牛支原体是一种能够造成全世界范围内育肥牛以及奶牛多种疾病综合征的重要病原体[1]。牛支原体能够在宿主体内持续存在并引起慢性疾病，临床症状主要包括慢性肺炎、多发性关节炎综合征、中耳炎、角膜结膜炎、脑膜炎、乳腺炎以及生殖器官疾病[2],给世界养牛业造成了重大的经济损失。在美国，牛支原体感染率最高可超过70%，对养牛业每年造成超过1.4亿美元的损失[3]。在欧洲，25%～33%的牛肺炎与牛支原体有关[4]。2008年以来，国内犊牛和奶牛场牛支原体流行日趋广泛，危害日趋严重[5]。

牛支原体基因定点突变技术的缺乏一直阻碍着对其致病机理的研究。转座子能够作为研究支原体的一种重要的遗传工具。长度为4.7 kb的转座子Tn4001，具有庆大霉素(gentamicin，Gm)、妥布霉素和卡那霉素抗性基因，由于其足够小，可以作为克隆载体使用，特别适用于支原体的遗传操作研究[6]。经修饰的Tn4001转座子(Tn4001mod)具有额外的酶切位点[7]。2005年，基于转座子Tn4001mod的自杀性质粒pISM2062首次被证实可通过电穿孔方法将其导入牛支原体PG45株并稳定存在[6]，为牛支原体基因功能和致病机制研究带来曙光。国内牛支原体引起的犊牛肺炎发生普遍，多数犊牛肺炎分离株与引起乳房炎的PG45株存在较大基因差异，处在不同进化分支中[8]。本研究选择引起犊牛肺炎的国内牛支原体08M株为研究对象，经抗性测定、质粒转染、克隆筛选及PCR测定等成功构建了08M株的突变体文库，为研究牛支原体的致病机制提供了技术平台。

闽东方言包括南北两片，南片方言，包括福州、福清、长乐、永泰、连江、古田、屏南等都是只有1个鼻音韵尾[ŋ]，福州方言早在《戚林八音》时代，只有一套鼻音韵尾[ŋ]，中古三套鼻音韵尾的合并已经完成，我们无法观察到具体的音变过程。闽东北片方言鼻音韵尾在多数北片方言点也已经归并为一套鼻音韵尾[ŋ]，也完成了音变过程。林寒生[18]选取闽东北片方言的福安、宁德、寿宁、周宁、福鼎5个点，只有宁德方言保存[m、ŋ]尾，周宁方言保存[n、ŋ]尾，其它点都只有[ŋ]尾。

1 材料与方法

1.1 菌株及质粒载体

牛支原体08M株为本实验室于2008年从患有肺炎的犊牛肺脏中分离获得。根据文献报道的PCR及16S rRNA基因序列分析测定为牛支原体[9]。携带有转座子Tn4001mod的pISM2062质粒由美国爱荷华州立大学兽医学院 F Chris Minion教授馈赠，本实验室保存。

相关研究人员在对轧钢加热温度控制的研究中发现，设备的转换率偏低是一个很大的问题。具体来说，参与燃烧的空气和燃料的比例不能合理的控制，将会造成燃烧效率低下。如空气使用量较大，烟气量将会增加，当空气被排除炉外时，会带走很多的热量，降低转换率；如空气使用量不足，燃料得不到充分的燃烧，也将造成转换率低。同时，空气量不足，大量燃气随烟气排出炉外，不仅造成能源浪费，还将造成环境污染。

1.2 主要材料

无内毒素质粒提取试剂盒购自美国Omega公司；细菌基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；DIG High Prime DNA labeling and Detection Starter Kit Ⅱ及High Pure PCR Product Purification Kit均购于罗氏公司；Hybond-N+尼龙膜购于英国Amersham公司。

[7] Knudtson K L, Minion F C. Construction of Tn4001modlac derivatives to be used as promoter probe vectors in mycoplasmas[J]. Gene, 1993, 137(2):217-222.

