斑点叉尾鮰病毒病是由斑点叉尾鮰病毒(channel catfish virus，CCV)引起的一种急性致死性传染病，我国将其列为《中华人民共和国进境动物一、二类传染病、寄生虫病名录》的二类传染病。CCV是一种有囊膜的双链DNA病毒，又称鮰疱疹病毒Ⅰ型(Ictalurid herpesvirus Ⅰ)，属于疱疹病毒科、鮰病毒属[1-3]。斑点叉尾鮰和相近的其他鮰对其易感，天然水体下病毒只感染鮰幼鱼和鱼苗，刚孵化鱼苗死亡率达100%。发病时患病鱼呈水肿、眼突出、鳍条和肌肉出血，最显著的组织病理变化是肾管和肾间组织的广泛坏死[4]。尽管我国目前尚无发生斑点叉尾鮰病毒病的正式报道，但近年来国内已有疑似病例的流行和发生，给斑点叉尾鮰的养殖造成了巨大的经济损失。该病传播速度快、死亡率高，因此加强对该病的检测监控，防止该病在我国的发生、传播和大规模流行已迫在眉睫。

目前，参照世界动物卫生组织(OIE)《水生动物疫病诊断手册》[5]及我国的出入境检验检疫行业标准[6]，斑点叉尾鮰病毒病的确诊是基于细胞培养的病毒分离，然后用中和试验、免疫荧光、ELISA或PCR等方法鉴定[5-11]，该方法虽然准确可靠，但具有操作繁琐、细胞难于培养、检测周期长等缺点。此外，传统的细胞培养或者抗原检测方法无法检测到潜伏感染阶段的病毒，因为无临床症状的带毒鱼此时没有病毒蛋白和感染性病毒颗粒产生[9]。因此，通过PCR等分子生物学技术检测样品的CCV基因DNA的方法来评价鱼的带毒状态就显得更有优势了。PCR等方法虽然特异性和敏感性较好，但仍会有假阳性出现的可能，需要通过测序进行确诊，耗时较长；其他方法不能达到在分子水平上进行快速确诊的目的，无法满足快速确诊病原的需求。

焦磷酸测序技术是一种能够对病原体一段保守的短序列进行测序分析的方法，近年来发展起来的焦磷酸测序技术适于对已知短序列的测序分析，无需荧光标记引物或核酸探针，无需电泳，具有分析快速、准确、灵敏度高、经济、自动化和实时检测的特点[12]。该方法在普通PCR的基础上，对PCR产物进行测序，提高了检测的特异性，且给出了分子诊断的黄金标准——基因序列，减少了由于PCR敏感性高而出现的假阳性结果，提高了检测的准确性，已广泛应用于病原微生物快速鉴定[9-12]。本研究针对CCV蛋白激酶(protein kinase，PK)(ORF73)基因的保守区域，利用焦磷酸测序软件设计PCR扩增引物及焦磷酸测序引物，通过对反应条件与体系的优化，建立CCV PK基因的焦磷酸测序检测方法，为水生动物病毒病害的监测和防控提供新的检测手段。

1 材料与方法

1.1 病毒株

CCV、金鱼造血器官坏死病毒(GFHNV)、锦鲤疱疹病毒(KHV)、流行性造血器官坏死病毒(EHNV)、甲鱼虹彩病毒(STIV)等由本实验室保存。

1.2 主要试剂

500 bp DNA Marker等试剂购自TaKaRa公司； DNeasy Blood & Tissue Kit DNA提取试剂盒、PyroMark PCR Kit、PyroMark Gold Q96 SQA Reagents及相应试剂均购自QIAGEN公司；链霉亲和素包被磁珠购自GE公司。焦磷酸测序仪PyroMark Q96 MD为QIAGEN公司产品。

1.3 引物设计

根据GenBank中公布的CCV PK基因(ORF73：登录号为AAA88175)的保守序列，利用PSQ Assay Design SW软件设计PCR扩增引物CCV-F：5′-GGCTTGGGCTTGATGGAC-3′； CCV-R：5′-Biotin-GAGGAGGACAACGCGACTG-3；测序引物CCV-S：5′-CTTGGGCTTGATGGA-3′，并在CCV-R扩增引物5′端进行生物素标记，预期扩增片段长度为144 bp，引物合成和测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.4 病毒DNA的提取

按照DNeasy Blood & Tissue Kit说明书提取组织或病毒液的核酸，提取的DNA立即用于PCR扩增或放置-20℃冰箱保存备用。

1.5 PCR反应

[2] Davison A J, Eberle R, Ehlers B, et al.The order Herpesvirales[J]. Arch Virol, 2009, 154(1):171-177.

