西北干旱、半干旱区是我国苜蓿集中种植区，面积占全国种植面积的78.5%[1]。苜蓿是一种高耗水作物，水资源短缺、栽培粗放、生产水平低，严重制约了苜蓿生产的规模与效益。传统苜蓿栽培采用大水漫灌，不仅地面蒸发损失严重，还造成植株受淹后根系呼吸受阻，不定根减少，直接影响根瘤菌的侵染结瘤和固氮效率[2-3]。地下滴灌是通过铺设于地下的毛管将水分扩散到根系层供作物吸收的新兴、高效节水的微灌技术，近年来开始应用于苜蓿生产中。试验证明在干旱区苜蓿生产中地下滴灌能提高水分利用率，增产效果显著[4-5]。

研究表明，接种优良根瘤菌能促进苜蓿早结瘤、多结瘤，增加固氮量，是降低氮肥投入，促进苜蓿高产稳产，提质增效的重要举措[6]。根据不同地域的气候环境特点和生产模式，筛选相匹配的优良菌株，建立适宜的接种技术，促进根瘤菌在土壤繁殖存活、稳定定殖和高效结瘤是发挥其固氮功能的关键。地下滴灌模式下的苜蓿生产，改变了灌溉制度和施肥管理措施，由此引发土壤水分分布格局、运移规律[7]，苜蓿生长性状和根系分布特征发生改变[8]，必然会对根瘤菌的存活定殖、竞争结瘤和固氮功能产生影响，将直接关系到根瘤菌的接种效果。目前，对根瘤菌的应用研究多集中在常规灌溉模式下, 对地下滴灌条件下苜蓿接种根瘤菌的定殖、结瘤和固氮功能的研究少见报道。

本研究在前期工作中已筛选获得固氮活性高、抗逆性能强的优良苜蓿根瘤菌菌株的基础上，采用绿色荧光蛋白报告基因(GFP)标记菌株，原位研究在地下滴灌条件下，不同接种处理的根瘤菌在苜蓿根际的存活定殖、结瘤动态和固氮性能，为构建苜蓿根瘤菌应用技术体系，充分发挥根瘤菌的高效固氮功能，促进干旱区苜蓿产业的高产、优质和高效提供科学基础。

1 材料与方法

1.1 试验区概况

试验于2015年在呼图壁县种牛场新疆农业大学草地生态试验站进行。试验站位于呼图壁河右岸冲洪积扇缘与冲积平原交错地带，地理位置44°15′ N，86°55′ E，海拔439～454 m，年降水量155.2 mm，年蒸发量2 300 mm，冬季有积雪，生长季(4～9月)平均气温18.5℃，无霜期165～190 d。小区试验地为耕种多年的农田，土壤为轻度盐渍化灰钙土。前茬作物为苏丹草，灌溉方式为地下滴灌。

二是整改多措并举，稽察效能充分发挥。稽察结束后及时下发整改意见300余份，要求被稽察单位限期整改，问题突出的要求省政府督导整改；组织流域机构对93个稽察发现存在突出问题项目进行复查和督办，并全面核查8个省（自治区）117个2011年1月—2012年12月稽察项目整改情况；对稽察发现存在突出问题的项目和地区，联合有关司局，通过全国通报、领导约谈、削减投资、资质资格降等降级、与诚信体系挂钩等措施，促进地方建设管理水平的提高。经过努力，稽察整改工作取得了较好的进展和成效，影响工程质量和安全的隐患得以解除，违规违纪资金基本得以纠正，基层项目管理进一步加强，稽察整改工作达到了预期的目标。

然而，全民开启造星模式也开启了某种权力游戏。此前，《人民日报》有评论指出：由于流程不透明、款项管理混乱，一些“粉头”借集资之名行诈骗之实，甚至携巨款消失。正如该评论所说，新模式、新业态的长势越是欣欣向荣，就越要创新监管方式。

