中，CSM表面出现纳米丝组成的网状结构，降解20 d和3 0d后，其网孔孔径明显大于降解10 d的. 随着时间的延长，纳米丝数量明显增多，其直径逐渐减小. 到第30 d时，微丝直径达到约100 nm左右. 在80℃水溶液环境中，CSM表面呈现不平整状态，有一定的孔结构存在，但没有呈现在37℃条件下的那种网孔结构，也没有明显的纳米丝形成；到第30 d时，复合膜表面出现碎片状结构.

CSM样品剪成1 cm×1 cm常规消毒备用，使用前放入无血清DMEM培养基中浸泡1 h，使用时无菌滤纸吸干，放入24孔板内；选择对数生长期的L929细胞，常规消化成细胞悬液，调整细胞悬液浓度至2×105 cells/mL，每孔接种细胞悬液量为100 uL. 细胞悬液直接滴加在样品表面，在37℃、 5% CO2条件下培养4 h后，再在每孔滴加含FBS的完全DMEM培养基，所加培养基的量以覆盖样品为准，放入CO2细胞培养箱中继续培养. 细胞悬液滴加在无菌玻片上进行培养为对照组. 72 h后取出，先用2.5 wt%戊二醛前固定2 h，再用1 wt%锇酸后固定1 h，然后梯度酒精 (50%、70%、85%、95%、100%)脱水各15 min，CO2临界点干燥，粘台和喷金，最后由SEM观察样品表面细胞形态.

通过扫描电镜表面观察实验结果可知，纤维素/大豆分离蛋白复合膜在37℃水溶液环境中复合膜表面形成纳米丝组成的网状结构，且随着时间延长，纳米丝数量增多、直径变小；而复合膜在80℃水溶液环境中只有碎片结构形成，并没有出现纳米丝样结构，由此进一步证明在37℃环境中复合膜的降解主要是由微生物对SPI的降解所致，而在80℃环境中复合膜的降解可能主要是由于复合膜中SPI的溶胀、溶解导致纤维素与SPI微相结构的改变所致. 至于是哪些微生物在该环境中发生作用，形成纳米丝状结构的深层机理，尚需进一步研究.

如表2所示，1995～2009年各省平均受教育年限的全局Moran指数I均大于0，p值均通过显著性1%的检验，平均受教育年限(PE)存在显著的空间正相关性，即平均受教育年限的高─高地区或低─低地区聚集在一起，地区间受教育程度存在较大的差异。

复合膜浸提液间接L929细胞培养实验(MTT实验)和复合膜表面直接L929细胞培养实验结果显示，与对照组相比，未经处理的复合膜以及经过温度处理的复合膜浸提液和复合膜本身均对L929细胞没有毒性作用，L929细胞能够正常生长，说明环境温度对纤维素/大豆分离蛋白复合膜的生物相容性没有影响作用. 降解后的纤维素基材料不仅仍具有较好的力学性能，而且还保持了良好的细胞相容性，更重要的是所形成的由纳米丝组成的网状结构具有三维结构特点，因而这类纤维素材料可能与普通纤维素膜材料具有不同的生物学性能和功能，在生物材料领域可能具有应用潜能. 因此，通过37℃水溶液温度下降解处理纤维素/大豆分离蛋白复合膜，可能为获得基于纤维素的纳米生物材料提供新的思路.

说来惭愧，此前我仅仅出版过一部杂文集，就是世纪之初长江文艺出版社为我出的那本《戏说红尘》。在它前后，我把自己的一些杂文收录到散文或文艺杂谈的集子里去了，那些集子多半是书商帮我出的，发行量也比较大，其中还有两本散文集被书商再版发行。

随着时代的发展、经济水平的提高，人们对生活质量和健康的重视度越来越高，要求更多的绿色食品供应于市场。因此，生态养殖越来越受重视，林下养鸡市场开始供不应求。由于林下养鸡的环境复杂，因此如何做好常见传染病的预防极为重要。本文对林下养鸡几种常见病进行阐述，提出了防治措施，希望可以帮助鸡养殖户减少养殖过程中传染病的发生，提高养殖经济效益。

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