传播性海绵状脑病（Transmissible spongiform encephalopathies，TSE）又称朊病毒病（prion disease），是一类侵袭人和动物中枢神经系统的神经退行性疾病，潜伏期长，病死率100%。在动物中，朊病毒病包括绵羊和山羊瘙痒病（scrapie）、牛海绵状脑病（bovine spongiform encephalopathy，BSE）、麋鹿慢性消耗性疾病（chronic wasting disease，CWD）等。而在人类中，朊病毒病分为克-雅病（Creutzefeldt-Jakob Disease，CJD）、库鲁病（Kuru）、GSS 综合征（Gerstmann-Straüssler-Scheinker syndrome，GSS）和致死性家族性失眠症（fatal familial insomnia，FFI），其中以 CJD 最为常见[1，2]。目前的研究认为朊病毒病的感染因子是一种不含核酸具有感染性的蛋白质（PrPSc），称为朊病毒。该蛋白质具有自我复制能力，可使正常存在于神经细胞表面、对蛋白酶敏感的正常朊蛋白（PrPC）转变为异常的、对蛋白酶抵抗的PrPSc。在转变为PrPSc后，PrPC的正常功能如免疫调节、信号转导、铜离子结合等将会受到破坏[3]。

Ca2+是中枢神经系统内重要的第二信使，在细胞内通过与钙调蛋白（Calmodulin，CaM）结合发挥多种生理作用，如细胞增殖、凋亡及自噬等[4-7]。当细胞受到外界的有效刺激后，细胞内的Ca2+浓度瞬时提高，Ca2+即与 CaM 结合[8，9]，导致 CaM 构象改变，生成有活性的Ca2+/CaM复合物[10]。Ca2+/CaM复合物会通过活化依赖Ca2+/CaM的蛋白激酶（CaMK），再进一步影响如cAMP调控元件结合蛋白（cAMP response element binding protein，CREB）等靶酶的活性，从而完成诸多生理作用[11]。

研究以羊瘙痒因子263K感染的仓鼠模型为研究对象，分析了CaM及其下游激酶、调控和靶蛋白的表达、分布情况，了解了朊病毒感染导致CaM及其下游底物含量变化特点，为明确朊病毒病的致病机制奠定科学基础。

1　材料与方法

1.1　朊病毒毒株

羊瘙痒因子仓鼠适应株263K以及脑组织匀浆及脑组织切片全部由中国疾病预防控制中心病毒病所朊病毒病室保存。

1.2　脑组织匀浆的制备

取正常仓鼠及羊瘙痒因子263K感染仓鼠终末期脑组织，用裂解液（100 mmol·L-1NaCl，10 mmol·L-1EDTA，0.5%Nonidet P-40，0.5%sodium deoxycholate，10 mmol·L-1Tris，pH7.5 含蛋白酶抑制剂 III）制成10%（w·v-1）的脑匀浆，2 000 r·min-1离心 10 min 后取上清分装，-80℃保存备用。

1.3　抗体

 

表1　研究中所使用的抗体Table 1　The antibodies used in the study

  

抗体Calmodulin CaMKII CaMKIV phosphor-CaMKII phosphor-CaMKIV CREB phosphor-CREB BDNF β-actin NeuN GFAP AlexaFluor 488 goat anti-mouse IgG（H+L）Alexa Flour 568 goat anti-rabbit IgG（H+L）○R　○R品牌Cell Signaling Technology Abcam Abcam Abcam Abcam Abcam Abcam Santa Cruz Biotechnology Santa Cruz Biotechnology Millipore Corporation Cell Signaling Technology Life Technologies Life Technologies货号#4830 ab52476 ab3557 ab5638 ab59424 ab32515 ab32096 Sc-546 Sc-47778 MAB377#3670 A11029 A11036