1.2 根瘤菌菌株

苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)XGL026菌株，是课题组在前期研究中从新疆紫花苜蓿根瘤中分离、筛选出的固氮活性高、抗逆性强、具有促生性能的苜蓿根瘤菌株。S.meliloti XGL026-GFP菌株：课题组前期研究中采用三亲本杂交法对供试XGL026菌株进行GFP基因的标记，构建出的遗传性能稳定、在荧光显微镜下发出明亮的绿色荧光、兼具四环素抗性(Tetr10 μg·mL-1)，对苜蓿的共生结瘤、生长性状无明显影响的标记功能菌株。

在不同茬次、不同生育期分别对各接种处理苜蓿根际土壤中S.meliloti XGL026-GFP的定殖数量进行测定，结果如图1所示。播前拌种根瘤菌(B)，第1茬苜蓿苗期根际土壤中根瘤菌的定殖数量最高(1.02×104±0.165 cfu·g-1干土)，到分枝期数量急剧下降(减少41.18%)，至现蕾期数量基本维持稳定；第2茬苜蓿根际根瘤菌的定殖量较第1茬下降25.00%～34.92%；第3茬定殖量基本稳定在2.30×103±0.315 cfu·g-1干土。第1茬苜蓿刈割后滴施1次根瘤菌(D)处理，根瘤菌在根际土壤中的定殖数量显著高于B处理(>1000倍)，且定殖菌量随生长期的延长逐渐增加，至第3茬依然持续升高，保持较高的定殖量。拌种结合第1茬苜蓿刈割后滴施1次根瘤菌(B+D1)，第2茬苜蓿根际根瘤菌定殖量高于D处理。拌种结合第1、2茬苜蓿刈割后滴施2次根瘤菌(B+D2)，第3茬苜蓿根际土壤中根瘤菌的定殖量显著高于B+D1处理(P<0.01)。拌种结合滴施根瘤菌并加施少量氮肥(B+D1+N1，B+D2+N2)处理较不施氮肥(B+D1，B+D2)的处理，苜蓿根际土壤中根瘤菌的定殖量略有差异，但差异不显著。

1.3 供试苜蓿品种

试验在苜蓿打草试验地进行。地下滴灌系统为苜蓿建植当年铺设，采用主管+支管+毛管系统，主管道直径90 mm，支管道直径63 mm，毛管为迷宫式，直径12.5 mm，毛管铺设行距60 cm，埋管深度10 cm。以地下井水为水源，滴头标定流量1.38 L·h-1。苜蓿于2015年4月22日播种，行距30 cm，播种量4.5 kg·hm-2，不施化肥，播后灌出苗水。接种根瘤菌试验共设7个处理(表1)。采用完全随机区组设计，每处理3次重复，共21个小区。小区面积25.9 m2(3.7 m×7 m)。每茬苜蓿均于返青期、分枝期和现蕾期共滴灌3次，每次滴水时间24 h，10月23日冬灌。分别于2015年7月3日、8月17日和10月11日，苜蓿现蕾期刈割3次。常规田间管理，适时浇水，除草等。

1.4 培养基及营养液

其中δ15Ns为参比植物(本试验中为与苜蓿生长在同一试验小区的黑麦草)的15N丰度，δ15Nf为试验小区苜蓿的15N丰度，δ15Na为生长于无氮沙培上苜蓿的15N丰度。

政府定期召开企业家座谈会，了解企业诉求，发现企业发展存在问题，指明企业发展方向，增强企业发展和投资者投资的信心。组织企业家进行外出实地考察学习活动，构建优秀企业家队伍，提高高层管理人员的管理水平和管理能力。畅通企业诉求渠道，在相关网站建立平台，建立各个专栏，广泛收集、归类企业反映问题，对问题积极处理。

