无患子(Sapindus mukorossi)是无患子科(Sapindaceae)无患子属(Sapindus)的1种落叶乔木，俗称肥皂树、洗手果等，主产于我国及东南亚各国，在长江流域、南部各省及海南岛均有分布和栽培，北可及河南北部。无患子的果皮、种子、根、皮、叶是重要的天然表面活性剂、生物柴油、中药等的原料，具有重要的多功能开发价值。目前对无患子的研究主要集中在种质资源评价、栽培技术、化学成分的分析及有效成分皂苷的提取与分离[1-8]。同时研究表明，无患子皂苷还具有抗病毒、降血压、抗真菌、杀虫等多种药理作用[9-15]。

1.4 统计学分析 应用统计学软件SPSS 19.0对本研究数据进行分析处理。计量资料用（±s）描述，采用t检验；计数资料用率（%）描述，采用χ2检验。等级资料比较采用秩和检验及Fisher精确检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

但是，现阶段针对无患子皂苷抑制细菌和真菌活性的研究还较少，且大多都集中在人体的病原菌方面[8-10]。而对于林业和农业生产来说，绿色、安全、低毒的病害防治药剂为业界求之若鹜。无患子果皮化学组分的抑菌性，为动植物细菌、真菌病害防治开辟了一条植物源抑菌新道路。无患子果皮提取物作为一种植物源杀菌剂在农业生产上起到了一定的作用[16]，而在林业生产上的作用，已有一定开发，但尚未成熟。本研究选用猕猴桃腐烂病菌(Neofusicoccum parvum)、桉树溃疡病菌(Lasiodiplodia theobromae)和欧美杨树溃疡病细菌(Lonsdalea quercina subsp. populi)进行抑菌试验，研究无患子皂苷的抑菌作用，以期为植物源抑菌剂的开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

无患子果皮水提浓缩液获得的皂苷液，由福建省源华林业生物科技有限公司提供。

六是成功组织了北京市第八届商业服务业技能大赛（中式烹调师）比赛。来自全聚德、便宜坊、东来顺、华天等近60家餐饮企业的551名选手参加了比拼，通过初赛、复赛、决赛层层选拔，最终产生金牌奖9名、银牌奖14名、铜牌奖23名、优秀组织奖11家企业。

桉树溃疡病病菌、猕猴桃腐烂病菌、欧美杨树溃疡病菌的菌种由北京林业大学森林保护实验室提供。PDA培养基(马铃薯、葡萄糖、琼脂、水)；LB培养基(胰蛋白胨、酵母提取物、氯化钠、琼脂)。

1.2 方法

1.2.1 无患子皂苷提取液质量浓度的测定

从表2和图1可以看出，不同处理的菌落直径差异极显著，说明皂苷液培养基混合法对2种真菌存在抑制作用，且随着皂苷液质量浓度的提高，抑制作用也提高。当皂苷液质量浓度为11.14 g·L-1时，桉树溃疡病菌落直径第1天、第2天、第3天分别为0.82、4.23、7.56 cm，抑菌率分别为76.4%、52.2%、16.0%。当皂苷液质量浓度达到22.28 g·L-1时，抑菌率达到了100%。猕猴桃腐烂病也表现出相同的规律。

无患子皂苷含有羟基和羧基，为极性分子，分子质量较小，均在1 000左右，因此，皂苷可能通过细胞壁和细胞膜阻碍微生物的核酸复制或转录过程以及蛋白质的翻译过程，由此抑制微生物的生长繁殖[21]，而真菌和细菌的细胞结构差异大，所以无患子皂苷液对它们的抑制作用存在差异。本试验发现无患子皂苷液对细菌病害的抑制作用强于真菌性病害，这与赵志敏等[22]得出的结论：无患子皂苷对真菌(白色念珠菌(Monilia albican)和黑曲霉菌(Aspergillus niger))的抑菌性优于细菌(大肠杆菌(Escherichia coli)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)和金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus))不同，这可能在于选取的真菌种类不同而导致其结构和耐药性存在差异。

1.2.2 真菌抑菌活性试验

菌株培养：用灭菌的接种针挑取2种菌物的菌丝，接种在PDA培养基上，在28 ℃的条件下培养48 h。

菌株的培养：用接种环挑取所用菌种，用平板划线法接种在LB培养基上，30 ℃培养3 d。

②皂苷液培养基混合抑菌：将无患子皂苷液分成3个质量浓度，C1=44.56 g·L-1、C2=22.28 g·L-1、C3=11.14 g·L-1，过滤灭菌，以无菌水作为空白对照，共4个处理。按V(皂苷液)∶V(LB培养基)=1∶4配制有毒培养基。用灭菌后的接种环挑取欧美杨树溃疡病细菌，将其接种在4种培养基上，每一个处理设置5个重复。并将接种好的抑菌平板放置在的培养箱中30 ℃倒扣培养，每天观察试验结果，记录菌落数目。

