落叶松-杨栅锈菌(Melampsora larici-populina)又称青杨叶锈菌，主要侵染青杨派、黑杨派及其杂交种叶片，其完整生活史需在杨属(Populus spp.)和落叶松属(Larix spp.)两种寄主上完成，生活史各阶段分别产生性孢子、锈孢子、夏孢子、冬孢子和担孢子[1]。其中无性阶段产生的夏孢子在生长季反复侵染杨树叶片，严重影响杨树生长。落叶松-杨栅锈菌存在生理分化现象，在北美、欧洲国家已发现的生理小种包括E1、E2、E3、E4和E5[2]。E1、E2、E3未对杨树造成严重危害，但在比利时发现的E4小种导致许多品种丧失抗病性[3]。已知欧洲黑杨(Populus nigra)杂交后代具有对E1、E2、E3生理小种的抗性[4]，但目前尚未培育出可有效抵抗E4和E5生理小种的杨树品种[5]。

过氧化氢(H2O2)不仅是一种氧化代谢产物，也是一种信号分子，可调控一系列生理代谢和细胞过程。当植物受到胁迫时，会发生H2O2在内的活性氧(ROS)的迸发。H2O2含量升高后，除了可利用其毒害作用直接杀伤病原物，还可引起感染处细胞的过敏性反应(HR)[6]，从而引发寄主细胞的程序性死亡(PCD)[7]。PCD可起到延缓或抑制病原菌的生长和扩散的作用。H2O2在抗病反应中还可作为信号分子，引发抗病防御基因的表达[8]，最终使植物产生系统获得性抗性(SAR)[9]，阻止病原进一步侵染。因此，H2O2在植物抗病原菌侵染过程中起到关键作用。

过氧化氢酶(CAT)能够催化H2O2分解成H2O和O2，降低H2O2含量。当抗性寄主植物受到病原侵染时，需要启动防御系统抵抗入侵，表现为CAT活性降低，或相应基因表达量下降。CAT基因表达量的下降会引起H2O2的积累，诱发HR或PCD抗性反应，提高植物对病原的抗性。例如拟南芥(Arabidopsis thaliana)被病原侵染后，G-box结合因子(GBF1)可抑制CAT活性以促进H2O2积累，引起ROS爆发，产生SAR[10]。目前对CAT的研究大多是对H2O2的清除作用以防止H2O2毒害细胞，在其如何影响杨树抗性方面的研究还不够完善。

由于初次手术造成的解剖结构混乱、瘢痕黏连、甲状旁腺移位、肿瘤浸润等原因，复发甲状腺癌再次手术造成甲状旁腺损伤的发生率明显增高，甲状腺旁腺的永久性损伤率为5%[15-16]。我们的经验是再次手术时手术入路尽量选择首次手术未解剖的部位，解剖结构相对清晰，黏连不多。经甲状腺外侧入路或胸锁乳突肌内侧入路，向外推开颈鞘，此处容易暴露甲状腺外侧被膜、甲状旁腺及血管，仔细辨认甲状旁腺后再行甲状腺全切及中央区淋巴结清扫，从而避免损伤甲状旁腺及其血供。本组病例中复发性甲状腺癌再次手术者21例，出现永久性甲状腺功能减退者1例，发生率约5%，与报道相似。

本课题组前期研究发现欧美杂交杨(Populus nigra×P. deltoides)与E4锈菌为亲和型互作关系，E4锈菌侵染后欧美杂交杨叶片未见坏死症状，也不发生HR和PCD抗性反应[11]，其分子机理尚不明确。鉴于HR和PCD抗性反应与植物抗病性密切相关，因此对HR关键信号因子H2O2及其调控酶CAT进行研究，以揭示感病品种杨树抗病性降低的分子机理。H2O2与CAT之间的影响关系相对复杂，在植物抗病过程中起到非常重要的作用，对感病树种与之相关的病生理过程研究可为探究欧美杂交杨抗病性丧失机制奠定基础，继而为抗病育种提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料及锈菌接种