1.5 试验设计

‘新牧一号’紫花苜蓿，由新疆农业大学草业与环境科学学院提供。

表1 地下滴灌苜蓿接种根瘤菌的小区试验处理 Table 1 Plots trial treatments of inoculation rhizobium in alfalfa field under subsurface drip irrigation

处理编号Processing number根瘤菌接种处理Treatment of inocunation rhizobiumB播前拌种根瘤菌,阴干后播种 Soaking seeds with rhizobia, sowing after dry in the shadeD第1茬苜蓿刈割后滴施1次根瘤菌(接种量40 L菌液·hm-2) Drip irrigation rhizobia after the 1st cut of alfalfa (The amount of bacteria was 40 L·hm-2)B+D1播前拌种根瘤菌+第1茬苜蓿刈割后滴施根瘤菌1次(接种量40 L菌液·hm-2)Seed soaking and drip inoculation with rhizobia(40 L·hm-1)one after the 1st cust of alfalfaB+D1+N1播前拌种根瘤菌+第1茬苜蓿刈割后滴施根瘤菌1次+施少量氮肥1次(尿素30 kg·hm-2) Seeds aoaking and drip inoculation with rhizobia once after the 1st cut of alfalfa plus nitrogen fertilizer (urea 30 kg·hm-1) onceB+D2播前拌种根瘤菌+第1、2茬苜蓿刈割后各滴施根瘤菌1次Seeds Aoaking and drip inoculation with rhizobia twice after the 1st and 2nd cut of alfalfa respectivelyB+D2+N2播前拌种根瘤菌+第1、2茬苜蓿刈割后各滴施根瘤菌1次+施少量氮肥2次(尿素30 kg·hm-2)Seeds soaking and drip inoculatlon with rhizobia twice after the 1st and 2nd cut of alfalfa respectivelyCK对照组,不接菌、不施氮肥 Control group, uninoculated and no nitrogen fertilization

1.6 根瘤菌接种液

活化根瘤菌菌种，接种至YMA(含10 μg·mL-1四环素)液体培养基中，120 r·min-1，28℃摇瓶培养至菌液OD600nm值为0.8～1.0，测定活菌浓度为2.0×109个·mL-1。

1.7 参比植物和无氮沙培试验

看到这么多同学来妈妈这里吃早点，顾晓琳顿时明白了，这就是李蕴涵所说的“初一(2)班的秘密”，她一时感动得不知说什么好，只有诚恳地说：“俞敏杰，谢谢你！”

无氮沙培试验：用于测定在无土壤因素影响下苜蓿植株15N同位素丰度。将河沙反复清洗、干燥后装入营养钵(直径：20 cm，高：30 cm)内。种子经表面消毒后，28℃催芽，待主根长出2～3 cm，侧根未长出时，用菌液浸种15 min后植栽入盛有河沙的营养钵中。苜蓿生长期间定期浇灌无氮营养液(300 mL·营养钵-1)，同时以无菌水培养液浸种的处理作对照。

1.8 测定项目与方法

1.8.1 根瘤菌在苜蓿根际土壤的定殖 分别在苜蓿不同茬次、不同生育期各处理小区连根完整挖取10～15株苜蓿植株，收集根际土样，称重。土样放入装有无菌玻璃珠的三角瓶中震荡10 min，10倍稀释，取合适浓度稀释液涂布于四环素抗性平板，荧光显微镜下计数发光菌落数。

1.8.2 结瘤数，主、侧根根瘤分布及标记根瘤占瘤率 分别在苜蓿不同茬次、不同生育期，每小区每次连根完整取出10～15株苗，调查总根瘤数，主、侧根根瘤数及发光根瘤数。采集的根瘤经表面灭菌后，用无菌镊子压破根瘤制备菌悬液，在含抗生素的YMA平板上划线分离，28℃培养2～3 d，荧光显微镜下统计荧光菌落。

