早在1996年，枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）就被我国农业部正式批准为工厂化生产的微生态制剂，可直接饲喂动物，枯草芽孢杆菌为革兰氏阳性菌，无致病性、无残留、无耐药性，可提高动物生产性能，产生了巨大的经济效益[1-3]。近年来，在养殖业中的应用十分广泛，但多作为禽类、猪、牛饲料中添加剂。有研究表明，在仔猪饲料中添加枯草芽孢杆菌能够降低饲料系数和促进仔猪生长；在奶牛饲料中添加草芽孢杆菌能够增加奶牛产奶量[4]。猪流行性腹泻病毒（PEDV）主要引起猪流行性腹泻，主要症状为仔猪呕吐、严重腹泻和脱水，死亡率较高，给世界各国带来巨大的经济损失，尤其以我国感染最为严重，其中因PEDV导致腹泻死亡的仔猪占仔猪死亡总数的38.9%。近年来，猪流行性腹泻的流行区域和强度有扩大、增强的趋势。2011年到2012多篇文章显示我国有29个省、直辖市流行PEDV，各个地区病料阳性率最高达86.49%，猪场的阳性率最高可达到100%[5-8]。因此，研究以实验室前期构建的pLA-PEDV-S1为转化子，构建了表达PEDV-S1基因的重组枯草芽孢杆菌，为动物免疫保护试验奠定了基础。期望所构建的重组PEDV S1枯草芽孢杆菌可以作为口服疫苗预防日趋严重的PEDV感染。

通过图5、图6可以看出，新型扩孔钻头在钻头稳定性上有较大的改进：导向钻井模式下钻头的平均横向不平衡力系数(定义为瞬时时刻钻头横向力与轴向力比值)为0.085 6，如图5所示；复合钻井模式下钻头的平均横向不平衡力系数为0.093 1，如图6所示。常规扩孔钻头的平均横向不平衡力系数大于0.2[2，6-7] ，该系数的降低说明新型扩孔钻头的钻进稳定性增强，且钻头领眼段切削齿的偏磨现象将大大减少，钻头使用寿命得到较大幅度的提高；同时，钻头横向不平衡力系数的降低还有助于提高扩孔井壁质量。

1　材料与方法

1.1　菌株和质粒

枯草芽孢杆菌由大连三仪有限公司所赠，实验所需的pLA-PEDV-S1由黑龙江八一农垦大学遗传学实验室构建并保存。

1.2　培养基

1.2.1　枯草芽孢杆菌培养基[9]

枯草芽孢杆菌普通培养基是由葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、磷酸二氢钾4种原料构成，500 mL枯草芽孢杆菌培养基中含有胰蛋白胨10 g，酵母粉2.5 g，葡萄糖2.5 g，磷酸氢二钾2.5 g。

1.2.2　枯草芽孢杆菌感受态制备培养基

内部控制、信任与商业信用融资..................................................................................................................刘 进 郑 琰 周方召（63）

生长培养基：含有0.5 M山梨醇的LB培养基。复苏培养基：含有0.5 M山梨醇和0.38 M甘露醇的LB培养基。电转液：0.5 M山梨醇、0.5 M甘露醇和10%的甘油。电转液为无菌超纯水配置。

1.6.3　重组菌的间接免疫荧光检测

1.3　药敏试验

取表达36 h的重组菌与空菌各0.5 mL，300目筛子过滤后，离心去上清，分别用PBS洗涤菌体三次，采用间接免疫荧光技术对菌体进行检测。

1.4　转化用质粒的鉴定

在60 μL的感受态细胞中加入50 ng·μL-1的质粒1 μL，用移液器混匀后转移至预冷干燥的电击杯中，将电击杯放入冰上冰浴1 min；擦干电击杯表面，放入电转仪中，2 200 V电击5 ms；立即向电击杯中加入1 mL的复苏培养基，吹吸混匀后转移到无菌离心管中，37 ℃孵育 3 h；3 800 r·min-1离心 5 min，留取100 μL上清重悬沉淀，均匀涂布在含有氯霉素的枯草芽孢杆菌固体培养基上，37℃过夜培养。

