肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma Cell，HCC）是威胁人类生命健康最常见、最严重的恶性肿瘤之一，世界上每年约有一百万人死于此病。原发性肝癌是临床上最常见的恶性肿瘤之一[1]，其中以肝细胞癌（以下简称肝癌）为最主要的病理类型，其特点为起病隐匿，病程进展快，手术切除率低，对常规放化疗手段缺乏敏感性，且死亡率和发病率基本接近[2]。现已严重威胁到了我国人民健康和生命，其危险性不容小觑。

伴随着肿瘤的快速生长，肿瘤组织内便会出现局限性缺氧。这种缺氧现象随着肿瘤内血管等物质的生长而变化，长期低氧导致了活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）的产生。研究结果表明，活性氧在多种癌症中均发挥着重要的作用，并与细胞内信号转导、细胞凋亡、衰老有关[3-4]。细胞内的过氧化物酶（Peroxiredoxin，Prx）是一类通过清除细胞内活性氧，可通过其过氧化物酶等功能或以分子伴随物形式在清除肿瘤内产生的ROS，放、化疗抵抗，细胞增殖、分化、凋亡过程中发挥重要作用[5-7]。Prx V是Prxs家族中的一员，具有清除细胞内的ROS和过氧亚硝酸盐的作用[8-9]。研究结果显示，Prx V可以有效地保护由p53，氧化应激等刺激因子诱导的细胞凋亡[10-11]，同时也具有良好的神经保护作用[12]。因此，运用基因沉默技术建立Prx V基因沉默的HepG2细胞系，将为研究和开发肝癌治疗药物提供良好的基础和理论依据。

实验采用携载绿色荧光蛋白（GFP）的Prx V shRNA慢病毒载体，对人肝癌HepG2细胞中的Prx V基因进行基因沉默检测其蛋白质水平的表达变化，为探究Prx V在治疗肝癌过程中的作用提供新思路。

（1）刚性的规章制度起主要作用。在被问及学校的管理发展到哪个阶段时，64.67%的同学表示学校的管理现在处于第二阶段，主要依靠一套完善的管理制度和机制。只有 14%的同学表示学校的管理处在第三个阶段，主要依靠校园文化（此处的文化是指价值理念层面），这说明，目前该大学的管理中价值理念层面的文化起到一定的作用，但主要是依靠刚性的规章制度。

1　材料和方法

1.1　细胞

肝癌HepG2细胞来自黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院分子药理与药效学研究实验室。

1.2　试剂及仪器

DMEM/高糖培养基购买自美国Hyclone公司；胎牛血清购自美国Gibco公司；抗 mouse Prx V、抗rabbit β-actin单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司。

本文以自然生长状态的小麦为研究对象，利用小麦茎秆的弹性特性，运用力学理论和方法对小麦活体茎秆在横向受迫条件下产生的回弹力进行研究，旨在弄清回弹力与小麦茎秆机械强度之间的关系，给出评价指标，为小麦茎秆力学特性检测仪器设计、收获机械的设计以及茎秆的综合利用提供理论依据。

测定前24 h，对293T细胞进行传代培养，96孔培养皿每孔加入约1.0×104个细胞，每孔体积100 μL。将病毒储存液按梯度稀释（10-1～10-3），选取所需的细胞孔，弃去培养液，然后将稀释好的病毒液依次加到细胞孔中，放入培养箱中继续培养48 h后，每孔加入100 μL新鲜培养液。72 h后观察荧光表达。将最大稀释倍数孔中的带有荧光的细胞进行计数，并计算病毒滴度为 2×108TU·mL-1。病毒滴度（TU·mL-1）=（荧光细胞个数×转染时细胞数·100-1×每孔加入病毒稀释液体积）×1·稀释浓度-1。

1.3　细胞培养

分别收集筛选后已转染成功的细胞样品，5 000 r·min-1，4℃离心弃去上层液体，加入 PBS溶液500 μL。随即使用流式细胞仪分析10 000个细胞，统计结果并得到转染变化柱状图。

1.4　慢病毒载体的构建

HepG2细胞转染shPrx V72 h后通过流式细胞术检测三种细胞荧光表达情况，从结果中，可以检测到慢病毒载体转染效率较高，均在70%以上（图3），对其定量分析具有统计学意义（***，P＜0.001，均与con组比较）（图 4）。

1.5　慢病毒滴定测定

96孔细胞培养皿、48孔细胞培养皿、24孔细胞培养皿、12孔细胞培养皿、6孔细胞培养皿、10 cm细胞培养皿购自美国Costar公司、infinite M200pro酶标仪购买自TECAN公司、蛋白质免疫印迹系统购自美国Amersham Bioscience公司。