使用转座子特异性引物Tn1和Tn2对提取的DNA进行PCR测定，扩增400 bp长的Tn特异性序列[6]。1%琼脂糖凝胶电泳观察结果。

1.3 主要培养基的配制

改良Thiaucourt’s 液体培养基(简称液体培养基)：PPLO肉汤(21g/L)、丙酮酸钠(2 g/L)、灭活马血清(200 mL/L)、酵母浸出液(100 mL/L)、葡萄糖(2 g/L)、1%酚红(2.5 mL/L)、青霉素(20万U/L)、10%醋酸铊(1 mL/L)，调节pH至7.2～7.4。改良Thiaucourt’s 固体培养基(简称固体培养基)：PPLO琼脂(35 g/L)、丙酮酸钠(2 g/L)、灭活马血清(200 mL/L)、酵母浸出液(100 mL/L)、葡萄糖(2 g/L)、青霉素(20万U/L)、10%醋酸铊(1 mL/L)，调节pH至7.2～7.4。

1.4 主要仪器

Genepulser xcellTM Electroporation system 购自美国BIO-RAD公司；核酸杂交炉购于德国GFL公司。

1.5 Gm对08M株的最低抑菌浓度(MIC)测定

1.5.1 颜色变化单位(CCU)测定

将冻存的08M菌株F7代按1∶10比例接种于液体培养基，采用10倍梯度稀释法稀释至10-10。吸取200 μL不同稀释倍数的菌液置于96孔板，每个稀释倍数做8个重复。将96孔板置于37 ℃培养箱中，每24 h观察1次，连续观察1周，记录结果。

下半场会议由王禹浪教授主持，蒙古国成吉思汗大学校长拉布噶苏荣教授、日本城西国际大学藤井一二教授、松荫大学山本明夫教授、黑河学院远东研究院院长谢春河教授分别做了学术发言，最后王禹浪教授做大会总结报告。

1.5.2 Gm的MIC测定

直到现在，遗传工具的缺少仍阻碍着对牛支原体毒力因子的研究，而对发病机理及毒力因子的研究又是开发治疗及预防措施以应对牛支原体感染的基础。牛支原体基因定点突变技术目前还没有实现，转座子是目前已知能够用于支原体的遗传操作工具。将携带有Tn4001mod的质粒pISM2062通过电转染技术导入细胞，造成随机的基因插入失活，被证明是进行牛支原体遗传操作的有效工具。

1.6 电转化试验

根据前期对牛支原体08M株的生长曲线测定结果，确定菌液到达对数生长后期所需时间[11]。将培养至对数生长后期(活菌数约为1×107～1×108 cfu/mL之间)的菌液进行感受态细胞的制备[12]及pISM2062质粒电击转化试验，电转化后试验组菌液涂布于含50 μg/mL Gm抗性的固体培养基，对照组菌液涂布于无抗性和Gm抗性固体培养基。将平板置于37 ℃ 5% CO2培养箱中，每天观察支原体菌落生长情况至第10天。使用一次性灭菌巴氏吸管挑取平板生长菌落，置于2 mL含有50 μg/mL Gm的液体培养基的试管中，37 ℃温箱培养，对生长变黄的菌液进行保存并提取DNA，备用。

1.7 PCR测定

还有观点认为侵犯的客体是公司、企业人员职务行为的廉洁性。笔者认为该观点不可取。商业贿赂犯罪应当区别于国家工作人员贿赂犯罪。考虑到市场经济活动中竞争的特性，还考虑到经营者所从事活动的非公务性，从这两点出发，因此我们不应对普通公司、企业的人员提出较为苛刻的要求，要求其职务行为的廉洁性。

1.8 转座子插入稳定性检测

随机挑取10株PCR阳性的突变克隆菌株，在含有50 μg/mL Gm抗性的液体培养基中连续传代10次后，提取DNA检测Tn特异性序列[6]，评估转座子插入的稳定性。

