在农业生产中，由于化学农药具有高毒、高残留的特点，对空气、水体、土壤环境和人类造成的不可预知危害，因此化学药剂的使用正在逐步受到约束。但无害、无残留的农药一直是专家们研究的方向，所以生物农药成为了当下的研究热点。淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)作为植物线虫重要的生防菌，半个多世纪以来都是国内外学者的重要研究对象，并取得了一系列显著成果。国际马铃薯中心Jatala首先发现淡紫拟青霉菌对南方根结线虫(Meloidogyne incognita)的卵寄生率高达60%～70%[1]，另外淡紫拟青霉对孢囊线虫(Heterodera sp.)、白色球孢囊线虫(Globoder pallida)、穿刺线虫(Tylenchulus sp.)、马铃薯金线虫(Globodera rostochiensis)、异皮线虫(Heteroderidae schmidt sp.)和珍珠线虫(Nacobbus sp.)等也有很强的寄生能力[2]。目前淡紫拟青霉生物菌剂已广泛投入生产生活中，用于防治根结线虫和胞囊线虫等有害植物寄生线虫。

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目前，首要解决的问题是实现淡紫拟青霉的低成本、高效益规模化生产。许多学者应用廉价的材料对淡紫拟青霉的发酵条件进行优化，以降低其生产成本。如Brand et al.利用当地丰富的咖啡豆壳、木薯根渣、脱脂豆、甘蔗渣作为载体来生产淡紫拟青霉[3]；潘沧桑等利用啤酒厂的废渣、废液培养淡紫拟青霉，并将其制成菌剂，测定发现含孢量为3.4×106个·g-1[4]；黄永兵等采用玉米秸秆、米糠和玉米粉作为底物固体发酵淡紫拟青霉[5]。但由于培养时间过长、生产成本过高等问题，以上方法无法满足淡紫拟青霉孢子的工业化生产。从工业生产上考虑，大量生产孢子及菌丝的最适方法是液体发酵培养。本研究利用摇瓶液体发酵培养，以低成本的马铃薯葡萄糖液体培养基为碳源，探讨培养温度、初始pH值、供氧量和接菌量对淡紫拟青霉PT1菌株产生孢子和菌丝的影响，以期为该菌今后的大批量工业化培养提供技术支撑及理论数据基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

淡紫拟青霉菌株PT1来源于中国林业科学院微生物菌株平台，保存于东北林业大学森林微生物实验室。

培养基：改良PDA(去皮马铃薯200.0 g煮汁，葡萄糖20.0 g，琼脂粉20.0 g，MgSO4 1.5 g,KH2PO4 3.0 g，加水定容至1 000 mL)；改良PD(去皮马铃薯200.0 g煮汁，葡萄糖20.0 g，MgSO4 1.5 g,KH2PO4 3.0 g，加水定容至1 000 mL)[6]。

1.2 孢子的收集

将保存菌株PT1接种到PDA平板中心，在25 ℃下培养7 d，待产孢后用15 mL无菌水洗下孢子，调制成1×107个·mL-1的孢子悬浮液，4 ℃保存备用[6]。

1.3 PT1菌株液态发酵条件的筛选

温度对发酵液生物量的影响：将200 mL PD培养液加入到500 mL三角瓶中，每瓶中接种孢子悬浮液1 mL，分别在20、23、26、28、30 ℃条件下于160 r·min-1振荡培养7 d，并分别在3、5、7 d通过显微镜检查孢子产量，并称量菌丝的干质量。

初始pH值对发酵液生物量的影响：在500 mL的三角瓶中分别加入200 mL PD培养液，用1 mol·L-1HCl和NaOH溶液调配PD培养液的初始pH值分别为3、5、7、9、11、13、15，每瓶中接种孢子悬浮液1 mL，在25 ℃和30 ℃条件下160 r·min-1振荡培养，7 d后镜检并称量菌丝干质量。试验设3个重复。