1.8.3 苜蓿植株生物固氮率和固氮量 根瘤菌固氮率采用15N自然丰度法测定[11]。植株收获后，75℃烘干、粉碎。茎叶15N%测定采用测量精度为0.001%的精密同位素质谱仪，全氮含量测定采用凯氏定氮法。计算不同处理的根瘤菌固氮百分率、固氮量。

根瘤菌固氮百分率(%Ndfa)通过下式计算：

%Ndfa =(δ15Ns-δ15Nf)/(δ15Ns-δ15Na)×100%

(1)

根瘤菌培养采用YMA培养基[9]。苜蓿沙培培养采用无氮营养液(g·L-1)[9]：MgSO4 0.49 g；KH2PO4 0.5 g；MnCl2 0.001 g；H3BO3 0.001 g；ZnSO4 0.001 g；钼酸钠0.001 g；CuSO4 0.0001 g；Na2Fe EDTA 0.02 g；蒸馏水1 000 mL。

根瘤菌固氮量用下式计算：

最后就是要持续性加强省内农机科研队伍建设，不遗余力的培养农机高技术人才。为此，地方农机科研机构应该多与省内各高校形成联动，建立委托培训机制，并广泛推广应用高校订单式人才培养模式。当然，省内农机化发展也要做到与时俱进，多利用大数据、“互联网+”手段，基于新理念实施远程教育，不断提高地方农户及专业农机化技术研究人员的专业业务素质，为省内农机化水平快速提高提供强有力的技术支持。

Ndfa=%Ndfa×Mlb×Cnc

(2)

各处理的3茬苜蓿刈割后，分别测定根瘤菌的固氮率和固氮量(表2)。由图可知，与对照组(CK)相比，接种优良根瘤菌菌株能显著提高3茬苜蓿的固氮率和固氮量。播前拌种根瘤菌(B)，第1、2、3茬苜蓿根际根瘤菌的生物固氮率和固氮量较对照分别增加了40.41%、16.06%、11.10%和56.19 kg·hm-2、44.66 kg·hm-2、43.56 kg·hm-2，以第1茬苜蓿根际根瘤菌的固氮率、固氮量的增幅最大。第2茬苜蓿，各处理根瘤菌的固氮率和固氮量的大小依次为：B+D1+N1>B+D1>B>D>CK，接种处理的固氮率和固氮量较对照分别提高了3.35%～30.15%，26.17～72.83 kg·hm-2，以B+D1+N1的增幅最大，其次是B+D1的处理。第3茬苜蓿，各处理根瘤菌的固氮率的大小依次是：B+D1+N1>B+D2>B+D2+N2>B+D1>D>B>CK，固氮量的大小依次为B+D2+N2>B+D2>B+D1+N1>B+D1>D>B>CK，各接种处理根瘤菌的固氮率和固氮量较对照分别提高了11.01%～35.86%，13.56～83.86 kg·hm-2，其中B+D1+N1、B+D2和B+D2+N2处理根瘤菌的固氮率都保持较高，达到了75%以上，B+D2+N2处理的固氮量最高，固氮效应最为突出。

若将GMDSS初级现代化理解为以吸纳新技术作为主要工作任务，则可认为GMDSS准现代化是筛选及设立门槛的过程，应以面向未来开展通信需求研究为主要工作任务，即保留并发展能够支撑E-Navigation战略的先进技术，逐步摒除初级现代化阶段中与海事安全需求不符的技术。

1.9 数据分析

运用SPSS Statistics 19.0软件进行数据统计分析，并采用 Duncan检验进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 不同接种处理根瘤菌在苜蓿根际土壤的定殖动态

最后，相关部门分工协作、紧密配合，全盘掌管课题资金的使用。应由科管科负责监督检查课题实施执行情况；项目负责人每季度召开会议，向财务科、科管科汇报项目经费使用情况及项目进展情况；财务科根据课题预算表和决算表、财务项目支出表、财务原始凭证、固定资产台账、公共实验室的实物资产、科管科的课题结题验收材料，全程监管课题经费使用情况。

