马立克病(Marek’s disease，MD)是由马立克病病毒(MDV)引起的一种鸡的恶性淋巴组织增生性疾病，是危害世界养禽业最严重传染性疾病之一[1]。MDV是一种α-疱疹病毒，可分为3个血清型，其中只有血清Ⅰ型(MDV-1)具有毒力或致瘤性，如Md5强毒株及失去致病能力的CVI988/Rispens疫苗株[2]。因此，MDV-1感染或致瘤机制的阐明是有效控制马立克病的基础工作之一。

MDV可编码多个癌基因，包括Meq、pp38和ICP4等。其中Meq在MDV诱导的所有肿瘤和淋巴瘤细胞系中表达，且在MDV-1中特异性表达，被认为是MDV主要致瘤基因[3]。Meq(MDV Eco-Q)是由位于病毒基因组内部长重复序列区(internal repeat long, IRL)的EcoRI-Q 片段编码的一个由 339 个氨基酸组成的 bZIP 转录因子[3]。p21即细胞周期蛋白依赖性激酶抑制蛋白，属于CDKI家族，可与细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinases, CDKs)结合，并抑制其激酶活性，从而引起细胞周期阻滞[4]。p21蛋白表达调控主要有2种机制：(1) p53依赖途径：p21作为抗肿瘤蛋白p53的下游基因，在细胞受到刺激时，受p53的转录调控而大量表达; (2) p53非依赖途径：例如p21可被转化生长因子-β、表皮生长因子等转录激活，导致细胞周期阻滞[5]。

已有研究发现，Meq与p53结合，从而抑制p53对其靶基因启动子的转录激活功能[6]，但也存在Meq直接调节p53靶基因基因转录的可能性。本研究旨在证明Meq对p21基因的转录调节作用，为进一步了解Meq在MDV感染中的作用机制提供新线索。

印支-燕山期因挤压作用，在逆断层下盘形成挤压褶皱，其轴线平行于逆断层走向，在褶皱顶部派生一系列张性构造裂缝，主裂缝走向北西且平行逆断层，如桩古9、桩古9-2、桩古10-17井等高产井均为该类裂缝后期的风化、剥蚀和溶蚀作用提高了储集性能，特别是为潜山的峰区，溶蚀作用更强烈，形成大的溶洞。

1 材料与方法

1.1 主要材料

pcDNA3-2×Flag、pGEM-T-easy、pGL3-basic、pCMV-RL质粒，DH5α感受态细胞，H1299细胞、MDV强毒株Md5、疫苗株CVI988/Rispens、鸡p53和p21[7]多克隆抗体由本实验室制备并保存；鸡胚成纤维细胞(chicken embryo fibroblasts, CEF)按常规方法制备原代和次代细胞；VP22单克隆抗体由中国农业科学院上海兽医研究所陈鸿军研究员馈赠[8]；pEYFP-C1-Meq由中国农业科学院上海兽医研究所马志永研究员馈赠[6]。Phanta Max Super-Fidelity DNA聚合酶和2×Taq Master mix购自南京诺唯赞生物公司；LA Taq DNA聚合酶购自日本TaKaRa公司；T4 DNA Ligase购自英国NEB公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自美国Promega公司；转染试剂Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司；优级胎牛血清购自德国PAN Biotech公司；DMEM培养基购自美国Gibco公司；0.25%胰酶购自美国Amresco公司；青霉素-链霉素(双抗)溶液(100×)购自香港BBI生命科学有限公司；Biospin胶回收试剂盒、Biospin质粒DNA小量提取试剂盒购自杭州博日科技有限公司；Flag抗体、actin抗体和辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔或抗鼠IgG购自美国Sigma公司；化学发光(ECL)试剂盒购自南京西腾生物科技有限公司；所有引物由南京金斯瑞公司合成；SPF鸡胚购自北京梅里亚维通。

应用SPSS 16.0对数据进行统计学处理。计数资料以相对数描述。组间差异采用χ2检验，卵巢透明细胞癌生存分析用Kaplan-Meier生存曲线分析和Log-rank检验，Cox回归模型筛选影响卵巢透明细胞癌独立因素。检验水准α=0.05(双尾)。

1.2 Meq真核表达载体的构建

为了进一步证明MDV感染对p21蛋白表达的影响，通过Western blot检测Md5或CVI988/Rispens毒株感染CEF细胞中p21表达水平的变化。结果显示，Md5毒株感染CEF细胞，从感染3 h开始，一直到2 d，p21的蛋白水平均明显高于未感染的对照组，而p53蛋白表达水平从感染2 d开始才有较明显的上升(图4A)。CVI988/Rispens毒株感染CEF细胞与感染Md5毒株出现类似的结果(图4B)。

