NADPH氧化酶主要存在于中性粒细胞及其它吞噬细胞的细胞膜上，能够产生活性氧(reactive oxygen species，ROS)，具有杀菌作用，并参与宿主细胞的免疫应答[1]。NADPH氧化酶是一种高度调节的多亚基氧化酶复合体[2]，它的组装与激活需要胞质亚基p47phox、p40phox、p67phox磷酸化与激活，活化的催化亚基p47phox与p40phox转移到胞膜与胞膜亚基gp91phox及p22phox结合并组装成NADPH氧化酶全酶。当有适当外源物刺激时，NADPH氧化酶就被转录激活。其中胞质亚基p47phox、p40phox在激活NADPH氧化酶中发挥着重要的作用[3-6]。

人(Homo sapiens)[7]、鼠(Mus musculus)[8]、野牛(Bison bison)[9]和海豚(Tursiops truncatus)[10]NADPH氧化酶的5个亚基均已被克隆和描述。鱼类NADPH氧化酶的5个亚基的cDNA也已从红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)[11]、鲤(Cyprinus carpio)[12]、翘嘴鳜(Siniperca chuatsi)[13]、虹鳟(Oncorhynchus mykiss)、大西洋鲑(Salmo salar)、香鱼(Plecoglossus altivelis)和斑马鱼(Danio rerio)中克隆出来。在NCBI数据库中仅见到大西洋鲑(Salmo salar)的gp91phox、p47phox、p67phox亚基的cDNA全序列的报道。可见对其他鱼类NADPH氧化酶的研究还较少。

草鱼(C.idellus)在我国分布广泛，是非常重要的淡水经济鱼类。然而，疫病是限制草鱼养殖业发展的重要因素之一。鉴于NADPH氧化酶能生成用于清除病原微生物的活性氧，在机体的防御体系中起着非常重要的作用，而迄今还未发现有关草鱼NADPH氧化酶p47phox、p40phox基因的相关报道。本研究克隆了草鱼NADPH氧化酶的2个重要调节亚基p47phox和p40phox基因，并对其编码的氨基酸序列进行了分析，同时对这2个亚基在草鱼不同组织中的差异表达情况检测，以期了解NADPH氧化酶在鱼类免疫调节中的作用及为鱼类疾病爆发的机制奠定基础。

在传统初中数学教学中，教师因为缺乏培养学生自主学习能力的意识从而导致学生过分依赖教师的讲解，并不能自主完成学习活动，这对于学生日后数学学科的学习会产生极大的不利影响。学生在初中阶段，学习思维和能力快速发展，教师应抓住学生这一学习特点展开有效教学，让学生在教师教学方法的指引下改变并端正学习态度，从而增强学生自主学习意识并实现自身自主学习能力的完善加强。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验用草鱼体重200 g左右，来自中科院水生生物研究所关桥养殖场。运回实验室后，暂养5 d，恒温(20±2)℃，空气充氧，暂养过程中每天投喂一次人工饲料。Trizol试剂购自Invitrogen 公司；Ex-Taq聚合酶、DL-2000 Marker、pMD-18Tvector均购自TaKaRa公司；RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit：购自美国Thermo公司；iQTM SYBR®Green Supermix：购自美国Bio-Rad公司；胶回收试剂盒购自Omego公司；其它试剂均为国产分析纯。大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α由本实验室保存。

1.2 引物的设计与合成

将测序所得到的cDNA序列用NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)的BLASTN、BLASTX和TBLASTX软件进行同源基因的搜索，查找与其相关的同源序列；氨基酸序列的推断和疏水性分析通过ExPASy网站上(http://www.expasy. org/)的软件完成；氨基酸序列同源性比较由ClustalW2.1程序完成。结构域分析用SMART软件(http://smart.embl-heidelberg.de)预测。

表1 克隆及检测草鱼NADPH氧化酶p40phox和p47phox亚基的引物 Tab.1 Primers used in cloning and decting p40phox and p47phox subunit of NADPH oxidase of C.idellus