将欧美杂交杨在液氮处理下进行研磨，取研磨粉末，利用CATB法提取总RNA。DNaseⅠ(RNase-free)降解DNA后，用V(酚)∶V(氯仿)∶V(异戊醇)=25∶24∶1抽取纯化。应用Promega AMV反转录第1链cDNA。根据转录组测序结果，设计欧美杂交杨Pnd-cat基因编码序列(CS)引物(Pnd-cat-csF：5’-ATT CTG GTG CTT CGG TCT GG-3’，Pnd-cat-csR：5’-AGG AAC CAC AAT AGC AGG GC-3’)，以第1链cDNA为模板，进行PCR扩增。PCR产物送到上海生物工程公司进行DNA测序[13]。

1.2 Pnd-cat基因编码区克隆

使用保存在东北林业大学线虫菌物实验室的落叶松-杨栅锈菌E4强致病株系，将孢子置于0.004% Tween 20去离子水中制成悬浮液。杨树叶片采用欧美杂交杨(1年生枝条，取分离叶间隔期指数为5～9的完全展开叶片。用喷射器在叶片上喷施孢子悬浮液[12]，用含0.004% Tween 20去离子水处理作为对照。接种完成后，将叶片放置于恒温培养箱中，16 ℃培养,每天进行16 h正常光照，持续培养168 h。接种组与CK组分别进行3个生物重复。收集接种后2、6、12、24、48、96、168 h接种组与CK组叶片，对接种叶片进行拍照记录。将接种叶片分成3组，分别进行RNA提取、DAB染色及H2O2质量摩尔浓度的测定。

1.3 生物信息学分析

应用ORF Finder进行在线ORF分析并推导出Pnd-cat基因的氨基酸序列。将Pnd-cat与NCBI数据库中的序列进行双向BLAST比对。用Mega7.0.14根据BIC值确定核酸进化最适模型，构建Pnd-cat直系同源基因最大似然树(MLT)。利用自展检验估计所构建的Pnd-cat直系同源基因系统树的可靠性，重复次数设定为1 000[14]。

1.4 荧光定量PCR

分别以锈菌侵染的7个时间点的杨树叶片第1链cDNA为模板，以Pnd-cat-rtF：5’-ACG CCT GTA ATT GTC CGC TT-3’，Pnd-cat-rtR：5’-CAC GGA CGA AGA AGA CAG GG-3’为引物，应用Gotaq 2-Step RT-qPCR System(Promega A6010)试剂进行反转录。以杨树18S rRNA基因作为内参基因。应用Stratagene Mx3000P qPCR system(Agilent，USA)，使用2步法进行Q-PCR扩增。首先进行95 ℃预变性2 min；其次进行95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40个循环并测定溶解曲线。采用相对定量法计算3次重复试验初始模板量比值，两配对样本t检验各时间点差异显著性[11]。

为了能够更加清晰地比较不同时间点H2O2质量摩尔浓度的变化，将对应时间点的其中一组叶片进行染色。将叶片浸没于1 g·L-1DAB染液中，调节pH为3.8，之后进行4次100 kPa的抽滤，每次2 min。抽滤完成后将叶片浸没在DAB染液中，放于摇床上均匀受色，4 h后停止。染色结束后对叶片进行脱色。将叶片浸没于脱色剂(V(乙酸)∶V(甘油)∶V(无水乙醇)=1∶1∶3)中，95 ℃水浴加热20 min，冷却至室温，5 min，放在50%的甘油溶液中保存[15]，并用相机拍照记录。

1.5 侵染后叶片DAB染色

宪法适应性发展的理想状态是完善宪法适应机制，使宪法与时俱进，更加适应社会发展需要。但在社会快速变革、其他应变机制发展滞后的背景下，宪法发展偏离正常轨道的“非常态发展”状态便呈现出来，这就是“良性违宪”。良性违宪是指有些事件表面看似违宪，而实际上却符合历史发展趋势。违宪事件大多在地方自发萌芽，改革之初顶着“违宪”帽子，改革成果则让人们尝到了甜头，因而使人们鼓起了冒天下之大不韪的勇气，从凤阳县小岗村土地“大包干”，到深圳特区土地使用权拍卖，再到私有经济飞速发展，都在一定程度上违反了当时宪法的规定，却极大地促进了社会生产力发展[3]。改革势不可挡，改革与宪法谁让步成为一个尖锐问题。

