华支睾吸虫是目前我国最严重的食源性人兽共患寄生虫之一。成虫主要寄生于犬、猫和人的肝胆管，能够引起华支睾吸虫病。华支睾吸虫病主要症状表现为胆囊炎、胆管炎、胆管肝炎以及肝硬化等，严重时可并发人的胆管上皮癌[1]，少数感染者还可导致侏儒症[2]，严重影响人和动物的健康。东方次睾吸虫主要寄生于禽类的胆囊和胆管内，能够引起胆囊肿大、胆管壁和胆囊增厚变硬等病理变化，临床表现为食欲减退、腹泻和贫血等症状，严重时会导致死亡，对畜牧业经济造成较大的损失。据报道，东方次睾吸虫病也是一种人畜共患的寄生虫疾病。

核糖体18S是真核生物的染色体上编码核糖体小亚基RNA的基因，在核糖体中进化速率最慢，具有高度保守性，目前，18S已经被用于吸虫的系统发生学研究，且通常认为其比较适用于高级阶元的进化分析研究[3-5]。因此，研究拟扩增华支睾吸虫和东方次睾吸虫的核糖体18S序列并进行序列分析，在分子水平上探讨两种后睾科吸虫的进化和分类地位。

1　材料与方法

1.1　虫体采集

华支睾吸虫成虫采自自然感染犬的肝胆管和胆囊，东方次睾吸虫成虫采集自人工感染的雏鸭胆囊，虫体经生理盐水反复冲洗后，显微镜下进行形态学鉴定，于70%的酒精中保存。

1.2　试剂

TianGen DNA提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司，Ex Taq DNA聚合酶、dNTPs、pMD18-T载体、DL2000 DNA marker均购自宝生物（大连）有限公司，DH5α感受态细胞购自普洛麦格（北京）生物技术有限公司，AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒购自爱思进生物技术（杭州）有限公司。

1.3　引物设计

在GenBank数据库中下载相关吸虫18S序列，进行同源性分析，使用生物学软件Oligo 6.0在序列的保守区域设计引物。引物序列为18S-U：5’-GGC TCA TTA AAT CAG CTA TGG TT-3’和 18S-L：5’-ACG ACT TTT ACT TCC TCT AAA T-3’，将序列送至上海生工生物工程有限公司合成。

1.4　DNA的提取

将酒精保存的两种后睾科吸虫各选取5条，分别置于1.5 mL离心管中，并用蒸馏水反复冲洗3～5遍，最后一遍将蒸馏水吸出弃掉，按照DNA提取试剂盒分别提取两种虫体的DNA，于-20℃保存。

1.5　目的基因的扩增与克隆

最后，课程考核纳入参赛人员选拔体系。能够代表班级或学院参与各级技能竞赛，对很多同学来说，既是对自己学习的认可、也是个人成就的体现，并能满足自身获得尊重的需要，因此，对大多数学生而言，能够参加技能竞赛具有较大的吸引力。

分别以华支睾吸虫和东方次睾吸虫DNA为模板，扩增出的核糖体18S序列，产物经1%琼脂糖凝胶电泳检验，10个样本的条带均出现在约2 000 bp的位置，与预期大小相符。

1.6　序列分析

七师党政机关、社会事业、群众居民都通过电视、网络、手机、收音机等传媒工具收听收看了庆祝改革开放四十周年大会实况。大家认真聆听，深刻领会，体现了社会各界对改革开放这个划时代重大事件的热切关注和强烈认同。□

使用引物18S-U/18S-L扩增两种后睾科吸虫的18S序列。PCR扩增体系为：94℃ 5 min；94℃1 min，58℃ 1 min，72℃ 1 min 30 s，共35个循环；72℃5 min，将PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，将目的条带切下，按胶回收试剂盒说明书对PCR产物进行回收，使用pMD18-T载体将回收的目的片段连接，并转化到DH5α感受态细胞上，选取阳性菌落进行菌液PCR鉴定，将鉴定为阳性的样品送至上海生工生物工程有限公司进行测序。

 

表1　进化分析中吸虫的相关信息Table 1　The information of trematodes in phylogenetic analysis

  