第二，在高校进行思想政治教育工作的过程中要重视新媒体技术的应用，注重对新媒体的应用和信息技术队伍建设的培训和能力的提升，构建常态化的培训体系，积极拓展资源，组织思想政治教育工作者参加国家级、地区级、校级各类培训，并积极进行培训后的交流和总结，切实将培训收获运用到教育教学中，以此来提升思想政治教育工作的质量，提升思想政治教育工作者队伍的专业性。

1.3 重组荧光素酶报告载体的构建

根据鸡p21基因信息(Gene ID：378914)设计引物，上游引物(5′→3′)为p21-P-2960-KpnⅠ-F：CATGGTACCAGATCGCACTCCTCCATCTGCTTC，下游引物(5′→3′)为p21-P+68-XhoⅠ-R：ATTCTCGAGGTTCCTGCACGCTTTGCTGCTG。以鸡肌肉组织基因组为模板，常规PCR扩增鸡p21启动子区(-2 960至+68，共3 028 bp)，将胶回收产物与pGEM-T-easy连接，测序验证正确后，命名为pGEM-T-p21-P(-2 960/+68)。分析p21启动子区，设计引物，扩增启动子区-2 121/+68和-1 453/+68。引物信息(5′-3′)如下：p21-P-2121-KpnⅠ-F：CATGGTACCCAAGCACTGTGTTTGCACCCTC；p21-P-1453-KpnⅠ-F：GTTGGTACCGACGCCTCGCCTTCCATATG。用限制性核酸内切酶KpnⅠ和XhoⅠ对PCR回收产物和pGL3-basic载体进行酶切，连接转化DH5α感受态细胞，经酶切及测序验证正确后命名为pGL3-p21-P-(-2 121/+68)和pGL3-p21-P-(-1 453/+68)。

1.4 RT-PCR法检测表达Meq蛋白对p21 mRNA表达水平的影响

参照Lipofectamine 2000使用说明书，进行细胞转染。收集转染后36 h的各组细胞，应用TRIzol法提取总RNA，利用Oligo(dT)18引物反转录获得cDNA，以此为模板进行PCR，扩增Meq、p21、p53的特异性条带，并以actin为内参对照。根据Meq基因序列(登录号：HM488349.1)、p53基因序列(登录号：NM_205264.1)、p21基因序列(登录号：NM_204396.1)序列和actin基因序列(登录号：NM_205518.1)，应用Primer Premier 5.0软件设计用于RT-PCR的特异引物共5对，引物序列(5′-3′)如下：Meq-F：CTTTCTCT CGGGTCGACTTC，Meq-R： GTGACCCTTGGACTGCTTAC，产物大小347 bp；p53-F：AGGCGCGTTACCACGACGACGAGAC，p53-R：ACATGCGCACACGCGCACCTCGAAG，产物大小227bp；p21-F：GAACTTCAACTTCGAGACCG，p21-R:GGCTTATCGTGGACAACTCT，产物大小为300 bp；actin-F： GAGACCTTCAACA CCCCAGCCATG，actin-R：GCGACGTAGCACAGCTTCTCCTTG，产物大小287 bp。

1.5 Western blot检测表达Meq蛋白对p21蛋白表达的影响

[2] Venugopal K. Marek’s disease: an update on oncogenic mechanisms and control[J]. Res Vet Sci, 2000, 69(1): 17-23.

1.6 双荧光素酶报告试验

接种适量的H1299细胞到24孔细胞培养板，于8%胎牛血清和青霉素-链霉素混合液的高糖DMEM中培养18 h；用Lipofectamine 2000共转染250 ng重组质粒pGL3-p21-P、3 ng内参质粒pCMV-RL、250 ng对照组质粒pcDNA3-2×Flag或250 ng实验组质粒pcDNA3-Flag-Meq于每孔H1299细胞中；24 h弃营养液，PBS缓冲液洗2遍后，参照双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明书，测定荧光素酶活性。

1.7 Western blot检测MDV感染对p21蛋白表达的影响

接种适量的次代CEF细胞到35 mm细胞培养皿，于5%胎牛血清和青霉素-链霉素混合液的高糖DMEM中培养18 h；强毒株Md5或弱毒株CVI988/Rispens以4×104 MOI感染CEF，于3 h、6 h、12 h、1 d、2 d分别收集细胞，裂解于1×SDS-PAGE上样缓冲液；电泳后，进行Western blot，分别用p21、p53、VP22、actin抗体检测。以未感染细胞为空白对照，以actin为内参对照。