1.6　病毒转染HepG2细胞并检测其干扰效果

取HepG2细胞计数并均匀种到96孔细胞培养皿，使其转染时细胞汇合率达60%左右，按照种植的HepG2细胞数及 MIO值（MOI=20）计算所加病毒量。将含有Prx V基因片段的慢病毒shPrx V与mockPrx V分别转染HepG2细胞。转染后的HepG2细胞根据转染的病毒命名分组为shPrx V组、mock-Prx V组，同时将未转染的HepG2细胞作为空白对照组。将细胞从96孔细胞培养皿不断扩增直至生长到10 cm细胞培养皿后，将常规培养24 h的各组细胞更换为含有 2 μg·mL-1嘌呤霉素 （Puromycin）的DMEM培养液进行抗性筛选，经筛选后，利用荧光显微镜观察。

1.7　荧光显微镜检测

分别收集筛选后已转染成功的细胞样品，用以检测慢病毒转染情况。加入蛋白质裂解液裂解，12 000 r·min-1，4 ℃离心回收上清，即蛋白质。15 μg细胞总蛋白质提取物进行12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），蛋白质转移到硝酸纤维素膜后进行封闭，抗 mouse Prx V、抗 rabbit βactin单克隆抗体4℃孵育过夜。用 TBST（含有15 mmol·L-1的 NaCl（ Tris-HCL，TBS）、0.2%Tween-20、10 mmol·L-1的 Tris-HCl）洗涤 5 次，5 min·次-1，与 HRP 标记的二抗（1∶5 000）孵育 2 h，洗膜、ECL底物孵育、曝光、显影、定影及结果分析。每组实验均做3次重复。

1.8　流式细胞术检测

HepG2细胞接种于DMEM培养基中，内含10%的灭活新生胎牛血清（FBS）及100 U·mL-1青霉素/链霉素（P/S），置于 37℃、5%CO2及饱和湿度的培养箱中培养。

所有结果以均值±标准差表示，两组间比较用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。每组实验均重复三次以上。

1.9　蛋白质印迹分析

在6孔细胞培养皿去掉原有液体后，PBS溶液清洗两遍，加入500 μL PBS溶液后，在37℃细胞培养箱中孵育10 min，利用荧光显微镜分别检测明视野及绿色荧光条件下的荧光照片。每组实验均做3次重复。

(1)麻石硅铝质粗骨土：分布在杨头村、黄燕村、龙眠村大部分地区，母岩多为片麻岩和花岗岩，成土后为松散的碎屑层，土壤层较薄时，A-B层侵蚀殆尽，风化碎屑层裸露，显粗骨特征。

1.1　0统计学分析

②在以单个工程为单位实行招标的情况下，个别地方存在低价胜出的现象。由于只强调价格低，忽视了对管材质量的要求和控制，容易出现管材质量得不到保证的现象。

2　结果

2.1　细胞状态观察

取经慢病毒shPrx V与mockPrx V的转染HepG2细胞0 P、3 P、6 P于荧光显微镜下观察其明视野，发现在转染慢病毒后细胞状态无明显改变并能稳定生长（图1）。

  

图1　转染HepG2细胞不同代数后细胞状态观察情况（标尺=400 μm）Fig.1　Cell’s states after transfectiondifferent generations in HepG2 cells.（scale bars=400 μm）

2.2　慢病毒转染HepG2细胞后荧光显微镜检测结果

HepG2细胞转染shPrx V72 h后在荧光显微镜下观察绿色荧光表达，从明视野和绿色荧光视野二者比较中，可以观察到慢病毒载体转染效率较高，可达80%以上（图2）。

  

图2　慢病毒转染HepG2细胞后荧光显微镜检测结果（标尺=400 μm）Fig.2　Resultof HepG2 cells after transfection with lentiviralvector detection by fluorescence microscopy（scale bars=400 μm）

2.3　流式细胞术检测分析

根据Gene Bank中Prx V基因序列查询，设计了针对Prx V基因的siRNA序列（5′-GGAATCGACGT CTCAAGAGGT-3′） 和阴性对照 （negative control）siRNA 序列（5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′）。构建的目的慢病毒载体命名为shPrx V和mockPrx V，送由苏州吉玛基因股份有限公司进行构建和包装。

  

图3　转染HepG2细胞72 h后流式细胞术检测绿色荧光蛋白表达情况Fig.3　Detection of the GFP inFCMafter transfection 72 hin HepG2 cells

  

图4　转染HepG2细胞72 h后流式细胞术检测绿色荧光蛋白表达的定量分析Fig.4　The quantitative analysis ofthe GFP inFCMafter transfection 72 hin HepG2 cells