2.2 不同接种处理对苜蓿结瘤数的影响

统计各处理苜蓿的单株结瘤数(图2)，结果显示，与对照相比，各接种根瘤菌的处理均能有效增加苜蓿结瘤数。播前拌种根瘤菌(B)，第1茬苜蓿结瘤数从苗期至现蕾期迅速增加，至现蕾期时达到最高(33±0.005个·株-1)，较对照组增加13个·株-1。第2茬苜蓿的平均结瘤数依次为：B+D1+N1(34±2.118个·株-1)>B(28±0.032个·株-1)>B+D1(27±0.005个·株-1)>D(23±0.120个·株-1)>CK(17±0.218个·株-1)，各接菌处理均能显著增加苜蓿结瘤数(P<0.05)，较对照增加6～17个·株-1(平均11个·株-1)，其中B+D1+N1处理的增幅最大。第3茬苜蓿结瘤数依次为：B+D2+N2(33±0.580个·株-1)>B+D1+N1(31±2.212个·株-1)>B+D2(30±0.223个·株-1)>B+D1(26±0.012个·株-1)>B(23±1.123个·株-1)>D(22±0.605个·株-1)>CK(16±0.045个·株-1)，接菌处理较对照组增加6～17个·株-1(平均12个·株-1)，其中B+D2+N2的增幅最大。

2.3 不同接种处理标记根瘤菌的竞争占瘤率

采集各接种处理的苜蓿根瘤，抗性平板分离根瘤菌,检测标记荧光菌落数，统计接种菌株的占瘤率。图3显示，各接种处理，1～3茬苜蓿上接种菌株S.meliloti XGL026-GFP的平均占瘤率达52.91%～76.71%，显著高于土著根瘤菌，具有较强的田间竞争结瘤能力。播前拌种根瘤菌(B)，第1茬苜蓿根部根瘤菌的占瘤率逐渐上升(苗期34.50±0.577%～现蕾期47.22±0.334%)，到第2茬分枝期迅速上升至最大(67.30±1.339%)，在之后的生长期中基本维持该水平。D、B+D1和B+D1+N1处理，根瘤菌在第2、3茬苜蓿根部的占瘤率均逐渐上升，第2茬(分枝期)至第3茬(苗期)分别为46.6±1.220%～55.97±0.188%、66.70±0.415%～68.70±0.577%和69.50±1.322%～72.17±3.756%，其中B+D1+N1处理的占瘤率最高且持续稳定。B+D2及B+D2+N2处理，第3茬苜蓿上接种根瘤菌的占瘤率分别为67.57±0.368%和76.71±0.883%，B+D2+N2处理占瘤率更高，可见滴施接菌并加施少量氮肥对根瘤菌的占瘤率具有一定的促进作用。

2.4 不同接种处理苜蓿主、侧根根瘤分布

对各处理苜蓿主、侧根根瘤的分布情况进行统计，结果如图4所示。播前拌种根瘤菌(B)，第1茬苜蓿从苗期到现蕾期主根根瘤占总根瘤数的比例由86.05±0.263%下降至40.16±3.352%，侧根上形成根瘤比例由13.95±0.541%上升59.84±0.595%，较未接种对照平均增加5.68%。第2、3茬苜蓿的根瘤主要分布在侧根上，接种处理侧根根瘤比例分别为55.31±1.764%～71.00±0.263%(平均63.19±0.985%)、89.91±0.882%～91.25±0.887%(平均90.77±0.884%)，较对照增加0.09%～15.44%，以滴施处理的第2茬苜蓿的增幅最明显。结果说明地下滴灌条件下接种根瘤菌，能明显增加苜蓿新生侧根和毛根数量，有利于根瘤菌侵染，增加侧根根瘤分布。