2 结果与分析

2.1 Meq蛋白表达对p21基因mRNA和蛋白表达水平的影响

在CEF细胞中瞬时转染Meq 36 h，通过RT-PCR和Western blot检测Meq对p21表达的影响。RT-PCR的结果显示，过表达Meq明显上调p21和p53的mRNA水平(图1A)。Western blot的结果显示，Meq蛋白的表达也能上调p21和p53的蛋白水平(图1B)。可见，Meq能够升高p21和p53的基因转录。

1. 转染pcDNA3-2×Flag；2. 转染pcDNA3-2×Flag-Meq

图1 RT-PCR(A)和Western blot(B)检测过表达Meq对p21表达的影响

2.2 pGL3-p21-P重组荧光素酶报告载体的构建

为了进一步证明Meq对p21启动子的转录激活作用，根据已发表的p53蛋白的顺式作用元件的特异序列[9]和Meq蛋白可能结合的AP-1位点的保守序列[10-11]分析了p21启动子的基因结构(图2A)。以鸡肌肉组织基因组为模板，成功扩增出预期大小的目的片段(图2B)，胶回收产物与pGEM-T-easy载体连接，经测序鉴定得到重组质粒pGEM-T-p21-P(-2 960/+68)。以该质粒为模板，又分别扩增出预期大小的目的条带(图2C)。以KpnⅠ和XhoⅠ酶切位点连接到pGL3-basic载体，经酶切鉴定得到重组质粒pGL3-p21-P-(-2 121/+68)和pGL3-p21-P-(-1 453/+68)。

对于北方气候较为干燥的地区，灌溉工作变得更加重要。对于整地情况良好、土地平整的情况，主要采用地面灌溉方式，保证植物生长。但这种方式容易造成土壤板结，因此需要进行一定的改良。对于地势不平或者灌溉条件差的位置，为提高作业标准，加强管理，通常会选择地下灌溉、喷灌或者滴灌的方式为花卉的生长提供必要的水分。由于硬水中存在不被植物吸收的营养物质，所以园林花卉灌溉通常使用的是软水，尽量使用河水、池塘水或者湖水进行灌溉，禁止使用工业废水灌溉花卉。由于井水的温度较低，对于植物生长具有一定的不利影响，因此应尽量避免使用井水。同时在种植过程中还应根据花卉的品种以及温度、湿度、季节进行灌溉调整，通常中午不宜浇水。

1. 鸡p21启动子区-2 960/+68；2. 鸡p21启动子区-2 121/+68；3. 鸡p21启动子区-1 453/+68；M. DNA 分子质量标准

图2 鸡p21启动子的基因结构分析(A)和PCR扩增(B和C)

2.3 荧光素酶活性的测定

H1299细胞为缺失p53基因的人肺癌细胞，因此，使用该细胞能够避免内源性p53的干扰。p21启动子荧光素酶报告试验结果显示，在H1299细胞中表达Meq蛋白，鸡p21启动子-2 121/+68区和-1 453/+68区均被激活，荧光素酶活性上升(图3A和图3B)。

a. 转染pcDNA3-2×Flag；b. 转染pcDNA3-2×Flag-Meq

图3 鸡p21启动子-2 121/+68(A)和-1 453/+68(B)荧光素酶活性的测定

2.4 MDV感染CEF细胞p21蛋白水平检测

根据MDV RB1B株的Meq(登录号：HM488349.1)基因序列设计引物，上游引物(5′→3′)为Meq-EcoRⅠ-F：ACGGAATTCATGTCTCAGGAGCCAGAGCC,下游引物(5′→3′)为Meq-XbaⅠ-R：GCTCTAGATCAGGGTCTCCCGTCACC。以pEYFP-C1-Meq质粒为模板，PCR扩增Meq基因片段，扩增程序如下：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 30 s；56 ℃ 45 s；72 ℃ 1 min，循环33次；72 ℃ 10 min；4 ℃维持。PCR反应结束后，回收目的片段；用限制性内切酶EcoRⅠ和XbaⅠ对PCR回收产物和真核表达载体pcDNA3-2×Flag进行酶切，连接转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经酶切及测序验证正确后命名为pcDNA3-2×Flag-Meq。

1.1 在土壤商情差的年份往往土壤温度高，施入的化肥因土壤缺水溶解速度慢，无机养分被土壤中的微生物分解吸附则不宜引起烧苗。相反土壤商情好则土壤温度低微生物活动能力差繁殖力低，而施入的化肥很快溶解，就会因土壤溶液中的高浓度化肥得不到有效分解，而导致玉米种子根系延伸而触及化肥烧根死苗。同时，由于玉米幼苗地下部分受低温寡照影响，叶面光合效率低，大量的无机养分得不到有效转化，致使根系发育不良植株生长缓慢，叶小叶薄叶发黄，严重致死叶死苗。

