随着对甾体化学研究的深入，科学家们发现甾体具有重要的生理活性和药用价值[1-3]，其中7-羟基甾体化合物占极重要的地位。去氢表雄酮（DHEA）的7-羟基衍生物[4]，对治疗阿尔茨海默病、癌症有一定的疗效，还具有增强机体免疫力、抗糖皮质激素和减肥的作用[5]。7-羟基妊娠烯醇酮具有抗皮质激素的效果，7-羟基-3β，17β-雄烯二醇具有免疫调剂和神经保护作用[6]，7α-羟基雄烯二酮可用来制备利尿剂并且已经应于工业生产[7]。

甾体环上引入含氮官能团或者引入N原子，使生成的甾体化合物有着独特的甚至超越母体化合物的生理活性。Javier P等[8]合成的一系列孕甾烷-6-肟基衍生物对肺腺癌细胞（A-549）、胰腺癌细胞（PSN1）、高加索瘤细胞（T98G）和结肠腺癌细胞（HCT-116）具有细胞毒性作用。施菊芳等[9]合成了多个甾体酮肟化合物并证实他们具有一定的抗着床能力。Krstic N M等[10]合成的两种构型的胆甾-4-烯-6-酮肟经体外研究证实对宫颈癌（HeLa）细胞和慢性骨髓白血病（K-562）都有较好的增殖抑制作用。

从土样中筛选分离得到一株转化甾体的菌株，经形态观察和序列分析，鉴定为沙门柏干酪青霉菌（Penicilliumcamemberti）。文献中对沙门柏干酪青霉菌报道相对较少。目前为止，尚未见有利用沙门柏干酪青霉菌对甾体肟行生物转化的文献报道，通过沙门柏干酪青霉菌对妊娠烯醇酮肟进行生物转化，为研究青霉菌转化甾体肟类化合物提供实验依据。

1　材料与方法

1.1　菌种与培养基

菌种：沙门柏干酪青霉菌（Penicilliumcamemberti），自筛，由科标技术（青岛）研发中心鉴定。

发酵培养液：水1 000 mL，蛋白胨12 g，葡萄糖30 g，磷酸二氢钾 1.3 g，酵母膏 1.0 g，用 1 mol·L-1的盐酸溶液调pH至4.5。

1.2　主要试剂和仪器

妊娠烯醇酮购自湖南正驰药业有限公司，熔点使用WC-1型显微熔点仪测定，IR谱使用BIO-RAD公司FTS-40型红外分光光度计测定，KBr压片，1H NMR、13C NMR使用瑞士Bruker DPX-400型超导核磁共振仪测定，EMI-MS用Bruker Esquire3000离子肼液相色谱电喷雾质谱仪测定。真菌DNA提取试剂盒购买于上海士锋生物科技有限公司，蛋白酶K购于杭州昊鑫生物科技股份有限公司，上游引物为NS1（5-GTA GTCATATGCTTGTCTC-3）：下游引物为NS8（5-TCCGCAGGTTCACCTACGGA-3），PCR 扩增仪 PTC-20（Bio-raid，美国）凝胶成像系统 EQ（Bioraid，美国）。

1.3　甾体肟合成

在100 mL的圆底烧瓶中加入妊娠烯醇酮2.0 g，盐酸羟胺1.8 g，95%乙醇36 mL，吡啶4.5 mL，于室温下搅拌反应2～3 h，反应完全后，向反应体系中加水50 mL，搅拌10 min，有白色固体析出，抽滤得到产物。

公路建设对整个城市化发展进程具有重要影响，另外还需要投入更多时间和精力持续不断提升道路建设规范、标准化。尤其近几年社会经济的迅速发展，城市交通建设规模也在不断扩大，人民群众对道路建设质量要求越来越高[1]。软土路基对公路建设具有重要影响，因此相关管理人员一定要重视软土路基的加固，提前预防质量问题。持续不断提升道路施工技术，只有这样才能够保证整个道路施工作业效率。

1.4　微生物转化及产物提取

在超净工作台中，接种沙门柏干酪青霉菌到已灭菌的装有120 mL发酵液的500 mL锥形瓶中。28℃，170 r·min-1条件下振荡培养40 h后，每瓶加入溶有甾体肟底物的95%乙醇2 mL，继续振荡培养4 d后终止发酵。过滤发酵液，用乙酸乙酯分别萃取发酵液和菌丝体各5次，合并有机层。50℃减压浓缩，旋至一定体积。依次用饱和NaHCO3溶液、饱和NaCl溶液洗3次后，再用蒸馏水洗1次，加无水Na2SO4干燥后，将有机层减压蒸干，得到转化产物粗品。利用硅胶柱层析法进行分离，分离后得到的化合物以红外、质谱和核磁分析鉴定结构。