1.6 测序单链模板的制备

根据Gene Company Limited公司的焦磷酸测序反应操作说明制备单链模板。将20 μL标记有生物素的PCR产物与30 μL ddH2O混合后再与链霉亲和素包被的磁珠混合，室温下震荡孵育15 min，用真空吸附泵将与磁珠结合后的PCR产物吸起，然后依次通过70%乙醇5 s；变性缓冲液5 s；冲洗缓冲液5 s，最后移至预先每孔加入45 μL含有0.3 mol/L测序引物的结合缓冲液的PSQ96板上方，释放磁珠，将PSQ96板放入80 ℃烘箱中加热2 min后，取出冷却至室温。

1.7 焦磷酸测序反应

采用优化的反应条件以CCV DNA为模板，用CCV扩增引物进行PCR检测。结果显示，扩增出与目的条带大小相符的特异性片段，没有非特异性扩增产物，满足进行焦磷酸测序反应的需要(图1)。测序结果表明，该目的条带与CCV PK基因片段同源性为100%。

建筑企业应当重视对新技术的学习和运用，通过提升原有的操作技能，达到减小施工现场对大气的污染程度。例如改善钢筋的连接方式，对墙体的钻孔实施有效的防治措施，采用密封运输建筑垃圾等等，都是可以通过改善施工工艺技能而降低扬尘污染的方式。

1.8 敏感性试验

[7] Crawford S A, Gardner I A, Hedrick R P. An enzyme linked immunosorbent assay(ELISA) for detection of antibodies to channel catfish virus(CCV) in channel catfish[J]. J Aquat Anim Health, 1999, 11:148-153.

1.9 特异性试验

分别以提取的CCV、GFHNV、KHV、EHNV和STIV的DNA样品为模板，进行PCR扩增。将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，剩余的PCR产物用于进行焦磷酸测序分析。

1.10 重复性试验

将扩增的PCR产物进行3次焦磷酸测序，比较每次测得的序列结果，确定试验的重复性和稳定性。

2 结果

2.1 PCR反应

根据仪器的软件说明在试剂舱中分别加入底物APS、dNTP和酶混合物(DNA聚合酶、荧光素酶、ATP硫酸化酶和三磷酸腺苷双磷酸酶)；然后将试剂舱和PSQ 96板放入PyroMark Q96 MD仪器中进行Pyrosequencing。测序引物沿着待测模板，随着不同dNTP的加入而扩增。每当有单个dNTP结合，反应会释放信号，测序仪收集信号，生成测序峰。

本研究所建立的CCV焦磷酸测序检测方法从基因序列水平上对CCV进行精准检测鉴定，具有准确性高、重复性和稳定性好、特异性强等优点，为CCV的快速检测和确诊提供了一种可行方法，对加强斑点叉尾鮰苗种和成鱼类检疫以及养殖水体环境的监测，保障斑点叉尾鮰养殖业的健康持续发展具有重要意义。

M. DL500 DNA Marker；1. CCV PK基因片段；2. 阴性对照

图1 CCV PK基因PCR扩增结果

2.2 焦磷酸测序

CCV PK基因的焦磷酸测序结果为CGGTCGTGT CGGTGTCGGT GGCTGTGTCG GCTTCCGTTT CACCG。将该序列进行BLAST分析，与目的序列片段符合率为100%。该序列能够作为CCV快速鉴定的靶序列，其焦磷酸测序结果与普通测序结果完全一致，符合率为100%，证明该试验方法具有很好的特异性(图2)。

图2 CCV PK基因焦磷酸测序结果

2.3 敏感性试验

电泳结果显示提取的CCV DNA模板10倍系列稀释至10-7时均扩增出与目的条带大小相符的特异性片段；经过焦磷酸测序，CCV DNA模板稀释至10-6，测定的序列均与CCV PK基因的目标序列一致，为CGGTCGTGT CGGTGTCGGT GGCTGTGTCG GCTTCCGTTT CACCG；CCV DNA模板稀释至10-7时，未测出特异目标序列。结果表明，该试验方法最低核酸检测限为5×10-6 ng/μL(稀释度为10-6时)，此时所扩增的PCR产物可以用于焦磷酸测序，得到较好的序列结果。

M:DL500 DNA Marker；1-8. CCV 浓度分别为5、5×10-1、 5×10-2、 5×10-3、5×10-4、5×10-5、5×10-6和5×10-7 ng/μL；9. 阴性对照