目科后睾科后睾目异形科岐腔科斜睾目　并殖科棘口科棘口目片形科枭形目　分体科种名华支睾吸虫（Clonorchis sinensis）东方次睾吸虫（Metorchis orientalis）麝猫后睾科吸虫（Opisthorchis viverrini）横川后殖吸虫（Metagonimus yokogawai）宫田后殖吸虫（Metagonimus miyatai）高桥后殖吸虫（Metagonimus takahashii）枝双腔吸虫（Dicrocoelium dendriticum）怡乐村并殖吸虫（Paragonimus iloktsuenensis）克氏并殖吸虫（Paragonimus kellicotti）卫氏并殖吸虫（Paragonimus westermani）卡普罗尼棘口吸虫（Echinostoma caproni）卷棘口吸虫（Echinostoma revolutum）大片吸虫（Fasciola gigantica）肝片吸虫（Fasciola hepatica）大拟片吸虫（Fascioloides magna）布氏姜片吸虫（Fasciolopsis buski）土耳其斯坦裂体吸虫（Schistosoma turkestanicum）序列号JF314770 JF314771 JF823987 HQ832632 HQ832626 HQ832629 Y11236 AY222141 HQ900670 AJ287556 L06567 AY222132 AJ011942 AJ004969 EF534989 L06668 AF442499长度（bp）1 902 1 901 1 889 1 867 1 867 1 867 1 950 1 860 1 870 1 902 1 977 1 871 1 945 1 941 1 934 1 978 1 909

2　结果

2.1　PCR扩增结果

低温等离子切除是新近微创治疗方式，利用双极射频能量完成电解液的等离子体波增转变，使等薄层带电粒子加速，向组织传递能量，解除篱笆组织分子键，使相应细胞阶梯以分子单位呈现，之后以碳水化合物和氧化物形态存在，促使坏死组织细胞脱落，促生瘢痕，有切割和止血效果。其温度较低，仅40 ℃～70 ℃，对周围组织热损伤小，被临床医疗者接纳和推崇[10]。一些研究者发现该技术用于早期声门喉癌中能提高治疗安全性[11-12]。本研究予以研究，为今后该技术的推广和改进，以及早期喉癌疗效提高提供参考。

2.2　序列分析

对两种虫体18S序列分析发现，虫体内存在特殊结构，既有正向重复，又有反向重复。东方次睾吸虫和华支睾吸虫分别存在3个和2个类型的重复序列（表2）；东方次睾吸虫种内有2个变异位点，均为AG、CT的转换；华支睾吸虫有4个变异位点，其中AG、CT的转换有3个，AT、GC的颠换有1个。

将测序结果进行拼接整理，使用DNAStar 5.0软件，分析两种后睾科吸虫的种内差异和种间差异，并使用MEGA 5.0和Megalign软件对两种后睾科吸虫特殊结构进行分析；使用Clustal X 1.83软件，与相关吸虫的18S进行比对（虫体见表1）。以土耳其斯坦裂体吸虫（Schistosoma turkestanicum）为外群，采用最大简约法（MP）法构建进化树，分析两种后睾科吸虫的亲缘关系。

经过对测序结果的拼接与整理，获得5条华支睾吸虫18S长度均为1 991 bp，5条东方次睾吸虫18S长度均为1 998 bp，两种后睾科吸虫的18S长度均无变化。华支睾吸虫A+T含量为48.60%～48.70%，5条虫体种内差异0.1%～0.3%，与网上发表的相同虫体比较，差异为0.1%～0.2%；东方次睾吸虫A+T含量为48.95%～49.05%，5条虫体间种内差异0～0.1%，与网上发表虫体比较为0.2%。将10个样本与表1中吸虫进行比对，种间差异为0.2%～11.9%。

 

表2　两种虫体核糖体18S的特殊结构Table 2　The special structure of 18 S of two flukes

  

虫体名称东方次睾吸虫华支睾吸虫正向重复反向重复1反向重复2正向重复反向重复序列GACTTCGGTT TTGATCCTGCCA ATGCTGAAAA GACTTCGGTT TTGATCCTGCCA位置240～249；941～950 15～26；1129～1140 1912～1921；1952～1961 233～242；934～943 8～19；1122～1133含有重复序列的虫体所有虫体1，2 1，2所有虫体所有虫体

  

图1　基于核糖体18S序列构建的进化树Fig.1　Phylogenetic relationships of the trematodes reconstructed by MP methods based on the 18S sequences

