牦牛是生活在海拔最高处的哺乳动物，主要分布在青藏高原，对西藏的经济、文化、社会发展具有非常重要的意义。牦牛具有耐高寒、耐粗、耐劳、善走陡坡险路、雪山沼泽等优点，但由于牦牛受品种、生活环境等方面影响，造成其利用年限短、繁殖力较低、流产率较高等缺点，从而限制了牦牛的数量[1]。因此如何提高西藏牦牛的繁殖研究备受关注。卵巢是雌性动物的生殖器官，是产生卵子和分泌类固醇激素的器官，其中卵母细胞的发育对雌性动物的繁殖起着关键作用。在卵泡中，颗粒细胞与卵母细胞共同构成体细胞，卵泡中的颗粒细胞增殖、分化，产生不同的颗粒细胞群[2]。紧密围绕在卵母细胞周围的颗粒细胞通过间隙连接卵母细胞，运输小分子代谢物供给卵母细胞成熟所需的营养，从而颗粒细胞可以诱导卵丘扩散，提高卵母细胞的成熟率[3-4]。颗粒细胞对卵泡和卵母细胞的生长发育、成熟分裂具有重要的作用[5-9]。故对牦牛颗粒细胞分离和体外培养成为改善牦牛繁殖力研究的前提。

本试验拟在西藏林芝地区地理气候条件下，对牦牛卵泡颗粒细胞进行体外原代培养和传代培养试验，旨在建立一个良好的原代和传代培养体系，为改善牦牛繁殖力研究提供基础参考。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

DMEM(C11960500BT)、PBS缓冲液(C14190500BT)、双抗(15140-122)、谷氨酰胺、胎牛血清均购于美国Gibco公司。

1.2 采集卵巢

牦牛卵巢来自林芝地区牦牛屠宰场，屠宰后立即取出卵巢，保存到37 ℃左右含有双抗(青霉素钠0.48 g/L和链霉素0.1 g/L)的PBS缓冲液保温瓶中，2 h内带回实验室。

大丰收营销总监周单也表示：“大丰收客户定位在终端市场，终端种植大户的需求就是大丰收发展的方向。同时作为互联网服务平台，掌握流量也是发展的方向之一。目前大丰收通过线上的农技推广服务聚集了百万线上流量、几十万忠实粉丝，在大丰收的八大作物新媒体矩阵中，阅读量均占据农业种植榜单前列。同时，大丰收还在线下组建技术团队，将服务深入到田间地头。致力于为广大种植户提供作物全程解决方案。同时，大丰收孵化了国内首家农业知识学习平台——天天学农，给农民朋友提供专业技术服务。”

1.3 分离颗粒细胞

参考文献:

1.4 原代颗粒细胞培养

用含5%胎牛血清(FBS)的DMEM培养液重悬颗粒细胞，在倒置显微镜下进行细胞计数，接种密度按照每皿0.3×106个接种于35 mm培养皿。在38.5 ℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱中进行培养，前3 d内每12 h更换1次培养液，然后每24 h更换1次培养液。培养过程中利用倒置显微镜观察颗粒细胞生长状态并拍照。

1.5 传代颗粒细胞培养

对统计的所有数据均采用SPSS17.0进行统计分析。计数资料采用n表示。以(P<0.05)为差异有统计学意义。

2 结果分析

2.1 原代颗粒细胞的生长方式及形态特点

施工过程中的质量控制，主要是施工前、施工过程中以及施工后的质量控制。首先，施工前的质量控制，做好施工前的准备，加强钻孔灌注桩的设计方案审核，结合实际施工环境对方案进行完善优化，确保施工技术以及施工流程的顺利进行，满足施工的要求。因为这一施工技术的特点，在施工前先关人员要做好问题的预测以及应急方案，确保在施工中的问题得到及时的解决，避免影响施工的质量。还有就是对于施工材料、人员以及设备的准备，对相关材料进行检查，保障设备状态。

2.2 传代颗粒细胞的生长方式及形态特点

[5] 金艳梅. 颗粒细胞对卵泡发育的影响[J]. 中国畜牧兽医，2010，37(8)：69-72.

3 结论

本研究采用抽卵法获取牦牛颗粒细胞，用添加胎牛血清、双抗、谷氨酰胺的DMEM培养液，在38.5 ℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱中进行了原代培养与传代培养。原代颗粒细胞和传代颗粒细胞增殖发育状况良好，并获得了纯化的颗粒细胞。原代颗粒细胞培养12～48 h时处于潜伏期，此时细胞刚刚贴壁并且黏附不牢固，增殖分化速度较慢；培养72～96 h时，细胞进入指数增殖期，此时细胞多呈放射状，增殖分化速度最快；培养144 h时形成颗粒细胞单层。传代颗粒细胞生长速度较快，48 h后细胞进入指数增殖期，72 h时颗粒细胞就生长至培养皿90%左右，形成颗粒细胞单层。本研究结果表明，原代颗粒细胞在培养过程中潜伏期较长，72 h后才进入指数增殖期，从而导致原代颗粒细胞总体增殖分化速度较慢，144 h后细胞才形成细胞单层。传代细胞在培养过程中，大大缩短了潜伏期的时间，48 h后就进入对数增殖期，从而使传代颗粒细胞总体增殖分化较快，为在西藏林芝地区的地域气候条件下改善牦牛繁殖力提供一定的理论基础。

