猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的一类严重危害养猪业的高度接触性传染病[1]。PRRSV感染激活NF-κB通路是影响病毒基因转录和复制的重要一步[2]。当细胞受到病毒感染、理化因素和免疫抑制等外界刺激时，NF-κB通路中的诱导性激酶NIK被激活，进而激活IκB激酶复合物IKK。IKKγ作为IKK蛋白激酶复合体的一员，是NF-κB信号通路活化所必须的关键因子，IKKγ正常状态下游离在细胞胞质中，当NF-κB通路被PRRSV激活后，IKK激酶复合物被激活，IKKγ与IKKα、IKKβ两个亚基结合，维持IKK激酶复合体的空间构型且IKKγ在IKK激酶复合体活化的过程中起着信息传递作用[3-4]，敲除IKKγ基因，NF-κB通路活化就会受到抑制。还有研究表明，Marc-145细胞感染PRRSV早期和末期会显著激活PI3K/AKT通路[5]，这一现象是由磷酸化AKT表达变化来体现的。感染PRRSV后各通路之间的联系目前尚不清楚。本研究采用NF-κB上游通路PI3K/AKT通路的特异性抑制剂LY294002初步探索这2条通路上的相关因子IKKγ基因和蛋白表达的变化，研究NF-κB通路的调节因子IKKγ与PRRSV之间的关系。

1 材料与方法

1.1 细胞和病毒

Marc-145细胞本实验室冻存；高致病性PRRSV活疫苗(JXAI-R株，广东大华农动物保健品股份有限公司，生产批号：1012001)，由本试验扩增后放置于液氮中长期保存。

思想教育工作是高校学生管理工作的重要模块，思想是否健康直接关系着一个人的未来发展方向。作为与学生联系最为紧密的辅导员，要以身作则，利用自己的职业道德素养，对学生进行思想教育，使他们能够树立正确的世界观、人生观、价值观，使他们能够自觉完成大学学习的任务，实现人生的自我价值和社会价值。

1.2 抑制剂

LY294002(#9901)，购自美国Cell Signaling Technology公司。

1.3 主要试剂

抗IKKγ鼠单克隆抗体，购自美国Cell Signaling Technology公司；抗β-actin鼠单克隆抗体、山羊抗小鼠IgG-HRP，购自北京康为世纪公司；鼠抗PRRSV N蛋白单克隆抗体，购自美国Rural Technologies公司；反转录试剂盒PrimerScript® RT reagent Kit with gDNA Eraser，购自大连TaKaRa公司；荧光定量试剂盒QuantiFast® SYBR® Green PCR Kit，购自QIAGEN公司；TRIzol® Reagent，购自Invitrogen公司。

1.4 PRRSV的毒力测定

将病毒液按10-1～10-8倍比稀释后，按100 μL/孔接种于已长成单层的Marc-145细胞的96孔板中，每个滴度重复8次，置于37 ℃、5% CO2培养箱中继续培养120 h，并每天观察记录细胞的病变效应和病毒的半数感染量。按照Reed-Muench公式计算病毒的TCID50。

1.5 PRRSV的间接免疫荧光检测(IFA)

参照Sun[6]的方法建立PRRSV感染Marc-145细胞的模型，将长成单层的Marc-145细胞消化后将细胞密度调整到2×105/mL后接种到96孔板内，100 μL/孔，放入CO2培养箱培养。待细胞长成单层时，弃去培养基，PBS冲洗细胞数次，加入细胞生长维持液，100 μL/孔，此为细胞对照组，设置4个重复。再将100 TCID50病毒稀释液接种细胞，100 μL/孔，设置4个重复。连续培养48 h后，弃去细胞上清液和病毒稀释液，用PBS清洗数次，用固定液固定细胞0.5 h(甲醇∶丙酮=1∶1，V∶V)，弃去固定液，再用PBS冲洗数次。加入N蛋白单克隆抗体(1∶50)，50 μL/孔。在细胞培养箱内孵育2 h，将细胞培养板取出，用PBS清洗5 min/次，洗涤3次。接着加入山羊抗鼠IgG(1∶20)二抗，避光放置37 ℃，1 h。PBS清洗5 min/次，洗涤3次。倒置显微镜200倍观察，拍照记录。