在不同初始pH条件下，PT1菌株的孢子产量和菌丝生物量见表2。由表2可知，在培养温度分别为25 ℃和30 ℃时，孢子生产量的曲线较为一致，在酸性条件下(pH<7)都不利于PT1菌株产生孢子，在初始pH=3时均不产生孢子；但随着pH值的上升，孢子量呈上升趋势，分生孢子的数量都是在初始pH=11时达到最大，在25 ℃下为128.0×105菌落·mL-1，在30 ℃下为468.0×105菌落·mL-1。因此，对于以获得孢子为目的的液体发酵生产中，菌株PT1在25、30 ℃的培养下，产生孢子的最适初始pH值都为11。但是，在30 ℃条件下的孢子产量远远大于在25 ℃条件下的孢子产量，与2.1中的温度测试结果相吻合。因此，在最适温度30 ℃下设置初始pH为11时，可以有效地提高孢子的产量。

采用遗传算法进行全局搜索时，遗传操作是其主要的进化算子，包括选择操作、交叉操作和变异操作，每种操作的实现方式分别如下：

我们就这样在乡里唯一的，也是最繁华的“长安”大街上走着，在目光织成的网中穿过，似乎还听见了窃笑声。我想溜，又没借口，想跑又跑不起来，只好低下头，感到芒刺在背，苦不堪言。我斜眼见她挺着丰满、高耸的胸脯潇洒自若地走着，想和我说什么；我佯装看脚下的路，只看见她一闪一闪，穿着白皮凉鞋的脚尖。

2 结果与分析

2.1 最适温度的筛选

培养温度分别为25 ℃和30 ℃的条件下，菌丝生物量曲线也较为一致，均在pH=9时菌丝的干质量达到最大值，分别为0.672 4、0.774 3 g。因此，在以获得菌丝为目的的液体发酵生产中，初始pH=9最为适宜。

表1 温度对PT1菌株孢子数量和菌丝干质量的影响

温度/℃培养时间/d孢子/105菌落·mL-1菌丝干质量/g2031.370.974254.551.332475.500.83752332.450.752454.500.730573.250.72362632.250.643253.550.691776.750.70132831.050.613755.250.712575.000.587630310.550.6873524.250.567275.500.5136

2.2 最适初始pH的筛选

供氧条件对发酵液生物量的影响：分别将50、100、150、200、250 mL的PD培养液加入500 mL三角瓶中，每瓶中接种孢子悬浮液1 mL，在25 ℃和30 ℃条件下160 r·min-1振荡培养7 d，分别于3、5、7 d后镜检，并称量菌丝干质量。试验设3个重复。

在不同温度条件下，菌株PT1孢子的产量和菌丝生物量见表1。由表1可知，菌株PT1孢子的产量随着温度的升高而显著增加，在30 ℃的条件下培养5 d时孢子量达到最高，为24.2×105菌落·mL-1，其次是在30 ℃下培养3 d时，此时的孢子量也已经为10.5×105菌落·mL-1。因此，确定30 ℃为菌株PT1液体发酵产孢的最适温度，在此温度下5 d为最适培养时间。由表1可见，在温度为20 ℃情况下培养5 d时菌丝干质量最大，为1.332 4 g，并且各个培养温度下均在5 d时菌丝的干质量达到最大。所以，对于以生产菌丝和孢子为主的生产中，可以选择培养温度分别20 ℃和30 ℃条件下培养5 d最为合适。

2.3 最适供氧条件的筛选

本文利用ANSYS软件中的FLUENT对混合室内料液混合过程进行模拟分析，将NaCl作为示踪剂以打补丁方式(Patch)加入混合相中，通过模拟NaCl在混合室内扩散的过程，分析了不同桨叶结构的搅拌桨对混合速率和混合效率的影响，得出以下结论。

初始接菌量对发酵液生物量的影响：将200 mL的PD培养液加入到500 mL三角瓶中，将0.5、1.0、1.5、2.0 mL的孢子悬浮液分别接入瓶中，在25 ℃和30 ℃条件下160 r·min-1振荡培养，分别于3、5、7 d后镜检并称量菌丝干质量。试验设3个重复。

表2 初始pH值对PT1菌株孢子数量和菌丝干质量的影响

温度/℃初始pH值孢子/105菌落·mL-1菌丝干质量/g25300.102553.00.487674.00.5846935.00.672411128.00.52531386.00.46371557.00.386330300.187554.00.537675.00.67329167.00.774311468.00.546213375.00.342515323.00.2437

在25 ℃条件下初始接菌量为1.5 mL，培养5 d时，菌丝干质量达到最大值，为0.864 3 g。在30 ℃、初始接菌量为1.5 mL、培养5 d时，菌丝干质量达到最大值，为0.972 8 g。由此可得，在初始接菌量为1.5 mL、培养5 d时，菌丝的生物量积累达到最大值。