1.5　18S rDNA PCR扩增及PCR产物检测

7α-羟基-孕甾烯醇酮肟（3）收率：30.5%；mp：219～221 ℃；IR（cm-1）：3475，3260，2944，2865，2850，1435，1425，1371，1047，1041；1H NMR δ（ppm）：3.30（m，H-3），5.41（s，H-6），0.54（s，H-18），0.89（s，H-19），1.74（s，H-21），10.27（s，H-（=N-OH））；13C NMR δ（ppm）：36.7（C-1），31.4（C-2），69.9（C-3），42.2（C-4），143.7（C-5），124.7（C-6），63.4（C-7），37.7（C-8），41.7（C-9），36.9（C-10），20.5（C-11），38.1（C-12），42.8（C-13），48.7（C-14），23.8（C-15），22.8（C-16），56.4（C-17），13.0（C-18），18.1（C-19），155.3（C-20），15.4（C-21）；MS（m/z）：370[M+Na]+，386[M+K]+。

18S rDNA PCR扩增：PCR反应体系总体积50 μL扩增全长序列，通用引物NS1（GTAGTCATATGCTTG TCTC），NS8（TCCGCAGGTTCACCTACGGA）各 1 μL，蛋白酶K25 μL，模板DNA 2 μL，无菌蒸馏水加至21 μL。反应条件：94 ℃预变性 5 min，94 ℃变性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸30 s，共30个循环，72℃总延伸5 min，4℃保存。

菌株形态观察结果表明，筛选菌株产孢结构为分生孢子头，分生孢子头形状为分支状帚状枝。分生孢子梗的顶端分枝2～3次，每枝的末端瓶梗状，可产生分生孢子。分生孢子球形、椭圆形，表面光滑。如图1所示。

18S rDNA序列测定及分析：扩增出的目的核酸片段由科标技术（青岛）研发中心纯化后进行正反向测序，将所测得的序列提交美国NCBI的GenBank核酸序列数据库进行同源性搜索。利用MEGA7软件构建系统发育树。

  

图1　沙门柏干酪青霉菌孢子形态（100×）Fig.1Morphological characteristics of strain Penicilliumcamemberti（100×）

2　结果

2.1　菌种鉴定

当前，在小学语文阅读教学的课堂上普遍存在教师充当主角，大部分时间被老师的提问、分析所占据，学生朗读、练习的机会比较少，影响了学生学习语文的兴趣和热情，使阅读教学实际效果颇有事倍功半的问题。课堂教学是实施素质教育的主渠道，教师要引导学生在创造性的活动中提高对语言文字的理解、积累、迁移、运用的水平，并在语言文字训练中提高创新意识和创新能力。为了让学生能运用正确的学习方法进行阅读，主动探索，提高阅读能力，在教学实践中，本文以新课标提出的“倡导自主、合作、探究的学习方式”为指导，大胆开展课堂教学改革，巧用“读、说、演、写”的探究式的教学模式优化课堂教学，提高阅读教学的有效性，以提高学生的人文素养。

2.1.2　18S rDNA序列测定及系统发育分析

采用K-B纸片扩散法测定了鲁氏酵母菌对7种抗生素的抗药性情况，测定结果见表1。菌株对抗生素产生的抑菌圈直径均在质控范围内，因此，试验测得的数据为真实结果。

PCR产物检测：取2 μL PCR产物和6 μL 1.4X溴酚蓝混合后点入0.8%的鉴定胶中，同时分别点入1 μL 以及 2 μL DL2 000 marker。300 V 电泳 15 min后观察条带亮度。

以妊娠烯醇酮为底物合成妊娠烯醇酮肟，如图4所示。

(2)假设有i个电梯(i=1,2,3...)，其中第i个电梯不动时停在第ji层(j=1,2,3...)；

2.1.1　菌株形态特征的观察

青霉菌的18S rDNA扩增产物大小在1 600 bp左右，0.8%琼脂糖凝胶电泳结果见图2。由图可知18S rDNA PCR扩增成功。

将筛选菌株的18S rDNA PCR扩增序列在Gen－Bank中进行BLAST，发现与6个青霉菌属的模式菌株的同源性最高，下载这些菌株的DNA序列，并利用MEGA7软件构建系统发育树，如图3所示，筛选菌株与青霉菌（Penicillium）属的沙门柏干酪青霉菌位于同一分支，同源性为99%。因此，综合以上显微特征和18S rDNA PCR序列的分析，确定该菌株为沙门柏干酪青霉菌（P.camemberti），与科标技术（青岛）研发中心鉴定结果一致。

  