A.培养48 h；B.培养72 h；C.培养96 h；D.培养144 h

图1 牦牛原代颗粒细胞(400×)

A.培养12 h；B.培养24 h；C.培养48 h；D.培养72 h

图2 牦牛传代颗粒细胞(200×)

采集的牦牛卵巢用75%酒精表面消毒后，立即用37 ℃的灭菌PBS缓冲液反复清洗3次，放于37 ℃水浴锅内，用10 mL或20 mL注射器，配带12号灭菌针头，抽吸2～5 mm卵泡于15 mL离心管中，沉淀15 min，弃上清。加入洗卵液，在体视显微镜下，用10 μL移液枪或口吸管吸取颗粒细胞，置于15 mL离心管中。分离的颗粒细胞用含2%双抗的PBS缓冲液进行离心洗涤2～3次，1 000 r/min 4 min，弃上清。

接种前颗粒细胞呈球形，悬浮在培养液中，而接种后颗粒细胞随着培养时间增加而逐渐黏附至平皿底。培养24 h时,可观察到颗粒细胞呈现聚集生长特性,即较为分散的颗粒细胞通过自身的运动聚集成团块状。培养48 h时,颗粒细胞开始贴壁生长(图1A)，并伴有悬浮在培养液中的凋亡颗粒细胞。培养72 h时,贴壁的颗粒细胞开始伸出伪足，相互接触，大部分细胞形状不规则,呈放射状，只有少部分细胞呈圆形(图1B)。培养96 h时，相邻的颗粒细胞团块底部已经相互接触，此时颗粒细胞处于指数增殖期(图1C)。培养144 h时，颗粒细胞长满平皿底，形成单层的颗粒细胞(图1D)。

[1] Zi X D, Lu H, Yin R H, et al. Development of embryos after in vitro fertilization of bovine oocytes with sperm from either yaks (Bos grunniens) or cattle (Bos taurus)[J]. Anim Reprod Sci, 2008,108:208-215.

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[4] Sugiura K, Pendola F, Eppig J J. Oocyte control of metabolic cooperativity between oocytes and companion granulosa cells: energy metabolism[J]. Dev Biol, 2005,279(1):20-30.

待原代颗粒细胞生长至培养皿80%左右时，进行传代培养。弃去培养液，用预热37 ℃的PBS缓冲液洗涤2次，加入适量的细胞消化液，放于37 ℃培养箱中消化2～5 min。消化过程中，在显微镜下随时观察细胞状态，见到细胞质回缩，胞体趋于圆形时，立即终止消化。加入含有FBS的DMEM培养液，吹打使原代细胞全部脱离培养皿，制成细胞悬液。在倒置显微镜下进行细胞计数，接种密度按照每皿0.3×106个接种于35 mm培养皿，培养方法同1.4。

[3] Gilchrist R B, Ritter L J, Armstrong D T. Oocyte-somatic cell interactions during follicle development in mammals[J]. Anim Reprod Sci, 2004,82:431-446.

气调包装技术可以有效延长食品的货架期和新鲜度，该技术于上世纪30年代首先在肉的保鲜上应用，并迅速在国外市场上得到了推广[1]。我国气调保鲜技术的应用起始于上世纪80年代，且应用范围较小[2]。近年来，随着消费者对肉类消费水平及品质要求的提高，气调包装保鲜肉的普及将成为一大趋势[3]。

为了能够吸引学生的注意力，保障学生能够主动地参与英语实践学习，高职英语老师开始立足于我国素质教育的实质要求，积极利用慕课来实现教学内容以及教学形式的优化和革新，突破哑巴式英语教学所存在的各类不足，调动学生的学习积极性，保障学生能够将个人的自主研究与小组内部的合作学习相结合，实现个人主观能动性的有效发挥。

传代颗粒细胞生长速度较快，培养12 h时，颗粒细胞呈现聚集生长(图2A)。24 h时，呈现贴壁生长，并伴随凋亡的颗粒细胞(图2B)。48 h时，颗粒细胞进入指数增殖期，此时细胞增殖分化较快，多呈放射状(图2C)。60～72 h时，颗粒细胞生长至培养皿90%左右，形成颗粒细胞单层(图2D)。

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提篮式钢管混凝土劲性骨架上承式拱桥施工关键技术……………………………………………………… 高峰（11-186）