引物名序列(5′-3′)用途p47phox-F1CCVAGYCARCAYTAYGTNTACAForinitialPCRp47phox-R1GTGTTBTCNSTRCARCGCTSCAp40phox-F1ARAGTGAYTTYGABCAGCTBCp40phox-R1TCNCGGTAGTTCARVGCRATp47phox-3′TGATGTGGTGTTGCTCCTTGForRACEPCRp47phox-3′NCTTTTGTATGGGTGTGGTGCp47phox-5′TGATGTGGTGTTGCTCCTTGp47phox-5′NCTTTTGTATGGGTGTGGTGCp40phox-3′GGTACTTACTGTTGCCTTTGGTp40phox-3′NCTTTTGTATGGGTGTGGTGC

续表1

引物名序列(5′-3′)用途p40phox-5′GGTACTTACTGTTGCCTTTGGTp40phox-5′NGTAATCAATGAAGCCTTTCTTCTCUPM-LongCTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTUPM-ShortCTAATACGACTCACTATAGGGCNUPAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTp47phox-qFACCCTTGCTGAATACTTTCGTForRT-PCRp47phox-qRCTTTAGTGTGAGCTCATACTTTGp40phox-qFGAGATCGCAGAGAGCAGAATCCCp40phox-qRTTCATCGTCTAATATCCGTATCAactin-qFTTGGTGACGAGGCTCAGAGCAactin-qRCACCATCACCAGAGTCCATCAC

注：R：A/G;Y：C/T;M：A/C;K：G/T;S：C/G;W：A/T;B：C/G/T;D：A/G/T;H：A/C/T;V：A/C/G.

1.3 RNA的提取和SMART cDNA的合成

采用SPSS 21.0统计学软件对数据进行处理，计数资料以例数（n），百分数（%）表示，采用x2检验；计量资料以“±s”表示，采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

式中，RC为晶体管集电极偏置电阻；RB为晶体管基极偏置电阻；VRB为晶体管基极-发射极电压；VRC为晶体管集电极-发射极电压。

1.4 各亚基中间片段及全长cDNA的扩增

框架标记和解释标记在元旦社论中出现较少。框架标记可以构建清晰的语篇框架，从而使社论的论证更加具有气势。在语步4中框架标记出现频率较高，通常都是连用三个或四个相同句式开头的句子，不仅读起来铿锵有力，同时也为语步4阐述新年任务构建起清晰的框架，阅读时一目了然。如“在新的一年里，我们一定要……”、“1993年，我们……”、“要实现九十年代的奋斗目标……”、“夺取新的胜利，就要……”等。

1.5 基因的氨基酸推测和序列比较分析

根据NCBI Genbank数据库中斑马鱼和鲤鱼的NADPH氧化酶p40phox和p47phox亚基cDNA序列保守区设计简并引物，扩增中间片段，RACE扩增所需特异性引物根据扩增出来的中间片断设计，荧光定量PCR扩增所需引物根据全长cDNA序列设计。所有引物均由上海生工生物公司合成(表1)。

1.6 不同组织的差异表达分析

用BLAST程序对草鱼NADPH氧化酶2个调节亚基p47phox/p40phox编码的肽链进行同源性比较。结果发现：草鱼NADPH氧化酶2个调节亚基与团头鲂、鲤鱼和斑马鱼的同源亚基的氨基酸序列同源性在81%～96%之间，而与墨西哥脂鲤、大西洋鲑和白斑狗鱼等鱼类对应亚基同源性在68%～74%之间。推断p47phox亚基含有1个PX 结构域(Val6-Glu123)、2个SH3结构域(Ser162-Pro214；Leu232-Arg284)、1个PC基序(motif)(Pro354-Gln408)。P40phox亚基含有PX结构域(Asn19-Gln140)、SH3结构域(Arg170-Ile223)、PB1结构域(Ser249-Ala344)各1个。p47phox和p40phox编码肽链同源性比对及功能域分析结果见图3和图4。另外，通过CLUSTAL比对显示这两个亚基的结构域与人、鼠、野牛等哺乳动物对应的亚基蛋白质序列的结构域和功能位点基本上匹配，说明这些亚基的功能与哺乳动物对应的亚基相似。

