MicroRNA(miRNA)是近年来发现的一类具有诸多调控功能的内源性非编码的单链小分子RNA，由18～24个核苷酸组成，通过与靶基因3′UTR上存在的不完全或者完全互补位点结合来抑制靶基因的翻译或降解靶mRNA [1-2]。已有研究表明miRNA与细胞增殖[3]、凋亡[4-5]、神经发育[6]、造血过程[7-8]，以及与鸡的一些易感疾病如马立克氏病[9]、鸡肠炎沙门菌病[10]等相关。Hicks等[11]进一步研究了miRNAs 在鸡免疫器官形成中的作用，证实 miRNAs与法氏囊和淋巴细胞发育分化有关，但是这些相关miRNAs调控这些生物学过程的分子机制尚不清楚。

禽类在应激状态下，下丘脑-垂体-肾上腺素轴被激活，大量分泌糖皮质激素皮质酮(corticosterone，CORT)，调整体内各大代谢途径和生理机能以应对各种应激源[12]。因此，血浆皮质酮的浓度可作为禽类处于应激状态的可靠指标[13]。皮质酮不仅调节水盐平衡、血压稳态和三大物质(糖类、脂肪、蛋白质)代谢等基本生理活动，还参与调控骨骼发育和免疫与炎症等过程。近年来，用皮质酮处理动物来模拟生理应激的方法已经在啮齿类和禽类的研究中得以广泛应用[14]。法氏囊为禽类特有的淋巴器官，是体液免疫的中枢淋巴器官，是B淋巴细胞发育和分化的主要场所。当鸡机体在应激或疾病状态下，法氏囊中参与应激免疫过程的相关基因表达水平也会发生明显的变化，鉴定出参与法氏囊免疫过程的相关基因，对揭示禽类法氏囊抗逆状态下分子水平基因调控机制十分重要。本试验中，通过在基础日粮中添加皮质酮，构建雏鸡应激性免疫抑制模型，通过高通量Solexa测序技术建立雏鸡法氏囊差异miRNA表达谱，并对差异表达miRNAs预测的靶基因进行分析，可为揭示家禽应激性免疫抑制的转录后分子调控机制提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物

选取河南农业大学种鸡站7日龄健康、体重均匀的固始公鸡180只，按照雏鸡饲养管理手册进行饲养管理，饲养过程中不进行常规免疫接种和断喙，鸡处于相对隔离的洁净鸡舍中。将试验鸡随机分成对照组和应激模型组，对照组只饲喂基础日粮，用B_B表示，应激模型组需在基础日粮中添加皮质酮浓度为30 mg/kg的饲料，用C_B表示，每组90只鸡，每组3个重复，每个重复30只，试验处理期为7 d。皮质酮购自Sigma公司，含量≥92%。

1.2 样品采集

随机选取对照组和应激模型组各9只鸡(每组每个重复3只)，无菌条件下麻醉后颈部放血处死，取外周血和法氏囊，组织样品立即放入液氮中，再转入-80 ℃冰箱保存备用。

1.3 小RNA文库的构建及Solexa测序

提取对照组和应激模型组鸡法氏囊组织总RNA样品，分别混合组成总RNA池，用于小RNA文库的构建。利用小RNA的3′及5′端特殊结构(5′端有完整的磷酸基团，3′端有羟基)，以总RNA为模版，直接将小RNA两端加上接头，然后反转录合成cDNA。随后经过PCR扩增，PAGE胶电泳分离目标DNA片段，切胶回收得到cDNA文库，文库构建完成后，先使用Qubit2.0进行初步定量，稀释文库至1 ng/μL，随后使用Agilent 2100对文库的插入片段长度(insert size)进行检测，插入片段长度符合预期后，使用Q-PCR方法对文库的有效浓度进行准确定量(文库有效浓度 >2 nmol/L)，以保证文库质量。库检合格后，把不同文库按照有效浓度及目标测量需求tooling后进行测序，文库构建和Solexa测序均在北京诺禾致源科技股份有限公司完成。

利用RNAhybrid、PITA和miRanda 3种算法预测miRNA的潜在靶基因，筛选3种算法的共有靶基因用于后续生物信息学分析。利用DAVID生物信息学数据库[16]的相关资源对miRNA的预测靶基因进行功能富集分析(GO)和信号转导通路富集分析(KEGG)。