1.5　重组枯草芽孢杆菌表达载体的构建

培养重组枯草芽孢杆菌，离心后弃上清，加入DMSO溶解细胞壁；加入400 μL含有3%SDS和0.2 N NaOH的溶液，温和颠倒混匀后，静置7 min；加入300 μL预冷的3 M醋酸钠后颠倒混匀，4℃，12 000 r·min-1离心 15 min；吸取 750 μL 上清液，与等体积的异丙醇混匀后离心15 min；弃上清，加入350 μL的灭菌dd H2O重悬沉淀后，加入200 μL苯酚：氯仿：异戊醇（25∶24∶1）萃取，离心 2 min；取上层水相至新的无菌1.5 mL eppendorf管，加入1 mL预冷的无水乙醇，混匀后离心15 min；弃上清，加入75%的乙醇，重悬后离心5 min；弃上清，干燥后加入30 μL含有Rnase的dd H2O，溶解20 min，-20℃保存备用。

取过夜培养的枯草芽孢杆菌，稀释16倍接种于生长培养基中，37℃震荡培养至OD600为0.85～0.95；收集菌体，冰浴10 min，放入提前预冷的4℃离心机中，5 000×g·min-1离心 5 min，弃上清，留沉淀；用冰浴的电转液洗涤沉淀4次；用菌体体积1/40的电转液重悬菌体，分装，备用。

1.5.2　pLA-PEDV-S1质粒电转至枯草芽孢杆菌

采用碱裂解法从大肠杆菌中提取重组质粒DNA，测定质粒浓度为 538.5 ng·μL-1，并进行 BamHⅠ/SalⅠ双酶切和PCR鉴定。PCR根据GenBankTM上发表的PEDV S1基因序列，设计1对特异性引物，两条引物5’端分别加入BamHⅠ和SalⅠ酶切位点（下划线 部 分）。 上 游 引 物 ：5’-CGCGGATCCGATGTCACCAGGTGCTCAG-3’，下游引物：CGCGTCGACTTAAGTGG AGTTGTAAGTATC-3’由上海生物工程技术服务有限公司合成。反应条件为94℃预变性5 min，94 ℃变性 30 s，72 ℃延伸 1 min，35个循环，72℃延伸10 min。

1.6　重组菌的鉴定

1.6.1　重组菌的PCR鉴定

1.5.1　枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备

以提取的质粒DNA为模板，设空白和空菌两个阴性对照，进行PCR反应。然后1%琼脂糖凝胶电泳检测结果。

以黑龙江省齐齐哈尔市昂昂溪区滕家岗遗址为核心文化区的昂昂溪文化，是我国北方原始石器文化乃至于东北亚原始石器文化的重要组成部分和杰出代表。该地域特殊的地理气候和自然资源，为原始先民提供了丰富而又特殊的生活条件，逐渐形成了以渔猎为主的原始文明形态。在优质石材的物质基础之下，打制、压制等多种加工方法并行，逐渐形成了丰富而又经典的细石器文化。昂昂溪文化的细石器总体数量大、种类繁、分布广、形制全、用途多，并且临近各部落发展的相对平衡。仅齐市昂昂溪区一地就有至少39处遗址，其在当时的文化辐射和发展影响巨大，辐射至周边乃至拓展到整个黑龙江流域。

1.6.2　重组菌的表达鉴定

将鉴定正确的重组菌按照1∶100的比例接种于100 mL含34 mg·mL-1氯霉素的枯草芽孢杆菌液体培养基中。37℃，170 r·min-1振荡培养36 h，用含有10 mg·mL-1的 Tris37 ℃处理 50 min，12 000 r·min-1离心2 min，收集菌体沉淀，加入上样缓冲液，进行SDS-PAGE电泳。电泳结束后，将蛋白胶转印至PVDF膜上，转印膜经含有5%脱脂奶粉的PBST缓冲液封闭，以猪源多抗PEDV血清为一抗，羊抗猪IgG-HRP 为二抗（1∶500），DAB 显色后扫描。