取草鱼头肾和脾脏混合，按Trizol试剂盒说明书介绍的方法提取混合组织的RNA。琼脂糖凝胶电泳分析RNA的质量。按照Clontech公司的SMART RACE cDNA Amplification Kit方法进行第一链cDNA合成。具体操作按说明书进行。

2 结果

2.1 草鱼p47phox和p40phox基因cDNA全长的克隆及特征

本研究通过同源性比对设计引物，结合RT-PCR与RACE-PCR技术，克隆获得草鱼NADPH氧化酶2个调节亚基p47phox和p40phox基因的cDNA全长序列，通过软件分析，发现预测的氨基酸序列具有Nox/Duox家族蛋白特征结构域，即N端PX结构域、SH3结构域、PC基序和PB1结构域，这些结构域与NADPH氧化酶抗菌免疫功能相关[16]。对这些结构域的分析，为我们下一步研究其免疫功能奠定基础。而且这些结构域与人、鼠、野牛、海豚等哺乳动物对应的亚基蛋白质序列的结构域和功能结合位点基本上吻合，说明这些亚基在鱼类中的功能与哺乳动物对应的亚基相似，但有待进一步试验证实。氨基酸序列比对分析表明所克隆得到草鱼的p47phox和p40phox基因与其他物种具有较高的同源性，这说明NADPH这两个亚基在进化上相当保守，同时也表明物种分类关系与进化地位相匹配。

图1 草鱼p47phox同源片段、5′RACE、3′RACE电泳图 Fig.1 Electrophoresis results of homologous fragment，5′RACE，3′RACE of p47phox in C.idellus M:DL2000 marker；1:p47phox同源片段PCR产物；2:5′RACE—PCR产物；3:3′RACE—PCR产物

图2 草鱼p40phox同源片段、5′RACE、3′RACE电泳图 Fig.2 Electrophoresis results of homologous fragment，5′RACE，3′RACE of p40phox in C.idellus M:DL2000 marker；1:p40phox同源片段PCR产物；2:5′RACE—PCR产物；3:3′RACE—PCR产物

2.2 草鱼与其他动物的对应调节亚基的氨基酸序列比对

用实时荧光PCR方法定量分析草鱼NADPH氧化酶2个调节亚基在草鱼组织表达分布的状况，检测和分析方法参照文献[14]。分别提取健康草鱼胸腺、心、头肾、鳃、肠、肝、肾、脾和皮肤中的RNA，逆转录成cDNA。用Real-time PCR引物扩增各基因序列(表1)，PCR产物用DNA胶纯化试剂盒纯化后克隆进入载体pMD18T。质粒DNA经纯化后用于制作标准浓度曲线，曲线的斜率应在-3.6与-3.2之间，相关系数应大于0.96。以草鱼各组织样品cDNA为模板，进行荧光定量PCR，PCR反应体系和反应条件与上述建立标准曲线的一致。利用CFX96TM Real-Time System(BIO-RAD)自带CFX Manager软件观察荧光定量的结果以及数据的导出，通过Excel工具计算目的基因与内参基因拷贝数比值来确定草鱼p47phox和p40phox基因mRNA水平的相对表达量，即以相对于内参基因β-actin的归一化认定值表征目的基因的表达水平。每样品重复3次，结果计算采用Livak的2-ΔΔCT方法[15]。

图3 草鱼p47phox同源比对结果及功能域分析 Fig.3 Alignment of p47phox amino acid sequences of C.idellus and the function domain analysis 箭头分别指示PX结构域、2个SH3结构域的结合位点及PC motif，假定的p67phox结合位点。