1.6 侵染后叶片H2O2质量摩尔浓度测定

DAB染色表明,H2O2呈点状分布(图1B棕色斑点)，在锈菌侵染点和夏孢子堆附近颜色深,表明锈菌侵染促进H2O2产生。观察各时间点的H2O2产生情况。从染色图片来看，接种后6 h即出现较少的棕色斑点，说明已经产生H2O2。随接种后时间的延长，棕色斑点增多，颜色加深。接种后168 h，棕色斑点明显增多且颜色较深，H2O2在此时间点大量产生。

健全信息确保管理有序。健全完善全国党员信息管理系统，采集登记党员流入地点、就业岗位或创业情况、联系方式等信息，做到“数量清、结构清、人头清”。建立流动党员信息定期更新制度，基层党支部每季度对流动党员信息采集核对1次，动态掌握流动党员数量和流向情况。拓宽渠道增强归宿感，聚焦打造流动党员“暖心娘家”，加强12371专线服务管理，及时为流动党员答疑解惑，提供组织关系接转、就业创业等政策咨询服务，并帮助解决实际困难。畅叙乡情点燃贡献激情，利用春节返乡时机，分层召开流动党员座谈会，在掌握流动党员思想状况的同时，充分搜集县外人脉、商机等信息，助力乡村发展振兴，为家乡发展建言献策。

2 结果与分析

2.1 锈菌接种后症状观察及染色

以18 S rRNA基因为内参，采用相对定量法计算Q-PCR的3次重复试验差异显著性。欧美杂交杨Pnd-cat基因在锈菌接种后2 h表达量开始上调，24 h下调到最低值，随后表达量上调，96 h时达到最高，168 h表达量再次下降。

利用分光光度法对各时间点的接种叶片及其对应CK组叶片的H2O2质量摩尔浓度进行测定。具体步骤：取样品称质量，用液氮研磨至粉状，加入5 mL丙酮溶液溶解粉末。取1 mL混合液加入到离心管中离心15 min，1 000 g，4 ℃。取上清液，加入0.2 mL钛试剂(20% m/v)和0.4 mL铵试剂，得到混合物，将混合物离心10 min，1 000 g。弃上清，向沉淀中加入5 mL的2 mol·L-1H2SO4，溶解沉淀。415 nm下，对混合物的吸光度进行测定[16]。采用相对定量法计算3次重复试验两独立样本t检验差异显著性。

A.E4锈菌侵染叶片；B.E4锈菌侵染叶片H2O2积累。

图1 E4锈菌侵染欧美杂交杨叶片发病情况和H2O2积累

2.2 Pnd-cat基因完整蛋白编码区克隆及生物信息学

1)初步设计了超前支架的结构，该支架不但具有垂直升降和水平伸缩功能，而且支架在展开时与顶板接触良好，同时分析了支架的受力情况。

A.11种植物CAT序列比对；B.11种植物CAT最大似然树。

图2 Pnd-cat系统进化结果

2.3 荧光定量PCR

锈菌接种后12 h前叶片表面无明显变化(图1A)，12 h后出现细小的黄色斑点，96 h后出现明显的黄色斑点。168 h后，叶片表面有桔黄色夏孢子堆，无过敏性坏死症状，表明欧美杂交杨与锈菌为亲和型互作关系。

** 为P<0.01，接种组相对CK组差异极显著。

图3 欧美杂交杨受落叶松-杨栅锈菌E4株系侵染后Pnd-cat的表达

2.4 侵染后叶片H2O2质量摩尔浓度比

由于接种后96～168 h叶片已经出现橘黄色夏孢子堆(图1A)会干扰DAB染色后H2O2棕色斑点(图1B)的定量计数,因此进一步利用分光光度计法测定H2O2质量摩尔浓度(图4，两独立样本t检验。在锈菌侵染后2～24 h，H2O2质量摩尔浓度逐渐升高，略微上下波动；24 h后，H2O2质量摩尔浓度比下降，96 h质量摩尔浓度比达到最低，168 h再次升高。H2O2质量摩尔浓度比曲线趋势与Pnd-cat表达量曲线趋势相反。