威尼托主要的红葡萄品种有科维纳、罗蒂妮拉（Rondinella）和莫琳娜（Molinara）以及梅洛。用于酿造阿玛洛尼的主要葡萄品种就是科维纳。阿玛罗尼红葡萄酒是五大意大利著名葡萄酒“ABBBC”中的一员，也是威尼托产区最负盛名的葡萄酒。此酒虽然是干型，但常常尝起来有甜味，口感非常浓郁，酸度偏高，酒精度也较高，还带有黑樱桃、红糖和巧克力等香味，陈年潜力很高，很受重口味的酒客所偏爱。阿玛罗尼葡萄酒的酿造过程比普通葡萄酒复杂得多，它是用风干的葡萄酿造出来的干红葡萄酒。酿造一瓶阿玛罗尼葡萄酒所需要的葡萄是普通葡萄酒的两倍多，所以价格并不低。

由于试验所用质粒是氯霉素抗性，因此使用药敏片对实验用枯草芽孢杆菌进行常用抗生素的药敏检测该菌株能否作为试验用宿主菌。在不含抗生素的枯草芽孢杆菌固体培养基上均匀涂布适量液体枯草芽孢杆菌，在培养皿正中间放置药敏片。37℃倒置培养过夜。

2　结果

2.1　受体菌的抗药性结果

使用氯霉素、红霉素、链霉素、万古霉素8种药敏片，对试验用枯草芽孢杆菌进行药敏实验，参照纸片法抗菌药物敏感试验标准进行抑菌圈的测量，发现枯草芽孢杆菌对氯霉素、万古霉素、红霉素和青霉素等7种抗生素敏感；对氨苄青霉素具有耐药性（表1）。可以作为受体菌使用。

敦礼脑子里浮现出故乡那片草籽花。春天的太阳总是那样善解人意，既不像夏天那样毒辣，也不像冬天那般冷漠，它温和地照耀着大地，照着那片草籽花以及叉着双腿坐在田埂上的敦礼，微风徐徐，草籽花纤细的茎秆顶着紫红的花环乱颤，一直颤到敦礼的心尖上。

[1][28][42]《马克思恩格斯文集》(第4卷)，北京：人民出版社，2009年，第266、279、278页。

 

表1　枯草芽孢杆菌对8种抗菌药物的敏感性检测Table 1　The drug susceptibility tests

  

抗菌药物红霉素万古霉素链霉素青霉素氯霉素卡那霉素强力霉素氨苄青霉素纸片含量/ug·片-115 30 10 10 30 30 30 10抑菌圈直径/mm 26 18 21 25 26.3 21 32.6 10.33敏感性敏感敏感敏感敏感敏感敏感敏感耐药

2.2　转化用质粒的鉴定

提取的质粒DNA pLA-PEDV-S1经过BamHⅠ和SalⅠ双酶切，出现两条大小约为6 346 bp和1 086 bp的条带，与预期结果一致（图1-A）。同时以提取的质粒DNA为模板进行PCR，得到一条大小约为1 086 bp的S1目的条带（图1-B）。

  

图1　质粒pLA-PEDV-S1的酶切和PCR鉴定Fig.1　PCR product and pLA-PEDV-S1 double enzyme cutting

2.3　重组菌的鉴定

从重组枯草芽孢杆菌中提取质粒DNA pLAPEDV-S1，以质粒DNA为模板，进行PCR扩增，结果显示，扩增产物大小约为1 086 bp，与预期结果相符（图 2）。

2.4　重组枯草芽孢杆菌的表达产物鉴定

采用猪源多抗PEDV血清进行Western blot检测，结果显示pLA-PEDV-S1/Bacillus subtilis泳道有大小约为81 Ku蛋白条带，与预期结果相符，对照泳道未见条带（图3）。结果表明，pLA-PEDV-S1/B.Subtilis表达的S1蛋白可以被PEDV抗血清识别。

  

图2　pLA-PEDV-S1/B.Subtilis的PCR鉴定结果Fig.2　Identification of pLA-PEDV-S1/B.subtilisby PCR