2.3 p40phox和p47phox亚基在草鱼不同组织中差异表达分析

通过实时定量PCR分析：NADPH氧化酶2个调节亚基p47phox和p40phox在草鱼胸腺、心、头肾、鳃、肠、肝、肾、脾和皮肤等不同组织中的表达强度不同(图5)。在9种组织中都能检测到这两种亚基的表达。其中p47phox基因在皮肤，心脏和胸腺中表达最高，其次是鳃，肝脏，脾脏和头肾，但不同组织之间没有显著性差异(P>0.05)。p40phox在心脏、胸腺和皮肤中表达最高，其次是肠、头肾、脾脏，在肝、鳃和肾中也有表达，但不同组织之间没有显著性差异(P>0.05)。

根据表1所列引物，以第一链cDNA做为模板，先用简并引物扩增出基因的cDNA片段，再根据各个基因对应的特异性引物，用5′-RACE引物和SMART5′锚定引物(5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG-3′)扩增基因的5′端，用3′-RACE引物和SMART 3′锚定引物(5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACT30VN-3′)扩增基因的3′端。扩增产物经克隆、测序后，拼接基因的5′端和3′端序列，获得各基因的全长cDNA序列。

图4 草鱼p40phox同源比对结果及功能域分析 Fig.4 Alignment of p40phox amino acid sequences of C.idellus and the function domain analysis 箭头分别指示PX结构域、SH3结构域及PB1结构域的结合位点。

图5 p47phox和p40phox在草鱼不同组织中的mRNA水平分析 Fig.5 Analysis of mRNA level about p47phox and p40phox gene of different tissues in C.idellus

3 讨论

取草鱼头肾和脾脏混合，提取RNA，以反转录所得cDNA为模板，通过简并引物进行巢式PCR，获得大小为703 bp的p47phox片段和大小为875 bp的p40phox片段;通过5′RACE-PCR扩增，获得长度为774 bp的p47phox5′端片段和长度为182 bp的p40phox5′端片段；通过3′RACE-PCR扩增，获得大小为486 bp的p47phox 3′端片段和1 335 bp的p40phox 3′端片段，PCR产物凝胶电泳结果见图1和图2 。对所获得的片段进行拼接，得到大小为1 589 bp的p47phox亚基cDNA全长序列，ORF为1 233 bp，5′UTR长度为49 bp，3′UTR长度为307 bp，包含加尾信号和25 bp的poly(A)尾各1个，无mRNA不稳定信号。由cDNA序列推断：p47phox亚基编码由410个氨基酸组成的肽链，预测其相对分子质量为47.77×103，理论pI为8.08。同时得到大小为2 103 bp的p40phox亚基cDNA全长序列，ORF为1 068 bp，5′UTR长度为28 bp，3′UTR长度为1 007 bp 包括1个29 bp的加尾信号、5个poly(A)尾，无mRNA不稳定信号。由cDNA序列推断：p40phox亚基编码由355个氨基酸组成的肽链，预测其相对分子量为45.68×103，理论pI为7.83。由2个cDNA序列推断的肽链序列均无信号肽和跨膜区，因此推断草鱼p47phox/p40phox为非分泌型蛋白。

Nox/Duox家族蛋白结构特征中的PX结构域是维持其激活功能的关键位点，如Arg57、Arg58、Tyr59、Arg105[16-17]在草鱼中也存在，这几个关键位点如果缺失或突变，NADPH氧化酶将无法发挥抗菌免疫调节功能[17]。人类的p40phox与p47phox亚基的PX结构域能选择性识别PtdInsP3和PtdInsP2，然后被磷酸化，并被激活，组装，活化后的p40phox与p47phox由细胞质被转运到细胞膜上，相互作用后进而装配成有活性的NADPH氧化酶多酶复合体，发挥催化功能，促使ROS产生[17-18]。人类的p40phox的SH3结构域能与磷酸化后的p47phox C端的PRR结构域相互作用，PC基序也能与p67phox相互作用，然后3个催化亚基p40phox 、p47phox 与p67phox 相互作用并以1∶1∶1比例结合在细胞膜上形成复合体，发挥NADPH氧化酶的催化功能，促使ROS的产生[6]。草鱼p40phox与p47phox具有类似于人的PX和SH3结构域。由此推断草鱼与人的NADPH氧化酶亚基都拥有相似的活化机制。