睡眠不足：睡眠不足是当下年轻人的通病。睡眠的目的是人体自我修复，如果长期睡眠不足会降低肝细胞修复再生能力，想要肝好，就要在晚上11点左右睡觉。

2.5 不同接种处理对生物固氮率、固氮量的影响

Ndfa为单位面积根瘤菌的生物固氮量(kg·hm-2)，%Ndfa为根瘤菌生物固氮所占比例，Mlb为单位面积苜蓿生物量(kg·hm-2)，Cnc为苜蓿植株全氮含量(kg·kg-1)。

表2 不同接种处理苜蓿的生物固氮率和固氮量 Table 2 The proportion of N fixed and the amount by alfalfa under different treatments

处理Treatments固氮百分率 The proportion of N fixed/%固氮量 The amount of N fixed/kg·hm-2第1茬 1st cut第2茬 2nd cut第3茬 3rd cut第1茬 1st cut第2茬 2nd cut第3茬 3rd cutB65.46±0.538aA61.23±0.577cC62.80±1.764eE153.97±1.132aA155.22±0.225cC43.00±0.333fFD-54.52±0.333dD66.74±1.129dD-136.73±1.234dD48.61±3.283eEB+D1-65.51±0.663bB70.03±1.115cC-171.76±1.200bB73.75±3.352dDB+D1+N1-68.66±0.654aA76.80±1.002aA-183.39±2.205aA96.79±0.517cCB+D2--75.91±0.667bB--101.25±0.187bBB+D2+N2--75.61±0.882bB--113.29±0.398aACK46.62±0.462bB52.75±1.453eE56.53±1.078fF97.79±0.785bB110.56±0.577eE29.44±0.666gG

注：同列不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示处理间差异极显著(P<0.01)

Note: Different small letters in the same column indicate significant difference at the 0.05 level, different capital letters indicate significant difference at the 0.01 level

3 讨论与结论

3.1 不同接种处理对根瘤菌在苜蓿根际定殖和结瘤的影响

3.1.1 不同接种处理根瘤菌的根际定殖量 接种根瘤菌种群定殖动态受多种因素的影响，涉及接种方法、土壤非生物因素和生物因素的制约[12-13]。地下滴灌下的苜蓿生产模式改变了土壤环境，必然对接种根瘤菌的生存定殖、侵染结瘤和固氮功能产生影响[14]。利用基因标记技术标记根瘤菌株，依据标记基因作用于特异性底物产生的颜色反应或发光现象区别于土著菌，能直观地原位示踪、检测功能菌株的环境行为[15-16]。本研究利用绿色荧光蛋白基因(GFP)作为报告基因，对前期研究中分离筛选出的优良根瘤菌菌株XGL026进行分子标记，通过地下滴灌田间小区试验，示踪、检测不同接种处理对根瘤菌在苜蓿根际定殖和竞争结瘤性能的影响。结果显示，不同接种处理根瘤菌的定殖动态和水平差异显著。播前拌种根瘤菌(B)，在第1茬苜蓿苗期根际定殖密度最大，至第2茬苜蓿定殖密度下降，第3茬苜蓿仅有少量存留。第1茬苜蓿刈割后滴施1次根瘤菌(D)，拌种结合第1茬苜蓿刈割后滴施1次根瘤菌(B+D1)，拌种结合第1、2茬苜蓿刈割后滴施2次根瘤菌(B+D2)和拌种结合滴施同时增施少量氮肥(B+D1+N1，B+D2+N2)处理，根瘤菌的定殖数量显著高于B处理，在第2、3茬定殖数量持续升高，保持较高的定殖量。

在苜蓿田间小区试验行间种植黑麦草(Lolium perenne)作为不固氮的参比植物 [10]。

3.1.2 不同接种处理对结瘤数、占瘤率的影响 接种根瘤菌在根际存活、定殖是发生在根瘤菌侵染和建立共生关系的最初阶段，对于成功与土著菌竞争占据根系，提高结瘤率至关重要。本研究表明，接种能显著增加苜蓿结瘤数。B处理在第1茬苜蓿上的结瘤量最多，第2、3茬苜蓿上的结瘤数减少。而B+D1+N1处理第2、3茬苜蓿的结瘤数、占瘤率都明显高于拌种(B)、滴施(D)和拌种结合滴施(B+D1、B+D2)处理。B+D2+N2第3茬苜蓿的结瘤数、接种菌占瘤率均达到最高，明显优于其他处理。