从表1可以看出，2种真菌生长速度较快，都可以在培养基上正常生长，各个质量浓度的皂苷液和空白对照间不存在显著差异，说明用无患子皂苷液涂布法对2种真菌不存在抑制作用。

抑菌试验：在2种方法制作的有毒培养基上分别接种桉树溃疡病病菌、猕猴桃腐烂病菌2种真菌的菌丝，将2种抑菌平板在培养箱内28 ℃培养3 d，每天观察结果并测量菌落的直径。

抑菌率=((对照抑菌圈直径-试验抑菌圈直径)/对照抑菌圈直径)×100%。

1.2.3 细菌抑菌活性试验

国内设计咨询服务企业在投标报价时，大多依据两个主要标准，一是行业协会提供的人员收费标准，二是工程项目总体概算的相应比例。企业在确认自身投标报价时，并不严格按照企业投入成本为基数投标报价。设计咨询企业成本构成以人工费和日常经费为主，人工成本占据设计咨询企业较大比例。

无患子皂苷液抑菌试验：①牛津杯法。称取胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化钠10 g，琼脂10 g，配置成1 000 mL的蒸馏水体系，充分溶解后将pH调节至7.2，高压蒸汽(121 ℃)灭菌20 min，将其趁热倒入经过高压灭菌的培养皿中，凝固后备用。将无患子皂苷液分成5个质量浓度,C1=44.56 g·L-1、C2=22.28 g·L-1、C3=11.14 g·L-1、C4=5.57 g·L-1、C5=2.79 g·L-1，并过滤灭菌，以无菌水作为空白对照，共6个处理。每一个培养基加入0.1 mL菌悬液，并均匀涂布，细菌悬液菌数为1.0×1010个·mL-1。将灭菌牛津杯用无菌镊子夹出，先置于酒精灯火焰上迅速过一下火，再垂直放置于培养基表面，轻轻按压，使杯底与培养基之间无缝隙。每个平板放置2个牛津杯(外径为8 mm)，每种处理设置3个平板，即每种处理6个重复，向每个牛津杯注入150 μL的处理液[20]。在培养箱中30 ℃培养，每天观察结果，测量并计算抑菌圈大小和抑菌率。

抑菌圈=试验抑菌圈直径-对照抑菌圈直径；

抑菌率=((试验抑菌圈直径-对照抑菌圈直径)/试验抑菌圈直径)×100%。

水泥中的主要矿物成分C3A、C3S是影响其与外加剂相容性的主要因素，通常C3A含量低的水泥，其适应性良好，坍落度损失小；而C3A含量高的水泥，需要较多的石膏作调凝剂。如果混凝土拌合物中硫酸根浓度低，则新拌混凝土坍落度损失快。

1.2.4 数据处理

采用Excel 2013和SPSS 19.0软件进行数据处理和分析。用单因素方差分析(one-way ANOVA)比较3种病原菌在不同处理下、不同时间内的菌圈直径数据，设定影响因子为皂苷液质量浓度。同因素不同水平间的差异显著性采用邓肯多重极差检验法(Duncan)和最小显著差数法(LSD)在0.05和0.01水平上进行检验。分析前，数据经Kolmogorov-Smirnov test和Levene test检验，满足正态性。

2 结果与分析

2.1 齐墩果酸标准曲线

以吸光度为纵坐标，齐墩果酸的质量(mg)为横坐标，绘制标准曲线。经回归分析，得回归方程为y=8.372 6x+0.005 6，R2=0.990 9，线性关系较好，测得公司提供的无患子皂苷液吸光度是0.492，通过换算得到其质量浓度C=(44.56±0.76)g·L-1。

根据式(16)所建立的二人零和博弈问题,可求得混合策略Nash均衡解λ1=0.666 7, λ2=0.333 3。

苏长河在柳红头上系住红丝巾，轻轻地拍拍她的脑袋，他说：“你等着，我这就去把石头给你叫来，就现在，马上。”

2.2 对真菌活性的抑制

2.2.1 涂布抑菌

抑菌平板的制作：①皂苷液涂布抑菌。称取200 g马铃薯，洗净去皮切碎，加水1 000 mL煮沸30 min，纱布过滤，再加20 g葡萄糖和10 g琼脂，充分溶解后补足水分至1 000 mL，高压蒸汽(121 ℃)灭菌20 min，将其趁热倒入经过高压灭菌的培养皿中，凝固后备用。将无患子皂苷液分成3个质量浓度,C1=44.56 g·L-1、C2=22.28 g·L-1、C3=11.14 g·L-1，用针式过滤器进行过滤灭菌，以无菌水作为空白对照，共4个处理，每一个处理设置5个重复。将4种处理液用灭菌的涂布器均匀涂布在PDA培养基的表面。②皂苷液培养基混合抑菌。将无患子皂苷液分成3个质量浓度,C1=44.56 g·L-1、C2=22.28 g·L-1、C3=11.14 g·L-1，过滤灭菌，按V(皂苷液)∶V(PDA培养基)=1∶4配制带毒平板培养基[19],以无菌水作为空白对照，共4个处理，每一个处理设置5个重复。