2.3　进化分析

采用MP法，以土耳其斯坦裂体吸虫作为外群，基于核糖体18S构建进化树（图1），结果显示，进化树分为两个大的分支，棘口目的吸虫形成一个分支，后睾目吸虫和斜睾目吸虫形成另一分支。在后睾目的分支中，后睾科和异形科各形成一单分支，所有的华支睾吸虫聚集在一起，但东方次睾吸虫却没有形成一个独立分支，而是研究中的5个样本形成一个分支，与网上报道另一种东方次睾吸虫和麝猫后睾吸虫并列。

受剪承载力为V=cfcAc+μN[17].其中，接触面进行打毛处理时c=0.45，μ=0.7；接触面未进行打毛处理时c=0.35，μ=0.6.fc为混凝土的抗拉强度设计值；Ac为混凝土的抗拉有效截面面积；N为结合面的法向作用力.内聚力-库伦摩擦模型的参数设置参照现有研究选取，如表1所示.

3　讨论

目前，已发表的吸虫18S的长度为1 836～1 989 bp，研究的东方次睾吸虫18S的长度是目前最长的，为1 998 bp，研究发现研究的两种后睾科吸虫的5个样品均无长度的差异，说明核糖体18S序列比较稳定，保守。华支睾吸虫和东方次睾吸虫的种内差异均小于0.3%，Zheng等人在研究前后盘吸虫核糖体时，发现18S的种内差异为0～0.2%，这与研究的结果相似[5]，说明核糖体18S序列在种内高度保守。研究的华支睾吸虫和东方次睾吸虫间差异仅为0.2%～0.4%，麝猫后睾吸虫与华支睾吸虫、东方次睾吸虫间的差异为0.1%～0.3%，种间差异很小。与其他吸虫18S序列比较发现，土耳其斯坦裂体吸虫与其他吸虫间差异较大，为11.9%；除土耳其斯坦裂体吸虫外，其他吸虫种间差异最大为6.9%。这说明同一科中18S序列种间变异较低，但不同科间种间变异相对较大，血吸虫与其他吸虫间差异更大。

在进化树中，棘口目、后睾目和斜睾目的吸虫都分别聚集在同一分支上，且每个科均形成独立的小分支，所有的华支睾吸虫聚集在一起，研究的5条东方次睾吸虫形成一个小分支，与网上报道另一种东方次睾吸虫和麝猫后睾吸虫并列，因此推断东方次睾吸虫可能为复杂虫种。研究的3种后睾科吸虫位于同一个小分支，不能分出这三种吸虫间亲缘关系的远近，但在目这一分类阶元，这与以往对于18S序列构建进化树的结果相似[5-6]，但基于线粒体全序列和ITS1序列对吸虫进化关系进行研究时，在这3种后睾科吸虫中，华支睾吸虫和麝猫后睾科吸虫亲缘关系较近[7]。由此可见18S序列更适合作为较高阶元的进化分析。

参考文献：

［1］　Suarez-Munoz M A，Fernandez-Aguilar J L，Sanchez-Perez B，et al.Risk factors and classifications of hilar cholangiocarcinoma ［J］.World Journal of Gastrointestinal Oncology，2013（5）：132-138.

［2］ Fang Y Y，Chen Y D，Li X M，et al.Current Prevalence of Clonorchis sinensis Infection in Endemic Areas of China［J］.Chinese journal of parasitology&parasitic diseases，2008，26：99-103.

［3］ Fernandez M，Littlewood D T，Latorre A，et al.Phylogenetic relationships of the family Campulidae（Trematoda）based on 18S rRNA sequence［J］.Parasitology，1998，117：383-391.

［4］　Verma J，Agrawal N，Verma A K.The use of large and small subunits of ribosomal DNA in evaluating phylogenetic relationships between species of Cornudiscoides Kulkarni，1969（Monogenoidea：Dactylogyridae）from India［J］.Journal of Helminthology，2017，91（2）：206-214.

［5］ Zheng X，Chang Q C，Zhang Y，et al.Characterization of the Complete Nuclear Ribosomal DNA Sequences of Paramphistomum cervi［J］.The Scientific World Journal，2014，27（3）：751907.

［6］ 常巧呈，郑旭，段红，等.基于核糖体18S和ITS2序列探讨胰阔盘吸虫的分子进化地位［J］.黑龙江八一农垦大学学报，2015，27（4）：50-53.

［7］ 刘泽轩.圆圃棘口吸虫分子种系发生的研究［D］.大庆：黑龙江八一农垦大学，2016.