表3 供氧条件对PT1菌株孢子数量和菌丝干质量的影响

装瓶量/mL培养时间/d孢子/105菌落·mL-125℃30℃菌丝干质量/g25℃30℃5034.02.00.10370.132253.025.00.15280.115373.086.00.12360.1324100310.0143.00.33420.276358.0235.00.29540.243773.0115.00.35070.223415032.020.00.57420.4632524.0146.00.53640.4768722.0103.00.64560.392720033.04.00.87260.7324521.016.00.94320.6546719.014.00.98430.754225033.02.00.64230.534254.000.53240.476274.000.56210.4324

2.4 最适接菌量的筛选

在不同接菌量条件下，PT1菌株在培养3、5、7 d时，孢子的产量和菌丝生物量的积累情况见表4。由表4可知，在25 ℃条件下初始接菌量为1.0 mL，培养时间为7 d时，孢子产量达到最大，为10.50×105菌落·mL-1。在30 ℃下初始接菌量为1.0 mL、培养7 d时，孢子数量达最大，为35.75×105菌落·mL-1；其次是在接菌量1.0 mL、培养5 d时，孢子产量达到23.20×105菌落·mL-1。由此可知，PT1菌株产孢最适宜的接菌量为，30 ℃条件下500 mL三角瓶中接菌1.0 mL。

在不同供氧条件下，PT1菌株在培养3、5、7 d时的孢子产量和菌丝生物量见表3。由表3可知，在25 ℃条件下，将150 mL PD培养液加入到500 mL三角瓶中，培养5 d孢子的产量最大，为24.0×105菌落·mL-1；在30 ℃条件下500 mL三角瓶中加入100 mL PD培养液，培养5 d孢子的产量最大，为235.0×105菌落·mL-1，在相同的条件下培养3 d后，孢子产量为143.0×105菌落·mL-1。可见，在30 ℃条件下的孢子产量远大于在25 ℃条件下的孢子产量。由此可以确定，PT1菌株在30 ℃条件下500 mL三角瓶中加入100 mL PD培养液，培养5 d产孢量达到最大值。

培养温度分别为25、30 ℃条件时，将200 mL PD培养液加入500 mL三角瓶中，培养7 d时菌丝干质量达到最大值，分别为0.984 3、0.754 2 g。培养温度25 ℃时的菌丝干质量高于培养温度30 ℃时的菌丝干质量，可见，温度较低有利于PT1菌株菌丝的积累，这与2.1中的温度试验结果一致。因此，可以确定PT1菌株在25 ℃条件下500 mL三角瓶中加入200 mL PD培养液培养7 d后，菌丝的生物量积累达到最大值。

表4 接菌量对PT1菌株孢子数量和菌丝干质量的影响

接菌量/mL培养时间/d孢子/105菌落·mL-125℃30℃菌丝干质量/g25℃30℃0.530.750 0.35260.423651.451.250.56730.702873.755.500.43290.64531.032.509.500.53210.563757.2523.250.61770.7111710.5035.750.70860.70241.531.508.000.56730.732553.7517.750.86430.972876.255.250.76240.86542.031.000.500.43280.732652.352.250.57620.643573.501.500.36280.5429