问题3 一般地，一元二次方程ax2+bx+c=0(a≠0)的根与二次函数f(x)=ax2+bx+c(a≠0)的图象有何联系呢？

1.4 已知miRNA的鉴定及差异表达分析

使用Blast搜索，将测序获得的小RNA序列同Sanger microRNA序列数据库(miRBase 21.0)中鸡的已知miRNA序列进行比对，鉴定已知miRNA。以7日龄雏鸡小RNA文库中的表达丰度TPM(transcripts per million，表达量归一化处理方法)为对照，与数据库中已知miRNA进行差异表达对比分析。首先，依据公式(TPM=单一miRNA reads 数×106/总reads数)校正2个文库中miRNA的表达量[15]，然后利用校正表达量根据公式计算miRNA的变化倍数。

变化倍数=log2(处理样品校正表达量/对照样品校正表达量)。

1.5 miRNA的实时荧光定量(qRT-PCR)验证

采用Hairpin-itTMmiRNAs qPCR Quantitation Kit(上海吉玛制药技术有限公司)进行， 根据miRBase(21.0)中登录的相应鸡的miRNA 前体序列设计茎-环特异性引物。首先，按照20 μL反应体系(8 μL 5×RT缓冲液、1 μL总RNA(200 ng/μL)、2 μL反转录酶(200 U /μL)、2.2 μL特异性引物(1 μmol/L)和6.8 μL无RNA酶的水)，在16 ℃ 30 min、42 ℃ 30 min、85 ℃ 10 min的条件下对总RNA进行反转录。然后，将反转录产物作2倍稀释，在 RocheLightCycler® 480 Ⅱ实时定量检测PCR仪上，按照10 μL实时定量PCR缓冲液(0.25 mmol/L dNTPs、3 mmol/L Mg2+和SYBR Green染料)、1 μL稀释后反转录产物、0.4 μL特异引物(5 μmol/L)、0.2 μL Taq DNA聚合酶(5 U/μL)和8.4 μL无RNA酶的水的反应体系进行荧光定量PCR扩增，反应条件为：95 ℃ 3 min,95 ℃ 12 s，60 ℃ 50 s，共40个循环，于60 ℃采集荧光，各组织样品重复3次。

1.6 miRNA靶基因预测、GO term富集和KEGG通路分析

最后，信用增级的法律缺位。我国《担保法》规定：国家机关不得为担保人，但经国务院批准为使用外国政府或国际经营组织贷款进行转贷的除外。这一规定使我国的外部信用增级机制无法进行有效，从而制约了我国应收账款证券化的发展。

目前，有关厚萼凌霄的研究大多集中在园林绿化、药用价值和栽培技术等方面[5-6]，有关厚萼凌霄生理学特性的研究还处于起步阶段[7]，尚未见到有关厚萼凌霄种子对盐碱胁迫响应方面的研究成果。本实验旨在通过不同浓度的海水对厚萼凌霄种子的盐胁迫的研究，观察厚萼凌霄种子萌发的情况，探究厚萼凌霄种子对盐碱土地的耐受能力，为探索在盐碱地、盐渍化土壤中种植厚萼凌霄的科学方法，充分利用其绿化价值提供理论依据。

2 结果与分析

2.1 小RNA测序

测序分析结果显示，在对照组和应激模型组的2个小RNA样本库中原始数据(raw reads)的读数分别显示为13 216 125和12 272 198。对raw reads数据进行进一步的处理，得到干净读数(clean reads)分别为12 475 938(94.40%)和11 949 582(97.37%)。对测序的小RNA的种类、数量进行数据分布统计分析，结果如图1所示。动物的小RNA的长度区间一般为18～35 nt，长度分布的峰能帮助我们判断小RNA的种类。miRNA长度大小都主要集中在21～22 nt，因此筛选这一长度范围内的小RNA来进行后续的分析。从图1可以看到B_B组和C_B组均在22 nt时达到最高峰值，说明miRNA含量丰富，测序结果真实可靠。

参加访谈的留学生中，无论是哪个班的学生，都有人认为问卷“很难，有些话我不知道(汉语)应该怎么说”。主要的问题是“题目都能看懂，答案每句话好像都对，但不知道选哪个”，原因则是“平时总是只说一句话(注：只用一种说法)”，“有些用法和上课学的不一样”。但也有中级班的两个学生提出了不同的看法，其中一个说“我觉得这个考试不太难，还可以”，另一个则觉得“很有意思，像HSK考试的听力”，“还可以，应该是考尊敬和不尊敬的说法吧”。