胡宝庆等[13]通过半定量PCR分析了翘嘴鳜p47phox和p40phox在各种组织中的分布表达情况，这与我们在草鱼中所得到结果有所不同。一方面可能是所用方法不同，Real-time RCR相对更灵敏、准确、可靠。另一方面可能是p47phox和p40phox调节亚基mRNA在不同物种中组成型表达情况有所不同。因为不同物种在不同生长阶段如幼鱼或成鱼阶段，p47phox和p40phox基因在不同组织中分化不同，丰度不同，因此表达量不同。在本研究中，所采用的是200 g左右的鱼，而胡宝庆等[13]是用400 g左右成鱼，因此p47phox和p40phox表达量存在差异。其次鱼体在不同饲养环境中如水质或温度中，鱼类为维持自身的免疫稳态，各组织发挥的免疫功能不同因而表达量有所差异。然而，本研究与鲫、红鳍东方鲀的表达模式基本相吻合[18]。可能是因为鱼类的胸腺、头肾这两个重要的免疫组织含有丰富的吞噬细胞，同样作为造血组织的心脏也可能NADPH氧化酶表达量高[19]。皮肤、肠作为鱼类主要的黏膜相关淋巴组织，也含有较为丰富的吞噬细胞[20-21]。这些吞噬细胞都能够产生NADPH氧化酶，从而促进呼吸爆发[22-23]，而发挥抗菌免疫作用。有趣的是，我们发现p47phox和p40phox在各组织中分布表达略有差异，但是差异不显著，这可能是机体的免疫状态和各亚基基因的转录时间差异造成的。

本研究证明所克隆获得的草鱼p47phox和p40phox与团头鲂、鲤、斑马鱼p47phox和p40phox基因具有较高的同源性，分析了草鱼p47phox和p40phox基因在各个组织器官中的表达分布情况。以期能够为揭示p47phox和p40phox在抗菌免疫反应及对免疫相关基因的调控作用奠定研究基础。

随着社会节奏的加快，工作压力的增大，人们罹患高血压疾病的比率增高。2018年2月发表的“十二五”高血压抽样调查研究，在全国31个省、自治区及直辖市随机抽取年龄＞18岁人群＞45万人，发现我国成人高血压患病率达23.2%，患病人数达2.45亿[1]。可见，我国高血压患病人数众多，对高血压等慢性疾病的控制刻不容缓。而规范高血压等慢性疾病，有助于降低疾病的发病率,提高生活质量[2]。

参考文献：

[1]Babior B M.NADPH oxidase：an update[J].Blood，1999，93(5)：1464-1476.

[2]Chen L Y，Wu Y Q，Zhang Z H.NADPH oxidation-reduction reaction platform and its regulatory role in Ang II-mediated ROS signaling pathway[J].Prog Physiol，2012，43(6)：439-444.

[3]Leto T L，Lomax K J，Volpp B D，et al.Cloning of a 67-kD neutrophil oxidase factor with similarity to a noncatalytic region of p60c-src[J].Science，2009，248(4956)：727-730.

[4]Tsunawaki S，Kagara S，Yoshikawa K，et al.Involvement of p40phox in activation of phagocyte NADPH oxidase through association of its carboxyl-terminal，but not its amino-terminal，with p67phox[J].J Exp Med，1996，184(3)：893-902.