1.9 转化株Southern blot检测

挑取2株转化株在Gm抗性液体培养基中连续传10代，提取第5代和第10代菌液的DNA，取10 μg进行Soutnern杂交。使用400 bp的质粒特异性序列为模板，采用随机引物法标记探针并对探针进行纯化，检测标记效率。使用内切酶BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ对转化株DNA双酶切[6]。杂交液中探针浓度为25 ng/mL。

当量子照片的不确定性被激发，而非立刻产生的可靠性，照片中的影像便不能被僵化。精心安排的新闻发布会发生了——也没有发生。照片和它的权威性再也不能被当作理所当然。[1]194

2 结果

2.1 Gm对08M株的MIC

08M株菌液浓度为1.13×107 CCU/mL。当Gm的浓度为16 μg/mL时能够完全抑制08M的生长，为了避免假阳性，选用50 μg/mL的Gm作抗性筛选用。

2.2 电转化试验

观察37 ℃ 5% CO2培养箱中培养10 d的平板上菌落生长情况。结果显示，试验组有菌落生长，但有的菌落生长不佳(图1)。抗性平板上的对照组没有菌落生长，将对照组涂布在无抗性平板上的菌落进行计数，结果为1.46×108 cfu/mL。使用一次性灭菌巴氏吸管共挑取试验组菌落445个，置于液体培养基培养，结果380个菌落生长，对生长菌落甘油保菌进行后续测定。

2.3 PCR鉴定

结果显示，阳性转化样品及质粒对照能够扩增到400 bp特异性目的片段，野生型08M菌株PCR无目的片段(图2)。共检测得到263个阳性克隆，阳性率为69.21%(263/380)，根据对照组菌液涂无抗性平板后的菌落计数结果，计算出转化效率为1.8×10-6(263/1.46×108 )。

图1 抗性平板上生长的菌落(100×)

M.DNA分子量标准；1-17. 突变体样品依次为A304、A305、A307、A310～A323；18. pISM2062质粒；19. 08M DNA;20. ddH2O

图2 牛支原体08M株转化子DNA的PCR分析

2.4 稳定性检测

挑取的阳性突变体连续传10代后，PCR扩增仍可检测到400 bp特异性目的片段，表明转座子可稳定存在于突变株中(图3)。

M.DNA分子量标准;1-10. 转化株样品(A027、A042、A044 、A057、A060、A067、A076、A085、A347、A405)；11. pISM2062质粒；12. 08M DNA; 13. ddH2O

图3 转化株传10代的PCR测定结果

2.5 转化株Southern blot测定

如图4显示，挑选的A347和A405转化株在传5代和10代后，未检测到多次插入，表明转座子稳定存在于转化株基因组中。2个杂交条带分子量均在7 500 bp左右。

M.DNA分子量标准；1，A347(5代)；2.A405(5代)；3.A347(10代)；4.A405(10代)；5.08M野生型

图4 转化株Southern blot结果

3 讨论

流域生态系统是“山水林田湖草”的生命共同体。同一个流域是由降水量和地表径流把流域内山水林田湖草各部分联系在一起，其中湿地，特别是河流的水资源、水生态、水环境和水灾害集中反映了山水林田湖草各部分之间发生联系的过程。这一过程决定了流域生态系统和各子系统的结构与功能。流域生态系统的食物网中最重要和最敏感的是水生生物，特别是鱼类。评估与维持长江流域生态系统健康重要标志是水生生物，特别是鱼类多样性。