图1 测序文库中小RNA种类数量分布

2.2 对照组和应激模型组高丰度表达miRNAs鉴定分析

测序分析结果显示在差异性表达的miRNA中，一些miRNA的丰度在文库中占据很大比例。从clean reads中筛选出前10个在C_B组法氏囊中高丰度表达的miRNA，与对照组B_B高丰度差异性表达的miRNA进行对比分析。表达丰度是最高的是gga-miR-148a-3p，其他依次是gga-miR-21-5p，gga-let-7i，gga-let-7f-5p，gga-let-7g-5p，gga-miR-100-5p，gga-miR-7，gga-miR-26a-5p，gga-miR-101-3p，gga-miR-146c-5p。

2.3 对照组与应激模型组差异表达miRNAs筛选分析

对2个小RNA文库中所有表达的miRNA进行差异表达分析，设置参数校正后的显著水平q值<0.01，共筛选出77个差异表达的miRNA，在皮质酮处理后的鸡法氏囊中共有34个上调和43个下调表达的miRNA。其中gga-miR-217-5p、gga-miR-7b、gga-miR-6670-5p等显著上调(表1)，gga-miR-146b-3p、gga-miR-146b-5p、gga-miR-251-5p等显著下调(表2)。

表1 C_B组中表达上调的miRNA(部分数据)

上调的miRNAC＿B(TPM)B＿B(TPM)变化倍数/log2q值gga-miR-217-5p38 22561 44724 72322 94E-09gga-miR-7b4244 99571241 70771 77340gga-miR-6670-5p28 23488 39381 75010 0052553gga-miR-499-5p1166 7494414 48141 49318 28E-76gga-miR-128-1-5p59 944725 76041 21850 0017503gga-miR-106-3p526 0363236 18501 15524 47E-23gga-miR-222b-5p426 7801203 76741 06661 42E-16gga-miR-1556037 90643219 46730 90724 19E-168gga-miR-20b-5p2628 66121433 31850 87496 05E-69gga-miR-16c-5p4815 77332659 39630 85677 30E-121

注：q值为校正后的P值，q<0.01。下同

表2 C_B组中表达下调的miRNA(部分数据)

下调的miRNAC＿B(TPM)B＿B(TPM)变化倍数/log2q值gga-miR-146b-3p56 4696322 1493-2 51222 08E-48gga-miR-146b-5p4347 727019085 8286-2 13420gga-miR-215-5p178 7481734 3152-2 03854 60E-85gga-miR-184-3p312 75491150 2439-1 87882 10E-119gga-miR-133c-3p32 795898 4104-1 58531 33E-09gga-miR-223116 8487314 9133-1 43036 05E-24gga-miR-19425 845765 7034-1 34601 03E-05gga-miR-353828 886470 3345-1 28381 04E-05gga-miR-14765 1573144 7212-1 15135 49E-09gga-miR-29a-3p34 099073 8078-1 11404 86E-05

2.4 差异表达miRNA的实时荧光定量(qRT-PCR)验证分析

利用qRT-PCR技术，提取同一批次样品的总RNA，共验证7个miRNAs表达情况，分别是gga-miR-181b-5p、gga-miR-103-3p、gga-miR-20b-5p、gga-miR-460a-5p、gga-miR-133c-3p、gga-miR-24-3p和gga-miR-30a-3p。结果显示(图2)，这些miRNA的表达变化趋势与Solexa测序结果保持一致，说明高通量测序结果是可靠的。

2.5 差异表达miRNA生物信息学分析

为进一步理解外源皮质酮诱导应激鸡法氏囊中差异表达miRNA潜在的免疫调控生物学功能，采用RNAhybrid、PITA和miRanda 3种算法对77个差异表达的miRNA进行靶基因预测分析，共预测到282个靶基因，并对这些靶基因做GO和KEGG 分析。

[8] Zhu Y, Wang D, Wang F, et al. A comprehensive analysis of GATA-1-regulated miRNAs reveals miR-23a to be a positive modulator of erythropoiesis[J]. Nucleic Acids Research, 2013, 41(7):4129-4143.