1.6 MTT法检测抑制剂对Marc-145细胞增殖的影响

1.3 统计学分析 应用Epidata 3.2录入建立数据库，SPSS21.0进行数据分析。采用卡方检验比较三种职业流动人口艾滋病相关知识、态度、行为及接受干预检测服务的差异，P＜0.05为差异有统计学意义。

1.7 qPCR检测IKKγ mRNA基因表达水平

待Marc-145细胞长成单层后，以2 mL/孔、2×105/mL的密度接种到6孔细胞培养板中，放入37 ℃、5% CO2培养箱中生长，待细胞铺满孔底壁80%时，弃掉培养液，设置试验分组：①细胞对照组：只加细胞维持液，每孔加2 mL；②病毒组：只加入100 TCID50病毒液，每孔加入2 mL;③抑制剂组：先加抑制剂1 h，后换成含10 μmol/L抑制剂的维持液，每孔加入2 mL;④抑制剂+病毒组：先加抑制剂1 h，再加入含10 μmol/L抑制剂的病毒稀释液，每孔加入2 mL。每组设3个重复，分别培养24 h、48 h后弃去上清液，PBS清洗3次后收集样品。

用TRIzol法提取各处理组细胞总RNA，用反转录试剂盒，反转录成cDNA；然后以cDNA为模板，华大基因合成引物：β-actin(F：5′-GGACTTCGAGCAGGAGATGG-3′；R：5′-GCACCGTGTTGGCGTAGAGG-3′)；IKKγ(F：5′-TGCCACTAAGGAATGCCAGG-3′；R：5′-GTGATAGGCCACCTGCAACT-3′)。参照PCR试剂盒说明书进行扩增，琼脂糖凝胶电泳，割胶回收，测序验证。采用2-ΔΔCT相对荧光定量PCR分析方法测定目的基因的相对表达量。

1.8 Western blot检测IKKγ蛋白表达水平

研究表明多种病毒感染宿主细胞是通过干扰信号通路来实现的，通路的干扰除了可引起病变外还可引起宿主细胞的生理变化。通过调节细胞通路来操纵细胞的凋亡或生存有利于病毒的复制[9]，在抗病毒研究中对参与病毒复制的细胞因子的识别是很重要的。

2 结果与分析

2.1 PRRSV毒力测定

[3] Yamaoka S, Courtois G, Bessia C, et al. Complementation cloning of NEMO, a component of the IκB kinase complex essential for NF-κB activation[J]. Cell, 1998, 93(7):1231-1240.

2.2 PRRSV的间接免疫荧光检测

如图1所示，A图为正常细胞组，在背景色上未看见绿色荧光；B图为感染PRRSV病毒组，可以看到背景色上有绿色荧光，细胞质中可见这种特异性荧光，且绕核分布。说明PRRSV成功感染Marc-145细胞。

其三，突出群众的广泛参与。随着“文革”式的政治运动退出历史舞台，运动式治理开始逐渐成为我国社会治理活动中的常态现象。运动式治理的动员对象虽主要是体制内的领导干部，但在宣传上则必须突出群众的广泛参与[9]。因为只有突出群众的广泛参与，营造出干部、群众齐心协力的景象，才能更好地体现运动的合法性。

图1 PRRSV感染Marc-145细胞间接免疫荧光结果(标尺为500 μm)

2.3 MTT法检测抑制剂对Marc-145细胞增殖的影响结果

不同处理组用MTT法检测LY294002对Marc-145细胞的增值抑制率如图2所示。不同浓度LY294002作用于Marc-145细胞后均有抑制细胞增值的作用，在48 h内具有剂量和时间依赖性，超过48 h抑制作用开始下降。LY294002的最低浓度为10 μmol/L时，在24 h和48 h对Marc-145细胞的增殖抑制率接近50%，此时LY294002对PI3K/Akt信号通路抑制作用明显。

图2 抑制率结果

2.4 qPCR

[6] Sun N, Li E, Wang Z, et al. Sodium tanshinone IIA sulfonate inhibits porcine reproductive and respiratory syndrome virus via suppressing N gene expression and blocking virus-induced apoptosis[J]. Antivir Ther, 2014, 19:89-95.