表1 无患子皂苷液涂布对真菌菌落的抑制效果

皂苷提取液/g·L-1桉树溃疡病菌落直径/cm第1天第2天第3天猕猴桃腐烂病菌落直径/cm第1天第2天第3天44.564.12±0.128.86±0.18长满整个培养基2.32±0.196.86±0.098.77±0.1222.284.14±0.218.84±0.112.44±0.107.09±0.138.81±0.0911.144.09±0.238.90±0.082.39±0.187.10±0.178.82±0.14CK4.22±0.168.92±0.192.43±0.066.92±0.158.85±0.17

注：表中数据为平均值±标准误(n=5)，培养基的直径为9.0 cm。

2.2.2 皂苷液PDA培养基混合抑菌

将5 mL皂苷液旋蒸成糊状，用蒸馏水将其洗涤出，再用水饱和正丁醇进行反复萃取，每次正丁醇的用量为10 mL，向萃取后的溶液中加入20 mL甲醇。用35%的盐酸进行2 h的水解，再次进行旋蒸后，乙酸乙酯萃取3次(20、10、10 mL)，再加入甲醇定容至10 mL，设置3个重复。

表2 皂苷液PDA培养基混合处理对真菌菌落的抑制效果

皂苷提取液/g·L-1桉树溃疡病菌第1天菌落直径/cm抑菌率/%第2天菌落直径/cm抑菌率/%第3天菌落直径/cm抑菌率/%44.560C100.00C100.00C100.022.280C100.00C100.00C100.011.14(0.82±0.12)B76.4(4.23±0.26)B52.2(7.56±0.24)B16.0CK(3.47±0.22)A0(8.85±0.17)A0(9.00±0.05)A0

皂苷提取液/g·L-1猕猴桃腐烂病菌第1天菌落直径/cm抑菌率/%第2天菌落直径/cm抑菌率/%第3天菌落直径/cm抑菌率/%44.560C100.00C100.00C100.022.280C100.00C100.00C100.011.14(0.50±0.04)B80.5(2.52±0.33)B64.1(4.98±0.26)B43.8CK(2.57±0.07)A0(7.02±0.21)A0(8.86±0.09)A0

注：表中菌落直径的数据为平均值±标准误(n=5)，数据后同列不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。培养基的直径为9.0 cm。

N．猕猴桃腐烂病(Neofusicoccum parvum)；L.桉树溃疡病病菌(Lasiodiplodia theobromae)；1～4.皂苷液质量浓度分别为0、11.14、22.28、44.56 g·L-1。

图1 皂苷液PDA培养基混合抑菌(培养第2天)

2.3 对细菌活性的抑制

2.3.1 牛津杯法

从表3可以看出，随着皂苷液质量浓度的提高，抑菌圈直径差异极显著，说明牛津杯法对欧美杨树溃疡病菌存在抑制作用。皂苷质量浓度为2.79、5.58 g·L-1时抑菌率为0；当质量浓度上升至11.14、22.28、44.56 g·L-1时，抑菌率分别达到了15.8%、27.9%、38.9%。

2.3.2 皂苷液LB培养基混合抑菌

欧美杨树溃疡病细菌在空白对照培养基上生长良好，而在混有质量浓度为44.56、22.28、11.14 g·L-1的皂苷液的抑菌平板上均不能生长，抑菌率达到了100%(表4、图2)。

表3 皂苷提取液对欧美杨树溃疡病菌的抑制作用

皂苷提取液/g·L-1抑菌圈直径/mm抑菌率/%44.56(5.1±0.6)A38.922.28(3.1±0.8)B27.911.14(1.5±0.7)C15.85.570D02.790D0CK0D0

注：抑菌圈直径是培养第4天的观察结果，数值为平均值±标准误(n=6)，数据后同列不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。

表4 皂苷液LB混合培养基对欧美杨树溃疡病细菌的抑制作用

皂苷提取液/g·L-1菌落/个抑菌率/%44.56 010022.28010011.140100CK≥100

注:菌落数是培养第4天观察的结果。

A-D.皂苷液质量浓度分别为0、11.14、22.28、44.56 g·L-1。

图2 皂苷液LB混合培养基对欧美杨树溃疡病细菌的抑制情况(培养第4天)