确定了白砂糖的添加量，卡拉胶、黄原胶、槐豆胶等胶凝剂的配比及添加量后，姜汁保健果冻的风味口感主要受姜汁添加量、柠檬酸添加量和β-环状糊精添加量的影响，因此试验采用三因素四水平L9（34）正交试验。

李友国[17]等发现，接种根瘤菌在豆科植物根际的定殖水平与苜蓿结瘤量和固氮效应密切相关。但也有研究发现结瘤数量、占瘤率高的菌株并不与其在根际的定殖水平呈正相关[18]。本研究结果显示，第1茬刈割后滴施1次根瘤菌(D)较播前拌种(B)能显著提高根瘤菌在苜蓿根际的定殖量，但结瘤数和占瘤率均低于B处理。分析其原因，可能与苜蓿根系是根瘤的载体，接种根瘤菌结瘤量与根系发育密切相关。播前拌种处理(B)促进了苜蓿根系生长，根系活力显著增加，有利于根瘤菌的侵染结瘤。而D处理是在第1茬苜蓿刈割后才接菌，尽管根瘤菌定殖量大，但苜蓿根系发育状况劣于B处理，影响了根瘤菌共生结瘤。

播前拌种是目前根瘤菌应用中最主要的接种方式。此方式由于根瘤菌的迁移速度远远慢于根系的生长速度，造成根瘤菌与根系的接触时间短，侵染结瘤率降低，影响接种效果[19]。实践中发现，随着苜蓿种植年限延长、刈割茬次增加，毛根减少、根皮老化，根瘤菌难于侵染、根瘤数会急剧减少，由此带来的氮素供应缺乏，苜蓿产量、品质下降是苜蓿生产中的突出问题，能否通过补充接种根瘤菌提高其固氮能力也是当前需要解决的技术难题。本研究结果表明，苜蓿地下滴灌栽培模式下，采用常规的播前拌种接种根瘤菌(B)，在头茬苜蓿根际定殖密度、结瘤数和占瘤率最高，但在第2、3茬苜蓿上则明显降低。拌种结合在第1、2茬苜蓿刈割后滴施根瘤菌(B+D1，B+D2)和拌种结合滴施并增施少量氮肥(B+D1+N1，B+D2+N2)处理能显著增加2、3茬苜蓿根际根瘤菌的定殖密度、结瘤数和占瘤率(P<0.05)，其中B+D1+N1和B+D2+N2处理的接种效应最为突出。利用地下滴灌的地下毛管在灌水的同时将菌剂滴施到根区土壤中，可实现菌剂的可控、均匀和靶向施入，为不同种植年限、不同茬次的根瘤菌接种提供了新的途径。

3.2 地下滴灌对根瘤在苜蓿主、侧根分布的影响

姚新春等[20]的试验显示，随着苜蓿生长期延长，主根皮层细胞不断衰老而变厚，根瘤菌不易侵染形成根瘤，转而去侵染幼嫩的侧根和不断更新的毛根，导致侧根根瘤比例不断增加，而主根上根瘤的比例持续下降。本试验结果也显示出相似的特点。苜蓿地下滴灌种植模式下，随着生长期推移和刈割茬次的增加，根瘤的形成不断向侧根转移，主、侧根根瘤比例分布呈现明显变化。播前拌种根瘤菌(B)，第1茬苜蓿苗期以主根根瘤为主，至现蕾期侧根根瘤比例上升为优势。在第2、3茬苜蓿各接种处理侧根根瘤比例继续上升。刈割会使侧根在浅层土壤中的集中分布愈加明显, 可能是2、3茬苜蓿侧根根瘤比例增加的重要原因。另一可能的原因是地下滴灌条件改善了较浅土层的水分条件，能促进苜蓿新生侧根形成、增加根毛和活根量；距滴灌滴头越近毛根量越大[21]，使接种根瘤菌易于定殖和侵染，从而提高根瘤在侧根上所占的比例。地下滴灌条件下，苜蓿根系的空间分布与根瘤菌侵染结瘤的动态变化规律还有待继续深入研究。