参考支原体MIC药敏试验方法进行[10]，共进行3次重复。将加好样的96孔板置于37 ℃温箱中，每隔12 h观察1次结果，连续观察1周，记录结果。

抗生素对支原体的MIC试验，要求菌液浓度在1×103～105 CCU/mL之间，所以需对待测菌液进行CCU测定，进而对抗生素MIC进行测定。本试验预先测定了试验菌株08M株的抗生素抗性，并根据对Gm的MIC选择了高于MIC浓度的抗性平板进行筛选，提高了阳性率，降低了建库的工作量。国外已经使用pISM2062质粒通过电转化技术成功构建了来源于牛乳腺炎的牛支原体PG45株的突变体库[19]，本研究将携带有转座子Tn4001mod的质粒pISM2062导入引起犊牛肺炎的国内分离株08M株进行突变体文库的构建,PCR检测表明突变株传代10次后转座子可稳定存在，Southern blot测定显示突变株在传代过程中转座子不存在二次及多次插入，从而证实牛支原体08M株突变体库构建成功。

先用较坚硬的石块回填槽孔，石块不宜太大；然后进行重新造孔。重新造孔进尺不宜太快，发现孔斜时应再次回填石块重复造孔。

4 结论

本研究成功构建了牛支原体08M株的突变体库并进行了稳定性检测，为后续开展牛支原体基因鉴定及功能研究搭建了技术平台。

参考文献：

室宿又称西壁，在10月中旬时，出现在南方天空水瓶座与南鱼座正上方。室宿共有星官11个：室（营室，位于龟身）、离宫（皇帝的行宫）、雷电（雷神）、垒壁阵（军营四周的防御工事）、羽林军（皇帝的近卫军）、钺（刑具，斧头）、北落师门（军营的北门，也有人说它代表驻扎在北方的羽林军的南门）、八魁（捕捉禽兽的罗网，也代表负责捕猎禽兽的官员）、天纲（军帐）、土公吏（负责土木营造的官员，或负责物流的官员）、螣蛇（形似飞蛇）。室宿在蛇身的位置上，包含两颗星：室宿一和室宿二。春秋时期，室宿在秋末冬初的傍晚出现在南方中天，此时是农闲时节，人们利用这时修房，因此得名营室。

牛支原体是引起肉牛和奶牛发病的一种重要病原体，能够感染机体多种组织和器官，也可从健康的牛体内分离。牛支原体能够通过多种方式逃避宿主免疫系统清除，其对宿主免疫系统的破坏在与其他病原体协同感染过程中发挥了重要作用[13-15]。由于牛支原体不具有细胞壁，作用于细胞壁的抗生素如β-内酰胺类、万古霉素等对其完全没有效果，且研究证实可用于牛支原体的抗生素中，其耐药性也在逐渐增加[16]。虽然对牛支原体疫苗的研究已经进行了几十年，弱毒疫苗、灭活疫苗以及亚单位疫苗都有涉及，但是目前仍然没有商业可用的有效疫苗能够预防牛支原体感染[17-18]。

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为了验证实验的有效性,对夜晚红外视频拍摄的狼和行人进行测试。图4视频图像大小为432×272。图5大小为960×576,实验中σ=9.5 m/s,k=4,T1=0.7,T2=50,图4与图5(a)为传统HOG+SVM的目标检测,图5(b)为使用高斯背景建模法后进行HOG+SVM的目标检测,并对越界人进行判断的基础上,加上行人跟踪算法的结果。

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2.3 两组患者术后并发症的发生情况比较 对照组术后并发症的发生率高于观察组，差异有统计学意义(χ2=10.57，P<0.05)。见表4。

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再加上相关规范并未对地漏深度作出明确规定，导致管道在正式排水过程中，很容易受到管道内部压力作用的影响，出现破坏水封等方面的隐患问题。最重要的是，如果水封设计深度不合理或者为达到规定标准，很容易对水封造成危害影响，管道内部的有毒气体会进入室内，给居住者的人身安全带来威胁。

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1.1.4 结局指标 不良反应总发生率，恶心、呕吐发生率，颜面潮红发生率，头痛、头晕发生率，心动过速发生率，低血压发生率。

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