以落叶松-杨栅锈菌E4强致病株系侵染的7个时间点欧美杂交杨叶片第1链cDNA为模板，克隆并命名为Pnd-cat基因。应用ORF Finder进行在线ORF分析并推导出氨基酸序列。Pnd-cat编码353个氨基酸。Pnd-cat等电点为6.46，相对分子质量为41 211.73 Da。根据blastx结果下载Pnd-cat同源序列，应用Clustal W进行多序列比对(图2A)，用Mega7.0.14以JTT+G模型构建最大似然树(图2B)。系统进化分析表明，Pnd-cat与P. trichocarpa的CAT同源序列亲缘关系最近，1 000次重复检验支持率为98%。

*为P<0.05，接种组相对CK组差异显著；** 为P<0.01，接种组相对CK组差异极显著。

图4 E4株系侵染欧美杂交杨后H2O2的变化

3 结论与讨论

本研究结果表明，锈菌侵染后Pnd-cat表达量上调，导致H2O2含量随之降低，尤其在96 h达到最低，HR和PCD抗性反应难以被激活，未产生SAR。接种锈菌96 h时，锈菌吸器大量产生，菌丝形成网络[17]，此时欧美杂交杨的防御反应未产生或产生的程度较小，锈菌得以大量繁殖，最终引起欧美杂交杨对锈菌的抗性降低。Pnd-cat基因表达量曲线与H2O2质量摩尔浓度比曲线趋势相反，表明Pnd-cat基因的表达可能引起杨树抗病过程中H2O2含量降低。这一结果与Saeidreza Azarabadi et al.[18]的研究结果相符。他们在对梨(Pyrus communis)的研究中发现，由于抗病品种CAT基因的表达水平低于感病品种，使抗病品种H2O2含量高于感病品种，从而更能抑制病原侵染。

(1)机遇与挑战。在创新、协调、绿色、开放、共享五大理念，资源节约与环境保护，坚守生态红线，保护优先，绿色发展贯穿于矿产资源勘查开发利用全过程监管模式下，对矿产资源开发利用企业的生存与发展提出了严格的要求和挑战。如何变困难为动力、化挑战为机遇，倒逼矿山开采企业力行节能降耗、转型升级、技术革新、创新发展、走绿色开发之路，是矿山企业面临的新课题和必须攻克的重要关口，也是河北省矿产资源开发利用面临的机遇与挑战[9]。

H2O2在抗病过程中起到非常关键的作用。H2O2相对其他ROS寿命较长，含量低时可作为一种信号分子，刺激抗病防御基因的转录激活，启动杨树抗病反应，使杨树表现出SAR，以抵抗生物和非生物胁迫。高含量的H2O2可引起PCD[19]，使活体营养寄生物因寄主细胞死亡而难以继续繁殖和生存。CAT与H2O2有较高亲和力，能将H2O2分解，维持细胞内ROS平衡，使ROS保持在一定浓度范围内，防止损伤植物组织[20]。接种锈菌后96 h时，是锈菌侵染杨树的关键时间点。此时，锈菌的吸器数量显著增加，菌落组织相互交织在一起，生物量大量积累。此时，Pnd-cat基因的表达量升高可能由两种原因导致：一个原因是欧美杂交杨本身Pnd-cat基因表达时间不当；另一个原因是锈菌的大量产生，分泌效应因子促进Pnd-cat基因的表达。Pnd-cat基因的上调表达可能是H2O2含量降低的关键原因，CAT对H2O2的清除，使欧美杂交杨缺少足够的H2O2以激活HR和PCD，从而未产生SAR，错过了抵抗锈菌的最佳时机。这可能是造成欧美杂交杨不能抵抗锈菌的原因之一，也可能是欧美杂交杨与抗病树种在抗病反应机制上的区别之一。如果能利用转基因技术，使相应时间点Pnd-cat基因的表达降低，确保H2O2的积累，从而引发HR和PCD，调动植物体的防御系统，最终可能增强欧美杂交杨对锈菌的抗病性。但是值得注意的是，大量的H2O2的迸发，在抵抗锈菌侵染的同时也可能会对植物体自身造成伤害，还应考虑过量H2O2的清除问题。培育出抗性树种是减少由于落叶松-杨栅锈菌侵染造成损失的主要途径。研究感病机制可为抗病育种提供理论基础，以感病树种的感病机制为基础和依据，找到感病树种与抗病树种在应对病原物侵染过程中的区别与联系，才能针对性地培育出抗病品种。

参 考 文 献

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