2.4　蛋白免疫印迹法检测分析

检测转染慢病毒shPrx V与mockPrx V的HepG2细胞中的Prx V蛋白质水平（图5）。从结果可以看出：转染Prx V shRNA慢病毒载体后HepG2细胞中Prx V蛋白质表达量明显下降，并具有统计学意义（***，P＜0.001，与 con组比较）（图 6）。可说明对Prx V基因沉默有效，并可稳定遗传。

在以上整个处理过程中，生物过滤器的介质——加强型活性土壤，为微生物代谢提供氧气、水分和矿物营养成分，它的厚度通常在400～2 000 mm，而最终的数值需根据臭气浓度、处理气体量、现场条件等因素进行设计，以保证气体在生物土壤中有足够的停留时间。在生物土壤滤池初始运行期间，会在滤料中形成广泛的微生物种群，它们对臭气中的氨、三甲胺、硫化氢、甲硫醇、甲硫醚、二甲二硫、二硫化碳等致臭物质具有较好的降解效果［2］。

  

图5　蛋白免疫印迹法检测转染后HepG2细胞中Prx V的蛋白质水平Fig.5　The protein level of PrxV aftertransfection in HepG2 cell by Western blot assay

  

图6　不同实验组中Prx V蛋白的相对表达量Fig.6　The relative expression level of Prx V protein in the different experimental groups

3　讨论

肝癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，面对高居不下的发病率和死亡率，进一步明确肝癌的发病机理，并探索出一种新的治疗方法显得尤为迫切和重要。Prxs家族是具有过氧化物酶活性的巯基特异性抗氧化蛋白[13]，在细胞内可发挥清除或减少体内ROS、过氧化氢、过氧亚硝酸盐等一系列有机氢过氧化物（ROOH）的重要作用。Prx家族包含6个成员，并广泛分布在真核及原核生物中。Prx V属于Prx家族2-Cys Prx成员，是参与机体氧化代谢的重要酶之一，主要分布在细胞质、过氧化物酶体、线粒体中[14]。据我们前期研究表明：一氧化氮供体硝普化钠（SNP）和脂多糖（LPS）处理神经小胶质细胞BV2，引起Prx V蛋白质水平上升[15]，β-拉帕醌通过下调Prx V诱导了结肠癌细胞SW480凋亡[16]。为进一步研究Prx V在细胞间的作用机理，我们运用了Prx V shRNA慢病毒载体，对肝癌HepG2细胞中的Prx V基因进行沉默。慢病毒载体是一种有复制缺陷性的逆转录病毒载体，可以序列特异的方式剔除目的基因，从而实现细胞内目的基因的稳定转染与表达[17]。而非慢病毒载体系统的细胞转染主要方式是质粒载体介导方式，虽然是目前较常用和经济的方式，但存在转染效率低、目的基因表达弱、持续时间短的缺点。经查阅文献可知，慢病毒载体对肝细胞的转导情况与其他细胞相比转导效率更高，转导效果更佳[18]。因此，也选择慢病毒载体作为实验的理想载体。

在对实验前期条件探索时，观察到在利用Prx V shRNA慢病毒载体转染HepG2细胞时，在72 h后加入病毒液和 Polybrene（5 μL·mL-1）的 HepG2 细胞荧光转染率可达80%以上，但未加入进行转染的HepG2细胞荧光转染率仅为50%左右，但细胞的生长状态和生长速度并无明显影响，故选择在对肝癌细胞HepG2进行Prx V shRNA慢病毒转染时选择使用Polybrene作为促进剂以达到更好的转染效果。

在教学过程中，教学理念是教师开展教学工作的核心标准与计划依据，对整个教学过程起关键性作用。然而，传统语文教学中，大部分教师将教学目光集中在促使学生积累语文专业知识与学习技巧、提高学生语文基础能力上，一定程度上忽视了对学生的情感素质人文性教学，这与现代化新课改背景下的教学要求不符，也不利于构建学生的自主认知，难以培养学生形成逐步完善独立的学习思考意识。鉴于此，教师应积极转变教学理念，注重在语文教学过程中增加对学生的人文素质性教学，提高学生学习的自主独立意识，增加学生的主人翁意识，丰富学生学习体验。

根据实验结果显示，Prx V shRNA慢病毒载体转染HepG2细胞效果较好，可为今后研究Prx V基因沉默后HepG2细胞的生长能力、迁移能力、成瘤特性、细胞周期变化及对抗肿瘤药物的敏感性等方面提供支持，同时也为探讨Prx V基因在肝癌细胞中是否还发挥着更为关键的作用，及其具体的分子调控机制奠定研究基础。

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