图3 CCV敏感性试验结果

2.4 特异性试验

以CCV、GFHNV、KHV、EHNV和STIV的DNA为模板进行焦磷酸测序反应，结果显示仅CCV得到预期大小扩增片段及相应峰型。将该序列进行BLAST分析，结果与目的片段序列符合率为100%；其他病毒核酸样品未得到特异条带及相应序列结果，表明该方法具有良好的准确性和特异性。

(1) 本裂缝病害实质为平推式滑坡，主滑方向与临空面走向小角度相交，滑动矢量方向具有运动合成特征，使得其成因机制显得更为复杂。病害的力学机制为滑移——拉裂，运动机制为滑移——翻转。

2.5 重复性试验

对PCR产物进行3次重复性检测，检测结果均一致，证明该方法具有良好的重复性与稳定性。

6.供水不足或水质差。有的饮水系统长期未清洗或久置未用出现青苔铁锈等异物或饮水被污，从而导致绝对缺水或相对缺水，引起胃肠疾病，造成母猪不食或少食。

3 讨论

斑点叉尾鮰原产美国，目前已成为我国重要的水产养殖经济鱼类之一。随着养殖规模的扩大以及养殖密度的不断增加,大规模暴发疫病的风险也相应增加。斑点叉尾鮰病毒病暴发后导致产量减少给养殖户造成了重大的经济损失。该病主要在北美流行，我国尚无发生该病的明确报道。斑点叉尾鮰病毒病流行后，残存鱼往往是隐性带毒者，一般无临床症状[1]。随着国际交流的进一步深入，该病有传入的风险，因此急需建立必要的检测技术。

焦磷酸测序技术是近年发展起来的一种能够通过对基因序列测定实现检测和确诊的新型检测技术，可以快速、准确地进行短DNA序列分析，通量高、操作方便，便于构建标准化操作流程，与普通的PCR等检测技术相比，该技术无须将PCR产物送交公司测序，从而大大减少了病原确诊时间。从核酸抽提到测序反应完成只需要4 h，每次反应最多能同时检测96份样品，可以在短时间内对大量样品进行检测。目前该技术已经逐渐成为实验室非常重要的DNA分析新手段，已广泛应用于单核苷酸多态性分析、细菌、真菌和病毒的分型、突变位点的检测等[12-14]。Julia等[15]针对SzPSe基因设计引物利用焦磷酸测序方法从而区分马链球菌马亚种野生株和疫苗株。国外研究人员针对流感病毒H3N2、新城疫病毒等病毒也建立了针对不同毒株变异位点的焦磷酸测序方法并通过大量的临床样品检测验证了方法的有效性，有助于进行病毒学监测和流行病学调查[16-17]。由于病毒的变异性，核苷酸发生位点突变，需持续关注病毒基因核酸序列的变化从而及时更新引物序列。

取p=3 000,用模型(9)—(10)求解该问题,所得图像如图5所示。观察图4和图5知,本文提出的模型可用于图像恢复。

焦磷酸测序技术对序列的选择要求比较严格，片段不能太长，一般在100～200 bp，同时需要待测核酸前面或后面的序列高度保守，以便于设计扩增引物和测序引物。CCV蛋白激酶(ORF73)基因序列与其他疱疹病毒基因序列相似性较低，高度保守，因此选择该基因保守区域作为焦磷酸测序的靶序列。本研究通过对编码CCV PK基因的核酸序列进行分析后，找出符合焦磷酸引物设计要求的区域，设计扩增引物和测序引物，利用PCR扩增获得产物后进行焦磷酸测序反应，获得一段特异性序列作为CCV鉴定的靶序列。PCR扩增产物电泳后无条带、条带很淡或有非特异性条带等均无法得到正确的测序结果。只有保证PCR扩增产物的质量才能获得正确的焦磷酸测序结果，因此PCR反应的有效性是至关重要的，优化PCR反应是做好焦磷酸测序的前提。通常情况下，焦磷酸测序反应准确测出的碱基数为20～30 bp。本研究经优化测序反应后，将CCV DNA模板稀释至10-6(即5×10-6 ng/μL)，仍能准确测出CCV PK基因的目标序列，准确测出的碱基序列达到45 bp，满足证明待测样品是否为CCV PK基因序列的确诊要求，具有很好的特异性及敏感性。相比普通测序方法，检测效率大大提升，检测结果更加准确，完全能满足口岸进出口检验检疫的要求，适用于对CCV的大规模检疫和流行病学调查。

蒙太奇（montage），原是法语建筑术语，意即装配、构成，后来借用到电影领域，就是按照一定的目的和程序剪辑，组接镜头的意思。蒙太奇是电影所特有的叙述方法，它是“借助于电影艺术而发展到极完善形式的分割和组合方法”。将蒙太奇运用于诗歌创作有利于更好地组合意象，以强化诗的强度和密度，使之产生审美多层次和多空间，造成意象的撞击和迅速转换，激发人们的想象力来填补大幅度跳跃留下的空白。

参考文献：

[1] Davison A. Channel catfish virus:a new type of herpesvirus[J]. Virology, 1992, 186:9-14.