利用DAVID生物信息学资源对预测靶基因进行KEGG功能注释。结果显示(表3)，这些预测的靶基因在心肌收缩(cardiac muscle contraction)、RNA聚合酶(RNA polymerase)、肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system)、细胞因子受体互作(cytokine-cytokine receptor interaction)等广泛的生物学通路中显著富集(P<0.05)。此外，这些预测靶基因也富集在与免疫功能相关的其他通路中，如丝裂原活化蛋白激酶信号通路(MAPK signaling pathway)、酪氨酸激酶-转录因子STAT通路(Jak-STAT signaling pathway)、黏蛋白p53信号通路(p53 signaling pathway)、溶酶体(lysosome)等，但富集不显著。

注：*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001

图2 部分miRNA测序结果的qRT-PCR验证

表3 差异表达miRNA预测靶基因的KEGG通路富集

通路条目通路IDP值相关基因心肌收缩gga042600 0101COX5A(细胞色素c氧化酶5A)TPM1(原肌球蛋白1)TNNT2(肌钙蛋白T2)TNNC1(肌钙蛋白C1)MYL4(肌球蛋白轻链4)RNA聚合酶gga030200 0108POLR1C(RNA聚合酶亚单位1C)POLR2D(RNA聚合酶亚单位2D)POLR2C(RNA聚合酶亚单位2C)肾素-血管紧张素系统gga046140 0456ACE(肽酶M2)CTSA(肽酶S10)细胞因子受体互作gga040600 0426IL11Ra(白细胞介素11受体亚基α)CX3CL1(c-x3-c趋化因子配体1)IFNGR1(干扰素-γ受体1)TNFRSF21(肿瘤坏死因子受体超家族21)CSF3R(粒细胞集落刺激因子3受体)CCR10(趋化因子受体10)CNTF(睫状神经营养因子)PSMD11(蛋白酶26S亚基11)

注：P<0.05表示富集显著

3 讨论

[14] Lin H, Sui S J, Jiao HC, et al. Impaired development of broiler chickens by stress mimicked by corticosterone exposure[J]. Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol, 2006, 143(3):400-405.

将各参数值代入式(9),可得Fmax=302 kN,则悬挂导向机构上的悬挂油缸的载荷变化范围为0～162.5 kN,满足要求.

应激组与正常组鸡法氏囊中高丰度差异性表达的miRNA有gga-miR-148a-3p、gga-miR-21-5p、gga-let-7i、gga-let-7f-5p、gga-miR-100-5p、gga-miR-7、gga-miR-101-3p等，说明这些miRNA在鸡法氏囊中可能具有很重要的调节作用。miR-148a-3p在人类医学上的研究是较多的，在人类膀胱癌中具有抑制作用，并且能在人类胃癌发生发展中发挥作用，miR-148a-3p可能通过作用于其靶基因表皮生长因子受体3(ERBB3)，介导表皮生长因子受体3/磷脂酰肌醇-3-激酶/苏-丝氨酸激酶(ERBB3/PI3K/Akt)信号通路调节胃癌多重耐药[17]。在猪的研究上，miR-148a可能在肝脏发育过程中通过降低增强子结合蛋白α(CEBPα)的表达来调控细胞增殖和分化效应之间的平衡[18]，miR-148可负调控树突状细胞的先天性免疫应答，促进免疫内环境稳定和免疫调节[19]。 miRNA-let-7i能调控Toll样受体4的表达[20]。在miRNA-146a在体外培养的大鼠雪旺细胞炎性反应模型中的表达变化中，miRNA-146a的表达随脂多糖浓度升高而增加，可知miRNA-146a参与了体外培养的大鼠雪旺细胞炎性反应的调控，其表达水平在一定程度上可反应炎性反应的严重程度[21]。miR-146b也是促炎症因子，研究也表明，表明micro-RNA-181a，-146a和-146b是哮喘中的促炎因子，并且miRNA-146a的下调可能部分地解释了地塞米松的抗炎作用[22-23]。同时有较高表达的还有gga-miR-101-3p，研究表明gga-miR-101-3p在鸡毒支原体感染中起关键作用[24]。在前10个高丰度差异性表达miRNA中，gga-miR-146c-5p表达丰度也是较高的，提示miR-146家族很可能在家禽免疫应激过程中起较大的作用，接下来将对miR-146家族成员做一些功能上的验证。此外，在差异表达且显著上调miRNAs中，如gga-miR-217-5p和 gga-miR-7b，虽然表达丰度不高但差异倍数较大，也值得进一步关注。