3 结论与讨论

淡紫拟青霉是土壤中常见的内寄生真菌，是植物寄生线虫的主要天敌，也是最重要的生防菌剂，多以活性孢子制剂投入到生产生活中。所以实现淡紫拟青霉孢子的大量生产在防治植物寄生线虫方面有着重要的意义。在以往的研究中多以固体发酵产孢为主，如汪军等以玉米、甘蔗渣、麸皮、壳聚糖制作复合培养基固体发酵淡紫拟青霉[7]；肖顺等利用菌草和麸皮混合作为培养基来培养淡紫拟青霉[8]，固体发酵虽然有效但试验方法繁琐，不利于大规模投入生产。梁照文等对该菌液体培养基进行了比较[9]，但对液体发酵条件研究较少，不能满足菌剂生产规模化的要求。为满足淡紫拟青霉发酵低成本、高产量、大规模工业化生产的目的，本试验通过淡紫拟青霉液体发酵对不同的温度、pH值、光照等环境因子对真菌孢子萌发和菌落生长的影响进行筛选。研究表明，在不同温度条件下，菌株PT1孢子的产量随着温度的升高而显著增加，在20～30 ℃均能生长，在30 ℃条件下培养5 d孢子的产量达到最大值。在以往的报道中，在过酸或过碱的环境下都会抑制淡紫拟青霉孢子的产生。在本试验中PT1菌株在pH值小于8的条件下孢子的产量较少，当pH=9时孢子产量增加，在pH=11时孢子产量达到峰值，继续升高pH值后孢子产量逐渐下降。这与淡紫拟青霉E16菌株pH值为6～10产孢量较大的结果大为不同，可能是由于在特定情况下不同菌株的产孢条件也不尽相同。供氧条件对PT1菌株液体发酵产孢量的影响没有温度和pH值的影响作用大。但在30 ℃条件下培养5 d时，将100 mL PD培养液加入500 mL三角瓶对液体发酵产孢最为有利。不同的装瓶量会使三角瓶中的通气量和溶氧量不同，只有在最适宜的条件下微生物才可以达到孢子最高产量，而且从本试验中可以发现较高的温度有利于PT1菌株提前达到产孢量的最大值。本试验中，PT1菌株产生孢子量最多时，供氧条件为，在30 ℃条件下将100 mL PD培养液加入到500 mL三角瓶，接菌量为1.0 mL。

需求情况：农业需求方面，秋季二铵市场缓慢推进，下游询价明显增多，但实际成交有限。出口方面，东南亚需求进入下半场，采购放缓，印度市场采购节奏放缓，但受汇率影响，价格持续保持平稳，企业出口商谈价坚挺在420美元/吨FOB。

在获得高菌丝生物量方面本试验同样从培养温度、初始pH值、供氧条件和初始接菌量4个方面进行了筛选。PT1菌株菌丝生产的最适宜条件为，培养温度20 ℃、培养液的初始pH=9、供氧条件为将200 mL PD培养液加入到500 mL三角瓶中，当500 mL三角瓶中装有200 mL PD培养液时接菌量为1.5 mL,在以上条件都满足的情况下培养5～7 d。

除培养温度、初始pH值、供氧条件和初始接菌量的条件影响外，淡紫拟青霉菌丝生长及产孢条件还受到营养条件、无机盐、微量元素等诸多因素的影响，有待进一步的试验探究。本试验虽只是在实验室内进行的小规模试验，但对淡紫拟青霉大规模的液体发酵生产具有一定的指导意义，为淡紫拟青霉制剂的生产提供了一个新的途径。

2.1 风险识别。要实现对风险进行有效的预防前提是要对风险进行识别，风险识别是利用有效的系统、经验的技术手段和科学的方法对事故发生前各种风险的大小、风险存在的原因进行全面、联系分析的过程。风险识别包括分析风险的关键环节、风险的事故种类和风险的控制重点等。

参 考 文 献

[1] JALATA P, KATENBAVH R, BOCARIGEL M. Biological control of Meloidogyne incognita and Globodera pallida on potatoes[J]. Nematol,1979,11:303.

[2] JATALA P. Biological control of plant-parasitic nematodes[J]. Ann Rev Phytopathology,1986,24(1)：452-489.

[3] BRAND D, ROUSSOS S, PNDEY A, et al. Development of a bionematicide with Paecilomyces lilacinus to control Meloidogyne incognita[J]. Applied Biochemistry and Biotechnology,2004,118(1/2/3)：81-88.

[4] 潘沧桑,林竞,徐腾,等.用啤酒厂废料生产淡紫拟青霉菌剂及防效试验[J].微生物学通报,1997,24(2)：107-109.

[5] 黄永兵,肖炎农,黄蓉,等.应用玉米秸秆生产淡紫拟青霉36-1菌株孢子[J].中国生物防治,2007,23(4)：338-341．

[6] 池玉杰,伊洪伟,吉海龙.长枝木霉菌株T05液态发酵产孢和菌丝生物量条件的筛选[J].东北林业大学学报,2016,44(1):110-113.

[7] 汪军,杨腊英,毛超,等.淡紫拟青霉E7菌株固体放大发酵产孢培养基和工艺条件研究[J].热带作物学报,2013,34(10):2038-2045.

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