取1 μL CCV核酸，按照PyroMark PCR Kit说明配置反应体系，分别加入上下游引物各2 μL，无菌水补足体积至50 μL。进行PCR扩增并对反应条件进行优化，确定PCR反应条件为：95 ℃预变性15 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共循环45次；72 ℃ 10 min。取5 μL PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，将PCR产物送往公司进行测序。剩余的PCR产物用于焦磷酸测序反应。

执教老师提问层层深入，逻辑性强，有效地引导学生理解文本主旨和结构。在此基础上，教师对该文的标题进行提问。展示型问题为参阅型问题作铺垫，学生在参阅型和评估型问题上能够分析问题和表达观点。教师先是对文本中人物收礼的基本信息进行提问，再进行一般送礼物的讨论，最后延伸到跨文化交际视角下的礼物赠送问题。例如：

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泰国同中国不接壤，其陆地邻国均位于东南亚，其中也没有综合实力超越泰国的强国。13世纪前期，邦克朗刀联合帕孟领导泰人摆脱吴哥王朝的统治，建立起泰国历史上第一个有文字记载的国家——素可泰。之后，泰国历代王朝又同高棉和缅甸形成了长期的地缘竞争乃至战争关系。在当代，泰国仍同柬埔寨和缅甸两国存在领土争端。不过鉴于如今柬缅两国的实力偏弱，泰国所处的地缘环境总体上比较理想，无论是来自中国还是邻国的地缘压力均不强。

[5] Office international des épizooties.Manual of Diagnostic Tests for Aquatic Animals[EB/OL].[2017]http://www.oie.int/en/international-standard-setting/aquatic-manual/access-online/.

[6] 张旻，王娜，张利峰，等. SN/T4289-2015 斑点叉尾鮰病毒病检疫技术规范[S]. 北京：中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.

将CCV DNA(5 ng/μL)依次进行10倍梯度稀释，并以此为模板进行PCR扩增，确定用于焦磷酸测序的PCR的最低检测限。

4.2.5 冷藏、冷冻和热链设备温度要求。应配备与经营食品储存条件相适应的冷藏和冷冻柜以及加热保温设施。冷藏温度应为0℃～8℃；冷冻温度应为－20℃～－1℃, 宜低于－12℃；加热保温柜应≥60℃。

[8] Baek Y S, Boyle J A. Detection of channel catfish virus in adult channel catfish by use of nested polymerase chain reaction[J]. J Aquat Anim Health, 1996, 8:97-103.

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人的个体有不同的耐受性，因此影响将有所不同，这使得健康影响的量化更难测量。然而，人们承认，儿童、老年人和那些身体不好的人在空气质量方面的风险最大。富兰克林等人的2014项目调查发现，婴儿在生命的第一年患呼吸系统疾病的风险很大。该报告的作者将观察到的健康风险与孕妇从新的强化地板中吸入挥发性有机化合物的浓度联系起来。

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本文提出了一种基于PDMS柔性支撑材料的磁敏感加速度传感装置,通过应用MATLAB软件对磁场仿真分析以及应用有限元仿真的方式对PDMS薄膜应力分析,验证了加速度检测的可行性,实现加速度传感装置的搭建。并通过静态测试的方式验证对加速度检测的可行性,其灵敏度为4.68 Gauss/gn。最后对磁敏感加速度传感装置的分辨率及固有频率进行分析,得到传感装置的分辨率为8.57 μgn,固有频率为10 Hz。可以实现对低频加速度信号的高灵敏检测。

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左后分支区域起源室早的体表12导联心电图特征如下:① QRS波呈现右束支阻滞+左前分支阻滞图形；② V1导联QRS为右束支阻滞样图形，时限0.11～0.14 s。进一步，可以根据aVR导联q波与R波振幅作具体定位:如果aVR导联q波振幅小于大R波，则提示起源点近基底部，反之则不然。