注：与对照组比，*表示差异显著(P<0.05)，**表示差异极显著(P<0.01)

图3 IKKγ mRNA的相对表达量

2.5 Western blot结果

Western blot得到各组不同时间点的目的蛋白IKKγ和内参β-actin蛋白条带如图4。24 h和48 h β-actin量基本没什么变化，与对照组比较，病毒组IKKγ表达量明显上调，抑制剂组和正常组比较表达量下降，抑制剂和病毒共孵育组与对照组比较表达量下调。

排砂管岩屑返回微波信号的检测是一个工程实际问题，推导多普勒回波信号的时候可进行必要的近似和合理假设，比如排砂管中岩屑的大小和形貌，根据文献[7-8]，气体钻井过程中，最终能被成功带回地面的岩屑直径大多数小于2.5 mm，钻头破碎岩石形成的岩屑颗粒多成片状椭圆形[8]，为简化计算，该处假设每个岩屑颗粒都是球形的。其假设如下：

图4 不同处理组24 h、48 h后IKKγ蛋白表达变化

3 讨论

提取1.7中各处理组细胞的总蛋白，利用BCA法测定蛋白浓度，确保上样量相同。SDS-PAGE(10%分离胶)凝胶电泳，对目的蛋白IKKγ和内参蛋白β-actin进行Western blot分析。

《住房公积金管理条例》规定：“职工和单位住房公积金的缴存比例均不得低于5%，不得高于12%。”但公务员的住房公积金基本是按照全额工资作为基数，而且缴存比例多为12%，而私营企业大部分是不缴纳住房公积金的，由于不平等的劳资关系，员工也不敢告发，甚至很多员工对相关政策法规不太了解，更不懂得维护自己合法权益。即使企业为员工缴纳公积金，多数也是按照5%缴纳的，而且缴费基数普遍较低。

按照说明书将1.5 mg的LY294002溶于98 μL的DMSO，配置成浓度为50 mmol/L的储备液在-20 ℃冻存用于后续试验。按照王迪迪等[7]方法将抑制剂储备液稀释成8个梯度，每个浓度设置6个重复，同时设置细胞对照组(每孔加100 μL含1% DMSO的细胞维持液)，接种到已长至单层Marc-145细胞的96孔板中(100 μL/孔)，分别在抑制剂作用1、24、48和72 h后收集细胞，弃上清，用PBS冲洗2次，每孔加入20 μL浓度为5 mg/mL的MTT，放入培养箱继续培养4 h，然后吸掉MTT，在每孔中加入DMSO 100 μL，放置于细胞培养箱孵育，直至结晶充分溶解。490 nm波长测定各孔OD值。计算增殖抑制率=(1-试验组OD值/对照组OD值)×100%。

NF-κB最早发现于小鼠的B淋巴细胞中，表达κ轻链的一个核因子，目前发现于多种细胞模型中，是一个家族转录因子在炎症中扮演关键的角色，调控免疫、细胞增殖、分化和生存。诱导NF-κB激活取决于NF-κB蛋白的抑制剂(IκBs)的脱磷酸化。该蛋白激酶维持了在静息状态下细胞质中NF-κB的二聚体构象[10]。大多数不同信号通路导致NF-κB激活是通过聚集了IKK，其对IκB磷酸化和NF-κB通路转导至关重要。NF-κB信号通路与PRRSV感染宿主细胞引起的与免疫相关的方面还不清楚，NF-κB在PRRSV感染宿主细胞而导致发病的机理报道甚少，需要进一步研究。相关研究报道[11]，AKT可通过调节IκB激酶IKK来调节NF-κB通路，但这2条通路在感染PRRSV后，它们之间具体是怎么互相影响调节的，其机理还尚不清楚。本试验采用了PI3K/AKT通路的特异性抑制剂LY294002抑制通路，通过观察NF-κB通路中IKKγ的表达变化，初步探索这2条通路间存在的联系。

LY294002抑制PI3K/AKT途径是通过抑制PI3K两个亚基的结合和募集到膜，抑制下游的靶点的磷酸化激活，从而抑制PI3K/AKT途径。Akt可以通过磷酸化作用激活或抑制下游靶蛋白NF-κB调节细胞的迁移、凋亡、分化和增殖。但加入抑制剂后对下游通路中细胞因子的影响及其影响机理尚不清楚，有待进一步研究。

参考文献：

[1] 李长尧, 王胜男, 李江南,等. 猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP4切割IKKα抑制β干扰素产生的研究[J]. 中国预防兽医学报, 2016, 38(06):425-428.