1.4　Western blot检测

为了分析升高的CaM在脑组织中的分布特点，我们利用免疫组织化学方法羊瘙痒因子263K感染终末期仓鼠脑组织切片中CaM的分布情况进行分析，结果发现在羊瘙痒因子263K感染的仓鼠脑组织皮层、丘脑和小脑区域中存在大量不规则、星体形状的CaM特异性棕色斑点（图2）。

1.5　免疫组织化学实验

数据用均数加减平均标准差表示，两组间差异用t检验，P＜0.05为具有统计学差异，P＞0.05为无差异。

1.6　组织免疫荧光实验

为了探究增加的CaM对下游激酶的影响，我们利用Western blot方法对羊瘙痒因子263K感染终末期仓鼠脑组织中CaMKII和CaMKIV的变化特点进行分析。结果显示与正常对照组相比，羊瘙痒因子263K感染仓鼠脑组织中CaMKIIα和CaMKIIβ的表达水平显著降低。同时，磷酸化的CaMKIIα（p-CaMKIIα，T286）含量也显著降低（图 4A）。图 4B 显示CaMKIV及其磷酸化形式p-CaMKIV（T196和T200）的含量在羊瘙痒因子263K感染的仓鼠脑组织中也呈下降的趋势，但没有统计学差异。

1.7　统计学处理

将正常仓鼠及羊瘙痒因子263K感染仓鼠终末期脑组织切片，抗原微波修复，滴加含3%H2O2的内源性过氧化物酶阻断剂，室温作用10 min，利用0.3%Triton-X 100处理20 min，封闭30 min；孵育CaM一抗（1∶50稀释），放置在湿盒中4℃过夜；次日，放于37℃温箱中复温30 min，随后依照超敏二步法免疫组化检测试剂盒的指示，在玻片上滴加试剂1，37℃孵育15 min，随后滴加试剂2，37℃孵育20 min；在载玻片上滴加DAB显色液，室温避光放置1～10 min，镜下观察到棕黄色颗粒时立即用自来水冲洗，PBS洗3次；苏木素复染1 min，滴加封片剂封片，显微镜观察，并用OLYMPUS DP Controller软件拍摄照片。

女警官摇摇头。何良诸觉得，自己问得有点下作，好像他是被押解的嫌疑犯。何良诸站起身，女警官主动与他握手。她的手真绵软，到底是女人。

2　结果与分析

2.1　羊瘙痒因子263K感染仓鼠终末期脑组织中CaM的表达水平显著上调

为了探究朊病毒感染中CaM的变化情况，我们利用western blot方法对羊瘙痒因子263K感染终末期仓鼠脑组织中的CaM进行检测，结果显示在3只263K感染仓鼠的脑匀浆中均可观察到17 kDa大小的CaM特异性条带，而在3只正常仓鼠中几乎检测不到（图1）。对CaM特异性条带进行灰度扫描的分析结果显示，与对照组相比，在263 K感染的仓鼠脑组织中CaM水平显著升高（P=0.000 1）。

将蛋白样品变性处理之后上样至12%SDSPAGE电泳，半干转移至NC膜，1 h封闭，一抗孵育4℃过夜，所用一抗种类及稀释度如下，CaM多抗（1∶100稀释）、CaMKII单抗（1∶500 稀释）、p-CaMKII（T286）多抗（1∶1 000稀释）、CaMKIV 多抗（1∶5 000稀释）、p-CaMKIV（T196+T200）多抗（1∶1 000 稀释）、CREB单抗（1∶5 000 稀释）、p-CREB（S133）单抗（1∶5 000 稀释）、脑源性神经营养因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）多抗（1∶5 000稀释）。二抗为 HRP 标记的羊抗鼠及羊抗兔IgG抗体（1∶5 000稀释）。增强型化学发光液（ECL）显色，使用Image J软件进行定量分析。

  

图1　羊瘙痒因子263K感染仓鼠脑组织中CaM含量增加Fig.1　Upregulation of CaM in the brain tissues of hamster infected by scrapie factor 263K