2.5　重组菌的间接免疫荧光检测结果

空菌作对照与pLA-PEDV-S1/B.Subtilis重组菌同时进行间接免疫荧光实验，在荧光显微镜下观察，结果荧光视野下空菌未见到绿色荧光（图4B），明视野下可见清晰的细菌形态（图4A），荧光视野下的重组pLA-PEDV-S1/B.Subtilis可见清晰的绿色荧光（图4D），明视野下可见到荧光视野下相同的细菌形态（图4C），由此表明重组菌表达PEDV-S1片段。

  

图3　重组菌的anti-PEDV Western blot检测结果Fig.3　Western blot analysis of the recombinant protein using anti-PEDV antibody

  

图4　重组菌的间接免疫荧光结果Fig.4　Indirect immunofluorescence results of recombinant Bacillus subtilis

3　讨论

PEDV基因组包括6个ORF，其中S蛋白是发展有效抵抗冠状病毒的主要靶抗原，在病毒感染宿主集体后介导中和抗体产生的过程中发挥重要生物学作用，如识别靶细胞、促进病毒和细胞融合。S蛋白没有蛋白水解酶位点，不能被裂解而被人为地划分为抗原区S1和膜融合区S2区，其中S1区介导病毒颗粒黏附到细胞表面受体上，S1蛋白含有多个抗原中和表位，能够引起宿主体液免疫诱导产生中和抗体，是开发PEDV有效疫苗的主要靶点。

枯草芽孢杆菌对人畜无毒无害、不污染环境、能够产生多种抗菌素和酶类。枯草芽孢杆菌的芽孢是一种休眠体，能够抵御外界恶劣的环境，其中对温度耐受力强，在120℃条件下可存活5 min，因此，在制粒过程中对枯草芽孢杆菌生物活性的影响较小。有研究表明枯草芽孢杆菌活菌制剂具有治疗和预防仔猪细菌性肠道疾病的作用，并且试验观察期间没有发现不良反应[10]，是微生态制剂和饲料添加剂的理想益生菌，在畜牧生产中得到广泛应用。2005年开始，国内外将枯草芽孢杆菌作为基因工程黏膜疫苗载体，预防病原微生物的感染[11]。有学者采用B.subtilis芽孢表达了炭疽抗原、肠道病毒71型的结构蛋白VP1，刺激小鼠产生了保护性免疫应答[12-13]，Hellen等表达了破伤风毒素C以舌下和滴鼻两种途径免疫仔猪，产生了相应的黏膜抗体[14]。口蹄疫病毒表位嵌合蛋白在枯草芽胞杆菌中的也实现了分泌表达[15]。

目前已有使用食品级的安全菌株干酪乳杆菌作为宿主菌表达PEDV S1蛋白[16]，但由于乳酸菌的生物学特性不利于相关产品的生产、保存和运输，因此，试验以绿色安全的枯草芽孢杆菌作为宿主菌构建了pLA-PEDV-S1/B.subtilis，展示表达了S1抗原。

运行管理维护工作是保障山洪灾害监测预警系统正常运行的关键。为保障系统可靠、高效、持续、安全运行，要尽快出台有关政策措施，明确运行管理责任单位和系统维护的经费、技术、人员、物资保障渠道，建立健全各项管理制度。

4　结论

通过电转化的方法将质粒pLA-PEDV-S1转化至枯草芽孢杆菌中，成功构建重组枯草芽孢杆菌，经Western blot分析S1蛋白能够在枯草芽孢杆菌中进行表达，为后续的试验动物免疫奠定了基础。

中国特色社会主义“四个自信”来自于中国共产党对近代以来不同历史主体探索中国前途历程的省思，也来自于中国共产党自身不断发展壮大并带领全国人民革命、建设和改革所获取的成败经验的总结，特别是形成于改革开放以来建设中国特色社会主义伟大事业中所取得的巨大成就。自中国共产党成立后的90多年历程中，中国共产党人始终坚持将马克思主义基本原理与中国实际相结合，在团结和带领全国各族人民完成和推进新民主主义革命、社会主义革命和改革开放事业的过程中，逐步形成了具有鲜明中国特色的社会主义道路、理论体系、制度和文化，从根本上改变了中国人民和中华民族的前途命运，使中华民族伟大复兴展现出前所未有的光明前景。

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