图2　菌株青霉菌18S rDNA PCR产物电泳图Fig.2　18S rDNA PCR products of strain Penicilliumcamemberti

  

图3　沙门柏干酪青霉菌系统发育树Fig.3　Phylogenetic tree of Penicilliumcamemberti

2.2　甾体肟合成

在多方共赢的工学结合培养模式下，本专业教学水平全方面提升，教师专业技能得到锻炼，近年来连续获得省级技能竞赛二等奖，行业竞赛一等奖等教学成果；课程内容进一步完善，不断产生教学改革、课程改革等项目；学生就业率与对口率逐渐提高。学院在合作过程中大量减少校外实习基地建设精力与经费，同时节约教师专业技能培训开支。通过技术工作室外包服务孵化学生创业，产生校园创业项目，与企业合作范围不断扩大过程中提高学院在行业中的知名度，提高相关专业就业情况。

  

图4　孕烯醇酮肟的合成Fig.4　Synthesis of pregnenoloneoxime

孕甾烯醇酮肟（2）：收率 96%；mp：221～223 ℃；IR（cm-1）：3470，3260，2934，2860，2855，1662，1440，1420，1370，1050；1H NMR（DMSO-d6）δ（ppm）：3.10（m，H-3），5.26（s，H-6），0.56（s，H-18），0.94（s，H-19），1.73（s，H-21），10.33（s，H-（=N-OH））。13C NMR δ（ppm）：37.6（C-1），38.3（C-2），70.4（C-3），42.6（C-4），141.5（C-5），119.6（C-6），31.4（C-7），37.5（C-8），49.9（C-9），38.0（C-10），20.6（C-11），36.4（C-12），42.9（C-13），55.5（C-14），23.3（C-15），240.5（C-16），56.7（C-17），15.1（C-18），19.6（C-19），155.3（C-20），13.2（C-20）。354[M+Na]+，370[M+K]+。

妊娠烯醇酮肟合成过程中，缚酸剂对反应速度影响较大。通常以 NaHCO3、Na2CO3、NaAc、吡啶作缚酸剂，结果发现吡啶作缚酸剂，反应时间短，效果好，后处理简单，反应终止后只需在反应液中加入一定量的水，搅拌10 min，抽滤即可得到纯物质。

2.3　转化产物的分离纯化与结构鉴定

转化产物先采用石油醚：乙酸乙酯=1∶1洗脱分离，用丙酮结晶纯化后，得到产3，收率30.5%。进一步用石油醚：乙酸乙酯=1∶2为淋洗剂洗脱，分离得到产物用丙酮结晶纯化后得到产物4和产物5，收率分别为19.5%和16.3%。甾体生物转化路线如图5所示。化合物的结构鉴定数据如下：

  

图5　沙门柏干酪青霉菌对妊娠烯醇酮肟的生物转化Fig.5　Biotransformation of pregnenoloneoxime by Penicilliumcamemberti

真菌DNA抽提采用真菌DNA基因组提取试剂盒，按照操作步骤进行，最后将抽提的DNA于-20℃保存备用。

7α，11α-二羟基-孕甾烯醇酮（4）收率：19.3%；mp：274～275℃；IR（cm-1）：3408，3241，3123，1798，1770，1635，1431，1368，1230，1184，1050；1H NMR δ（ppm）：3.29（m，H-3），5.43（s，H-6），0.51（s，H-18），1.01（s，H-19），2.07 （s，H-21），10.56 （s，H-（=N-OH））；13C NMR δ（ppm）：38.3（C-1），31.6（C-2），70.1（C-3），42.8（C-4），144.5（C-5），124.2（C-6），63.4（C-7），37.0（C-8），47.8（C-9），38.4（C-10），67.1（C-11），49.0（C-12），43.5（C-13），49.4（C-14），23.6（C-15），22.6（C-16），62.7（C-17），13.9（C-18），17.6（C-19），208.5（C-20），31.2（C-21）；MS m/z 371[M+Na]+，387[M+K]+。

6α-羟基-20-肟-孕甾-4-烯-3酮（5）收率：16.5%；mp：234～237℃；IR （cm-1）：3416，3250，3123，1798，1770，1635，1431，1368，1230，1184，1050;1H NMR δ（ppm）：2.69（m，H-4，2.58（s，H-6），3.75（s，H-7），0.56（s，H-18），1.07（s，H-19），1.74（s，H-21），10.09（s，H-（=N-OH））；13C NMR δ（ppm）：35.3（C-1），33.5（C-2），197.9（C-3），122.8（C-4），171.2（C-5），1.4（C-6），38.3（C-7），39.5（C-8），53.6（C-9），35.1（C-10），20.4（C-11），33.5（C-12），43.5（C-13），53.6（C-14），31.9（C-15），32.0（C-16），61.4（C-17），15.0（C-18），17.0（C-19），154.5（C-20），14.2（C-21）；MS m/z 368[M+Na]+，384[M+K]+。