  

图2　免疫组织化学检测羊瘙痒因子263K感染终末期仓鼠脑组织中CaM的分布Fig.2　Distribution of CaM in the brain tissues of hamster infected by scrapie factor 263K at terminal stage using immunohistochemical stainings

2.2　仓鼠脑组织中CaM蛋白与神经元存在共定位，而与星形胶质细胞无共定位

上世纪七十年代，微电子、IT和通讯技术的发展，使电气自动化实现了质的飞跃，融入了信息、通信、系统工程及人工智能等成果。

为了分析朊病毒感染脑组织中CaM与各种神经细胞的相关性，我们利用CaM-GFAP和CaM-NeuN免疫荧光双染方法对羊瘙痒因子263K感染的仓鼠脑组织切片进行染色。图3A显示与正常仓鼠相比，在263K感染的仓鼠脑组织切片中可观察到更多的CaM特异性绿色荧光，该结果与之前结果相一致。在用CaM和NeuN双抗体染色的切片中，CaM在263K感染仓鼠和对照脑组织切片中与NeuN阳性细胞（红色）存在共同定位（图3A黄色荧光）。相反，CaM既不与正常仓鼠中的星形胶质细胞（GFAP阳性）共定位，也不与263K感染的仓鼠脑组织中增殖的星形胶质细胞共定位（GFAP阳性，图3B）。

用甲醇和四氢呋喃的混合溶液1∶1(V/V)配制浓度分别为0.004，0.021，0.034，0.052，0.170 mg/mL的辣椒二氢碱标品溶液，进行HPLC测定，以标品浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，得标准曲线(见图1中B)：辣椒二氢碱在0.0042～0.170 mg/mL范围内呈良好的线性关系，回归方程为y=3363.8x+4.2657，r2=0.9996。

  

图3　免疫荧光分析羊瘙痒因子263K感染仓鼠脑组织中CaM与神经细胞的相关性Fig.3　Correlations between CaM and nerve cells in brain tissues of hamster infected by scrapie factor 263K using immunofluorescent analysis

2.3　羊瘙痒因子263K感染终末期仓鼠脑组织中CaMKII和CaMKIV的变化特点

将正常仓鼠和羊瘙痒因子263K感染脑组织切片脱蜡至水，复合酶消化，随后抗原微波修复，封闭孵育一抗，放置在湿盒中4℃过夜；次日，放于37℃温箱中复温30 min，荧光二抗（1∶200稀释）染色，随后将细胞核染料DAPI滴加在组织切片上；防荧光猝灭封片剂封片，并用指甲油对四周进行密封。利用Operetta Enspire高内涵筛选系统进行图像观察。

本试验中肥料为尿素（河南心连心化肥有限公司，N-46%）、过磷酸钙（浙江中农化肥有限公司，P2O5-12%）、氯化钾（黑龙江倍丰农业生产资料集团有限公司，K2O-60%）、复合肥（史丹利化肥股份有限公司，15-15-15）；有机肥为菜籽饼：绍兴当地油菜籽榨油后的副产物，N：52.7 g·kg-1；P2O5：6.9 g·kg-1；K2O：6.1 g·kg-1。

自白居易翻旧曲为新歌后，乐府横笛曲《折杨柳》成了唐教坊曲《杨柳枝》。但是，无论如何翻新，作为表意实践的“杨柳”依旧存在。这种客观存在表明，重要的不是语言结构或程式，比如《杨柳》的词牌范式，而是言说主体在语言系统中的“翻新”。

 

  

图4　羊瘙痒因子263K感染仓鼠的脑组织中CaMKs和p-CaMKs呈下调趋势Fig.4　Downregulation of CaMKs and p-CaMKs in the brain tissues of hamster infected by scrapie factor 263K

2.4　羊瘙痒因子263K感染仓鼠终末期脑组织中CREB和BDNF表达水平的变化

  