3.3 不同接种处理对不同茬次苜蓿固氮效率的影响

3.3.1 不同接种处理下的固氮效率 本试验结果表明，地下滴灌苜蓿接种优良根瘤菌菌株能显著提高固氮率，增加固氮量，不同接种处理、不同茬次苜蓿的固氮效率存在较大差异。采用拌种、滴施、拌种结合滴施、拌种结合滴施并加施少量氮肥等接种处理，在一个生长期的3茬苜蓿上的固氮百分率为54.52%～76.80%，较未接种对照提高了3.35%～40.41%；固氮量为43.00～183.39 kg·hm-2，较对照增加13.56～83.86 kg·hm-2。播前拌种(B)处理对第1茬苜蓿的固氮效应最突出，之后明显下降。第2茬苜蓿上， B+D1+N1处理根瘤菌的固氮率和固氮量增幅最为显著。在第3茬苜蓿上，B+D1+N1、B+D2和B+D2+N2处理都有较高的固氮率，其中B+D2+N2处理的固氮量增加最大。结果证明，在播前拌种基础上，在2、3 茬苜蓿上配合滴施根瘤菌1～2次，并配施少量氮肥能显著提高固氮效率，改善植株的氮素营养，促进苜蓿生长，提高了地上部干物质积累，达到了显著的增产效果(另文报道)。

3.3.2 根瘤菌接种和氮肥配施

氮素是影响根瘤菌固氮能力的重要限制因子，其影响非常复杂。氮肥施用量、氮肥类型、施用时期和方式等都会影响到根瘤菌的固氮效能[22]。Liu等[23]的研究发现豆科作物在返青期根瘤较少或在刈割后苜蓿的光合作用较弱时，根瘤菌尚未与其建立起有效的共生关系，得不到充足的碳水化合物，导致固氮作用较弱，苜蓿生长主要依靠吸收土壤氮素。此时期加施少量氮肥作为“起爆氮”能促进植株生长，增加结瘤和固氮。但氮肥供应过多，会影响根瘤菌对根毛的侵染，对固氮效率表现出明显的抑制作用[24]。因此，在苜蓿生产中协调好充分发挥根瘤菌固氮作用和经济有效地施用氮肥这一矛盾是一个值得研究解决的问题。

本研究结果表明，B+D1+N1、B+D2+N2处理，在第1、2茬苜蓿刈割后滴施根瘤菌同时加施少量氮肥(30 kg·hm-2尿素)1～2次，促进了苜蓿根系发育，有利于苗期返青生长，增加地上部光合产物向地下部分输导，进而有利于根瘤菌的侵染、结瘤，起到显著提高苜蓿固氮效率的作用。B+D2+N2较B+D1+N1处理增加了施菌和施氮肥的次数，在第3茬苜蓿上获得了最高的固氮效应，体现出累加效应。有研究发现，土壤中根瘤菌群体的“载菌量”有一定阈值，增加接菌量提高接种效果的作用有限；同时增加接菌、施氮肥次数会增加生产成本。因此，根瘤菌施用次数和施菌量、加施氮肥的次数，氮肥施用量和施用时期等都还有待进一步优化，以期实现最佳生产效益。本研究结果对滴灌苜蓿栽培生产中应用根瘤菌和氮肥的高效利用，建立高产、优质、高效的苜蓿生产体系具有重要的实践意义。

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