2.4　讨论

利用沙门柏干酪青霉菌对3-羟基孕甾-5-烯-20-肟进行生物转化研究。研究结果表明，底物主要发生7α-羟基化、11α-羟基化反应，C-3位羟基氧化为羰基，同时伴有C5-6位双键移位C4-5双键。

由以上分析可知，面向广义能耗的柔性作业车间调度过程中子批量的加工批量Bji、工件各个子批量选择的工艺路线yjil、工序选择的机床xjilsm、工序在机床上选择的刀具工序在机床上选择的夹具子批量选择的搬运设备Hjilsmq以及工序在机床上的加工顺序个变量会显著影响调度过程中的车间广义能耗和完工时间，因此将这7个变量作为本文模型的优化变量。

刘炜、周德明（2015）在《从被颠覆到颠覆者：未来十年图书馆技术应用趋势前瞻》一文中提出，图书馆作为人类个体的体外大脑，克服人类个体生命的限制，延续每一代人获得的知识和经验，实现着其远大的理想：“All information for all people at all time”；它是一定社会职能的制度设计，与其中的知识内容有关，而与这些知识的载体无关［1］。不论是古代的藏书楼、近代的以纸本文献为代表的实体图书馆，还是近年来蓬勃发展的数字图书馆，都是图书馆这种制度设计在不同阶段的某种表现形式，即一种收集、保藏、运用知识的制度设计。

孕甾烯醇酮肟（2）的生物转化主要发生7α-羟基化，并伴有6α-，11α-羟基化和C-20肟的水解反应。薄层层析结果显示：底物在转化5 h时就生成7α-羟基-孕甾烯醇酮肟（3）和6α羟基-20-肟-孕甾-4-烯-3酮（5）。转化至8 h发生发生二次羟基化生成7α，11α-二羟基-孕甾烯醇酮，C-20 肟的水解反应生成 7α，11α-二羟基-孕甾烯醇酮（4），三个转化产物的产率关系为 7α-羟基-孕甾烯醇酮肟（3）＞7α，11α-二羟基-孕甾烯醇酮（4）＞6α羟基-20-肟-孕甾-4-烯-3酮（5）；发酵到第 2 d 7α-羟基-孕甾烯醇酮肟（3）的产量达到最多，随发酵时间的延长产量逐渐减少。7α，11α-二羟基-孕甾烯醇酮（4）和 6α 羟基-20-肟-孕甾-4-烯-3酮（5）的产率随发酵时间的延长逐渐提高，第3 d和第4 d产量变化不明显。在整个发酵过程中底物的量随发酵时间的延长逐渐减少。

一顿酒喝得有情有调，一桌人聊得有声有色。伍亦苒陪在王树林一侧，更是殷勤有加。王树林不免多喝了几杯，趁着酒酣耳热之际在伍亦苒的耳边大大地溢美了一番。伍亦苒照单全收，颦笑间彰显出一个单身少妇催魂摄魄的无尽魅力来。

从生物转化产物可以推测孕甾烯醇酮肟（2）在沙门柏干酪青霉菌的作用下首先发生了7α-羟基化反应得到 7α-羟基-孕甾烯醇酮肟（3），然后在 11α-甾体羟化酶的作用下发生了11α羟基化得到了化合物7α，11α-二羟基-孕甾烯醇酮肟，在水解酶的作用下7α，11α-二羟基-孕甾烯醇酮肟发生了C-20位肟基的水解反应得到了7α，11α-二羟基-孕甾烯醇酮（4）。羟基化产物说明，沙门柏干酪青霉菌对妊娠烯醇酮肟甾体具有引入7α-羟基的立体选择性。产物中有6-羟基、7-羟基和11-羟基甾体肟衍生物，在同一转化培养体系中沙门柏干酪青霉菌产生了羟基化酶和还原酶，说明P450酶系中酶的多样性。

3　结论

从土壤中筛选得到一株能转化甾体肟的菌株，经形态鉴定及18S rDNA序列分析，鉴定为沙门柏干酪青霉菌，利用沙门柏干酪青霉菌对合成的妊娠烯醇酮肟生物转化，获得转化产物7α-羟基-孕甾烯醇酮肟（3），7α，11α-二羟基-孕甾烯醇酮（4）和 6α-羟基-20-肟-孕甾-4-烯-3酮（5），表现出沙门柏干酪青霉菌特异羟基化活性。研究结果为甾体肟衍生物的发展奠定了基础，进一步研究了沙门柏干酪青霉菌的功能。

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