图5　羊瘙痒因子263K感染仓鼠的脑组织中CaMKs的下游表达下调Fig.5　Downstream expression of CaMKs in brain tissues of hamster infected by scrapie factor 263K

为了探究CaM激酶对下游底物及靶蛋白表达的影响，我们利用Western blot方法对羊瘙痒因子263K感染终末期仓鼠脑组织中作为CaMKs底物的CREB和靶蛋白BDNF的表达量进行检测。结果显示，在263K感染仓鼠脑组织中的CREB的量增加，而代表活化形式的p-CREB（Ser 133）的表达量则显著降低（图5）。同时，羊瘙痒因子263K感染仓鼠脑组织中BDNF的表达水平显著低于正常对照，这与实验室之前的研究一致[12]。这些数据表明在朊病毒感染期间脑组织中CaMKs及其下游底物和靶蛋白的表达受到抑制。

3　讨论

CaM是一种重要到的Ca2+结合蛋白，普遍存在于真核细胞中。它主要通过与多种靶蛋白结合，使其自身磷酸化从而介导下游细胞信号的传导[7]。CaM在与Ca2+结合后其自身构象将发生变化，这将有利于其余下游的靶蛋白结合，所形成的Ca2+/CaM复合物在中枢神经系统的学习记忆形成扮演着重要的角色，同时也参与到细胞增生、有丝分裂、细胞凋亡等细胞生物学功能中[6]。因此在某些疾病当中，CaM的表达水平的改变，将会直接影响细胞内Ca2+的水平，从而影响下游的信号通路。在研究中，我们首先检测了朊病毒感染脑组织中CaM的表达变化情况，通过Western blot、免疫组织化学以及免疫组织荧光等实验方法，我们发现CaM的含量明显增加，提示该蛋白的下游激酶将会持续活化并引起后续生理病理改变。但是遗憾的是在羊瘙痒因子263K感染的仓鼠脑组织中，我们发现了与我们预期相反的趋势，即CaMKII与p-CaMKII均下调。尽管CaMKIV和p-CaMKIV在羊瘙痒因子263K感染的仓鼠脑组织中没有明显的减少，但是p-CaMKIV/CaMKIV的比率却在减少，这可以反映在朊病毒感染的仓鼠脑组织中p-CaMKIV降低的量远低于CaMKIV降低的量。CaMKII是兴奋性突触的主要突触后蛋白，这对突触可塑性和记忆的形成非常重要[13，14]。而CaMKIV在神经元细胞存活中起重要作用，一般CaMKIV的过表达能够减弱小脑颗粒神经元的凋亡[15]。CaMKII和CaMKIV会引导CREB的磷酸化，随后诱导大量的基因表达[16]。Bdnf是其中被调节的基因之一，编码BDNF蛋白。BDNF影响神经元发育中的许多过程，例如轴突和树突发育、突触形成和成熟以及神经元的存活。最近，研究小组发现在羊瘙痒因子感染的啮齿类动物模型脑组织中BDNF及其下游信号传导被严重阻碍[12]，结合研究推测，朊病毒感染脑组织中BDNF活性的严重丧失可能是由于CaMKs活性抑制所引起的。由于CaM含量升高，而整个CaM的下游激酶和底物呈现一种被抑制的状态，这不得不使我们怀疑存在某种原因影响了CaM的正常功能，从而使增加的CaM无法行使其正常的生理功能，这很可能与朊病毒感染有关。

4　结论

研究通过Western blot、免疫组织化学、免疫组织荧光等方法检测羊瘙痒因子263K感染仓鼠脑组织中CaM以及下游信号通路的表达变化情况，得到以下结论，即在羊瘙痒因子263K感染的仓鼠脑组织中，CaM的含量升高，但整个CaM的下游激酶和底物呈现一种被抑制的状态，提示由于朊病毒的感染致使增加的CaM无法发挥正常的生理功能。

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