预测靶基因的GO term富集和KEGG通路分析结果显示，77个差异表达的miRNA潜在的靶基因参与了广泛的生物学过程、细胞组成和分子功能，并在一些生物学通路显著富集。本研究重点关注和免疫功能、应激反应等相关的富集，如白细胞介素合成、细胞因子活性、细胞因子受体活性、B细胞受体合成、B细胞凋亡、热应激、氧化应激以及细胞因子受体互作通路等。后续将对这些免疫相关的靶基因及其对应的miRNA之间的靶向关系进行验证。此外，在高通量测序中还发现60个未知的miRNA，这些miRNA的生物学功能也有待进一步研究。因此，上述结果为进一步研究miRNA在动物应激反应、免疫调控等方面的分子机制奠定了基础，也为揭示家禽应激性免疫抑制转录后分子调控机制提供了依据。

(1)胡家庄碳酸岩型稀土矿流体包裹体以气液两相H2O包裹体为主，均一温度和盐度变化范围与微山稀土矿极具相似性，表明与其具有相似的成矿物理环境。

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当偏心率相同时,轴瓦开槽的油膜承载力与无槽相比有所下降，且随着宽径比的增加，降幅不断地增大。这是由于工字槽轴向宽度随着轴承宽径比的增加而不断增大，即油槽穿过油压峰值区域会不断增大，对峰值区油压影响程度也就越大。

[2] Moss E G. MicroRNAs: hidden in the genome[J]. Curr Biol, 2002, 12(4):138-140.

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射流区的特点是风速比较大，射流区粉尘得到较好的稀释，粉尘浓度低于其他区域；回流区风速较小，粉尘不能被充分稀释，并且端头粉尘又在射流作用下向回流区运动，导致该区粉尘浓度较高；涡流区风速小，粉尘常积聚于此区域，导致粉尘浓度偏高。考虑综掘工作面风速分布不均匀，且不能有针对性地改变出风口参数速度及方向角度，进而改善3个区粉尘分布。

参考文献：

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预测靶基因GO term富集结果显示，富集显著(P<0.05)的term有296条，涉及细胞组成(cellular component)30条，生物过程(biological process)207条，分子功能(molecular function)59条，与应激反应以及免疫功能相关的GO term有11条，主要涉及白细胞介素合成、细胞因子活性、细胞因子受体活性、B细胞受体合成、B细胞凋亡、热应激和氧化应激等方面。

当桥梁基础施工并养护完成之后，才能够进行桥墩的施工。承台施工时桥墩施工中的第一步数，需要利用承台来分散桥墩传递的应力。也有一部分公路桥梁在施工过程中不设置承台，桥墩的施工直接在桩基上进行。公路桥梁墩身施工过程中，需要对桥墩的垂直度、混凝土浇筑以及接桩质量进行严格的控制。

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本试验通过在日粮中添加外源皮质酮构建固始鸡雏鸡应激性免疫抑制模型。Solexa高通量测序结果显示，由14日龄固始鸡法氏囊小RNA文库中共鉴定到477个表达的miRNA(已知的417个)。对比同日龄正常组鸡法氏囊中miRNA表达谱，差异表达的miRNA有77个，其中34个上调表达和43个下调表达。通过对gga-miR-181b-5p、gga-miR-103-3p、gga-miR-20b-5p、gga-miR-460a-5p等基因的实时荧光定量验证分析，证实高通量测序结果是可靠的。

东亚银行正在推广“跨国企业集团跨境人民币资金池集中运营”业务，并与东盟和南亚国家的银行业金融机构合作，帮助企业直接从东盟和南亚国家借入跨境人民币贷款，力争依托国家和地方优势政策，结合人民币国际化的有利趋势，为云南企业提供更为广泛、便利的跨境金融服务。

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科研经费绩效评价是对科研项目经费支出的效益和效率进行的客观评价。高校每年都有巨额的科研项目经费支出，而且这部分费用每年都在递增，那么如何将科研项目经费使用得最合理、效益最大化就尤为关键。目前各高校对于科研项目的验收主要停留在科研项目的成果上，而很少关注科研项目经费使用的绩效考评，这导致了部分项目结束后，科研经费有结余可项目还没有结题，或者已经结题了却没有去财务部门办理相关手续，导致结余科研经费长期挂帐，甚至个别项目负责人将经费挪为他用。

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