[4] Tang E D, Wang C Y, Xiong Y, et al. A role for NF-κB essential modifier/IκB kinase-γ(NEMO/IKKγ) ubiquitination in the activation of the IκB kinase complex by tumor necrosis factor-α[J]. J Biol Chem, 2003, 278(39):37297-37305.

[2] Zhang Q,Huang C,Yang Q, et al. MicroRNA-30c Modulates type I IFN responses to facilitate porcine reproductive and respiratory syndrome virus infection by targeting JAK1[J]. J Immunol, 2016, 196(5):2272-82.

综合眼观病变结果及Reed-Muench[8]公式，得出PRRSV感染Marc-145细胞的TCID50为10-6.41。

一篇文章实际上就等同于一个小型知识库，其中蕴含着学生可以学习的许多知识。而朗读是其获取这些知识的一个重要途径，利于培养学生的综合语文能力。对于中年级的小学生而言，其正处于快速发展的阶段，需要在朗读的过程中去感受更多的语言美，去感悟更多的人生道理，帮助自身塑造起良好的人格品质。因此，教师不管在课前还是课中，都应该对学生贯彻落实有效的朗读指导，使其可以在朗读过程中获取其应学会的知识。

[5] Zhang H, Wang X. A dual effect of porcine reproductive and respiratory syndrome virus replication on the phosphatidylinositol-3-kinase-dependent Akt pathway[J]. Arch Virol, 2010, 155(4):571-575.

采用相对荧光定量的方法检测IKKγ基因的相对表达量如图3，2-△△CT计算后显示，与对照组相比，感染PRRSV后的IKKγ基因上调(P<0.05)；加抑制剂LY294002后，IKKγ基因显著下调(P<0.01)；加抑制剂LY294002和PRRSV共孵育的试验组，IKKγ基因显著下调(P<0.01)。

[7] 王迪迪, 葛堂栋, 杨玉, 等. LY294002 对人白血病 HL-60 细胞的体外抑制作用[J]. 中国老年学杂志, 2013, 33(22):5617-5619.

[8] Rodriguez-Gomez I M, Gomez-Laguna J, Carrasco L. Impact of PRRSV on activation and viability of antigen presenting cells[J]. World J Virol, 2013, 2(4):146-151.

[9] Wei L, Zhu S, Wang J, et al. Activation of the phosphatidylinositol 3-kinase/Akt signaling pathway during porcine circovirus type 2 infection facilitates cell survival and viral replication[J]. J Virol, 2012, 86(24):13589-13597.

废酸原液中含有CuSO4、PbSO4等杂质，由于PbSO4杂质是致密粘性颗粒，其影响了后续硫化反应砷滤饼的含水率，分离出后，可以降低后续的铜砷滤饼含水率。提高闪速炉的电收尘能力，可直接降低进入废酸原液中的悬浮物含量，从而减少砷滤饼的发生量。在净化区域也可利用过滤器将废酸原液中的悬浮物含量降下来，从而在源头处减少悬浮物进入砷滤饼中。

[10] Zhao J L, Ma C, O’Connell R M, et al. Conversion of danger signals into cytokine signals by hematopoietic stem and progenitor cells for regulation of stress-induced hematopoiesis[J]. Cell Stem Cell, 2014, 14(4):445-459.

随着人们生活水平，生活质量的不断提高，人们对于食物品质的需求也越来越高。但是，近几年来食物安全问题越发严重，究其根本，是因为相关部门对于动物疾病防治工作的忽视，兽医对于动物疾病认识的缺乏，和用药的失衡。想要解决这一难题，提升肉类的品质和安全，就必须要加强动物疾病管理。

[11] Zhou B P, Hu M C T, Miller S A, et al. HER-2/neublocks tumor necrosis factor-induced apoptosis via the Akt/NF-κBpathway[J]. J Biol Chem, 2000, 275(11):8027-8031.