图4 Md5毒株(A)和CVI988/Rispens毒株(B)感染CEF细胞后p21蛋白表达水平的检测

3 讨论

MDV编码的Meq蛋白在病毒溶细胞感染期、潜伏期和转化的肿瘤细胞中均有表达，被认为是MDV的主要致瘤基因之一[3]。Meq是一个转录因子，与c-Jun/Fos肿瘤转录因子蛋白具有很高的相似性，是Jun/Fos转录因子家族中唯一源自疱疹病毒的成员[3]。Meq的下游靶基因包括病毒基因(如Meq和ICP4)和宿主细胞基因(如Bcl-2和CD30)，从而调节病毒复制和细胞转化[11-13]。但是，受Meq调节的靶基因尚待进一步挖掘。此外，Meq也能与致瘤蛋白或抑瘤蛋白形成复合物以调控细胞生长信号通路来诱导肿瘤形成。研究发现，Meq蛋白通过DNA结合区与p53蛋白相结合，并抑制p53蛋白对其靶基因启动子的转录激活动[6]。但是该研究并没有排除Meq对p21转录的直接调节作用：一方面，p21是p53的靶基因，p53对p21的调节作用可能掩盖了Meq自身对p21的调节；另一方面，此前研究中使用的并非鸡源p21启动子。本研究首次从mRNA和蛋白水平证明了Meq上调细胞中p21的表达；而且Meq能在缺失p53的细胞中激活鸡源p21的启动子；另外，首次在蛋白水平证明MDV-1感染细胞中p21和p53的表达水平均有升高，且p21升高的时间(3 h)明显早于p53(2 d)。可见，p21可能是Meq的靶基因。荧光素酶报告试验结果显示，Meq能够激活鸡p21启动子-2 121/+68区和-1 453/+68区的转录活性，且无明显差异，表明Meq在鸡p21启动子上的结合位点位于-1 453/+68区域，其具体定位还需进一步解析。

参考文献：

“讲”即是“讲责任”“讲案例”“讲安全”“讲清洁”。肇庆海事局推动企业落实安全生产主体责任；认真开展典型事故案例进航运企业、进船员培训机构“双进”活动；组织开展80余场水上交通安全知识“七进”（进企业、进校园、进社区、进渔村、进渡口、进机关、进船舶）活动；为宣传船舶防污染知识先后组织编写《广东海事局西江船舶污染物处置须知手册》和《西江船舶供受油作业安全手册》等。

（4）实验操作与交流：围占2格的图形，先在钉子板上围图形，并把围出的图形画下来，再和同伴说一说，这些图形是占2格吗？如何说明？

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p21是细胞周期蛋白依赖激酶抑制剂家族中的重要成员，与肿瘤的发生密切相关[14-15]。本研究发现，MDV-1强毒株Md5和失去致瘤能力的疫苗株CVI988/Rispens感染细胞后，p21蛋白表达呈现类似的上升趋势。因此，MDV-1对p21蛋白的调节可能并不与MDV-1的致瘤作用相关。研究发现，一些疱疹病毒通过抑制细胞DNA复制，影响宿主细胞的生长和分化，从而支持病毒DNA的合成[16]。例如，单纯疱疹病毒Ⅰ型(HSV-1)通过p53非依赖途径上调p21，引起G1期细胞阻滞，是HSV-1溶细胞复制过程所必须的[17]。因此，在MDV感染早期细胞中p21蛋白表达水平的升高，亦可能有利于MDV病毒的复制。

第一，社团活动场地流动性大、经费紧张。由于社团种类多、数量大，一般的社团活动地点设在校内，学校无法提供长期固定的活动地点，所以每次申请的教室或报告厅等地一旦被其他活动征用或天气原因，活动须推迟或取消。社团为了生存和发展会花费大量时间在外联事务上，赞助信息不对称，活动宣传力度不够，学校团委也缺乏支持，活动经费紧张且不透明，活动质量不高。

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接种适量的次代CEF细胞到6孔细胞培养板，于5%胎牛血清和青霉素-链霉素混合液的高糖DMEM中培养18 h；用Lipofectamine 2000分别转染1 mg pcDNA3-2×Flag和1 mg pcDNA3-2×Flag-Meq于CEF细胞中；36 h后弃营养液，PBS缓冲液洗2遍后，裂解于1×SDS-PAGE上样缓冲液，加热变性后进行SDS-PAGE；电泳分离后，进行Western blot，分别用抗Flag、抗p53、抗p21和抗actin的抗体检测蛋白的表达。

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总之，本研究初步证明了p21可能是Meq的下游新靶基因，为进一步了解Meq在MDV感染和复制中的作用机制提供了新思路。

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近几年,教育部考试中心揭示了如何深化高考内容的改革发展方向,主要着眼于社会主义核心价值观、依法治国的理念方面。

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