3 讨论

配制0.10 g·L-1齐墩果酸-甲醇对照液10 mL，备用；配制5%香草醛-冰醋酸液10 mL，备用。用微量加样器取对照液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL，分别置于7支具塞试管中，水浴挥干溶剂，先后依次加入香草醛-冰醋酸液0.2 mL、高氯酸0.8 mL，充分摇匀后于70 ℃水浴加热15 min，取出后立即冰水冷却2 min，加入5 mL冰醋酸，摇匀，在547 nm处测吸光度，以不加对照液为空白组[17]。分析得出标准曲线后，将处理过的无患子水提液稀释100倍，吸取0.3 mL液体按上述过程操作测得其吸光度，通过其与齐墩果酸相对应的无患子总皂苷的换算系数[18]，计算无患子皂苷液的质量浓度。

朱朝阳等[21]发现，无患子皂苷液对大肠杆菌(Escherichia coli)有抑制作用，而欧美杨树溃疡病菌与大肠杆菌都属于肠杆菌科，在结构和代谢水平上有一定的相似性，所以无患子皂苷液对它们均存在抑制作用。且欧美杨树溃疡病菌与大肠杆菌都是革兰氏阴性菌，印证了赵志敏等[22]的结论：无患子的皂苷对革兰氏阴性菌(大肠杆菌、绿脓杆菌)的抑菌性优于革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌)。牛津杯法抑菌，抗菌药物在琼脂内向四周扩散，其质量浓度呈梯度递减。相比于牛津杯法抑菌，混合皂苷液和LB制成的有毒培养基，皂苷液的质量浓度更稳定，皂苷的含量更多，所以在相同的质量浓度下对欧美杨树溃疡病菌的抑制作用较好。

肉鸡养殖过程中，出现病害是不可避免的现象，即使采用了疫苗等防治手段，仍然不可避免有病弱的鸡雏出生或成年鸡患病，养殖户要将病鸡及时清理出鸡群，避免病害大面积传播导致更大的经济损失。清理出的病鸡不可食用、不可贩卖也不可掩埋了事，养殖户要及时将病鸡和死鸡做无害化处理，焚烧是最常见也最有效的方式，焚烧过程中需要保持在养殖场的下风处，尽量远离养殖场和周边居民生活区，确保所有尸体都焚烧完全后方可离开。除此之外，养殖户还要对患病鸡所在的鸡舍进行及时的消毒和清理，避免病菌传染其他肉鸡。

皂苷液涂布法对2种真菌不存在抑制作用，将皂苷液与PDA混合制作成的有毒培养基对2种真菌均存在较强的抑制作用，推测这与皂苷液的含量有关，即混合制成的培养基中皂苷含量更多，对细胞的杀伤作用更强。

目前，在不规范使用化学杀菌剂的今天，已经造成了对环境的破坏，也导致了病原菌产生了抗药性。因植物源的抑菌作用机制不同于抗生素，不易使病菌产生耐药性，且绿色、环保，日益倍受关注。依据本研究的结果，推测可以用喷洒皂苷液制剂对欧美杨树溃疡病菌进行防治，利用膏状皂苷制剂涂抹在欧美杨树溃疡病菌、桉树溃疡病菌、猕猴桃腐烂病菌导致的患病处进行治疗。目前关于无患子皂苷在抑菌方面的研究较少，本试验只对无患子皂苷提取液的抑菌作用做了初步研究，下一步将研究皂苷的抑菌机理，以便能为无患子植物源抑菌剂的开发奠定基础。因此，积极探讨无患子皂苷的抑菌作用，以指导合理使用植物源抑菌剂和化学杀菌剂协同使用，对减少耐药病菌、合理保护环境，有着积极的现实意义。

4 结论

用无患子皂苷液涂布制成的有毒培养基对桉树溃疡病病菌、猕猴桃腐烂病菌2种真菌不存在抑制作用，而利用皂苷液与培养基混合制成的有毒培养基，随着皂苷液质量浓度的增大，对2种真菌的抑制作用增强，当皂苷质量浓度达到44.56、22.28 g·L-1时，对2种真菌的抑制率分别达到了100%。细菌对皂苷液的敏感性强于真菌，随着皂苷液质量浓度的增大，牛津杯法抑菌对欧美杨树溃疡病细菌的抑制作用增强，皂苷质量浓度为44.56 g·L-1时，抑菌率达到了38.9%；皂苷质量浓度在44.56、22.28、11.14 g·L-1时，皂苷液培养基与混合培养基的抑菌率均达到了100%。无患子皂苷对细菌病害的抑制作用强于真菌性病害，且皂苷液与培养基混合配置的方法抑菌效果更好。本试验可为探索抑菌机理、开发植物源抑菌剂提供基础数据。

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