[5]Tsunawaki S，Mizunari H，Nagata M，et al.A novel cytosolic component，p40 phox，of respiratory burst oxidase associates with p67 phox and is absent in patients with chronic granulomatous disease who lack p67 phox[J].Biochem Biophys Res Commun，1994，199(3)：1378-1387.

[6]Nauseef W M.Assembly of the phagocyte NADPH oxidase[J].Histochem Cell Biol，2004，122(4)：277-291.

[7]Wientjes F B，Hsuan J J，Totty N F，et al.p40phox，a third cytosolic component of the activation complex of the NADPH oxidase to contain src homology 3 domains[J].Biochem J，1993，296(Pt3)：557-561.

[8]Mizuki K，Kadomatsu K，Hata K，et al.Functional modules and expression of mouse p40phox and p67phox，SH3-domain-containing proteins involved in the phagocyte NADPH oxidase complex[J].Eur J Biochem，1998，251(3)：573-582.

[9]Gauss K A，Bunger P L，Siemsen D W，et al.Molecular analysis of the bison phagocyte NADPH oxidase：Cloning and sequencing of five NADPH oxidase cDNAs[J].Comp Biochem Physiol B：Biochem Mol Biol，2002，133(1)：1-12.

[10]Inoue Y，Itou T，Jimbo T，et al.Molecular cloning and identification of bottle-nosed dolphin p40(phox)，p47(phox)and p67(phox)[J].Vet Immunol Immunopathol，2001，78(1)：21-33.

[11]Inoue Y，Suenaga Y，Yoshiura Y，et al.Molecular cloning and sequencing of Japanese pufferfish(Takifugu rubripes)NADPH oxidase cDNAs[J].Dev Comp Immunol，2004，28(9)：911-925.

[12]Mayumi M，Takeda Y，Hoshiko M，et al.Characterization of teleost phagocyte NADPH oxidase：molecular cloning and expression analysis of carp(Cyprinus carpio)phagocyte NADPH oxidase[J].Mol Immunol，2008，45(6)：1720-1731.

[13]胡宝庆,刘 毅,文春根.翘嘴鳜NADPH氧化酶三个调节亚基cDNA 的克隆及表达特征[J].动物学研究,2010,31(3):250-260.

[14]Overbergh L，Giulietti A，Valckx D，et al.The use of real-time reverse transcriptase PCR for the quantification of cytokine gene expression[J].J Biomol Tech，2003，14(1)：33-43.

[15]Livak K J，Schmittgen T D.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-DeltaDelta C(T))method[J].Methods，2001，25：402-408.

[16]Brown D I，Griendling K K.Nox proteins in signal transduction[J].Free Radic Biol Med，2009，47(9)：1239-1253.

[17]Karathanassis D，Stahelin R V，Bravo J，et al.Binding of the PX domain of p47(phox)to phosphatidylinositol C.idellus 3,4-bisphosphate and phosphatidic acid is masked by an intramolecular interaction[J].EMBO J，2002，21(19)：5057-5068.

[18]Mayumi M，Takeda Y，Hoshiko M，et al.Characterization of teleost phagocyte NADPH oxidase：molecular cloning and expression analysis of carp (Cyprinus carpio)phagocyte NADPH oxidase[J].Mol Immunol，2008，45(6)：1720-1731.

[19]Ellis A E，Munroe A L S.Defence mechanismsin fish.1.A study of the phagocytic system and the fate of intraperitoneally injected particulate material in the plaice (Pleuronectes platessa L.)[J].J Fish Biol，1976，(8)：67-78.

[20]McMillan D N，Secombes C J.Iso1ation of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss)intestinal intraepithelial lymphocytes(IEL)and measurement of their cytotoxic activity[J].Fish Shellfish Immunol，1997，(7)：527-541.

[21]Lin S H，Davidson G A，Secombes C J.Morphological study of cells isolated from the perfused gill of dab and Atlantic salmon[J].J Fish Biol，1998，53：560-568.

[22]Lin S H，Ellis A E，Davidson G A，et al.Migratory，respiratory burst and mitogenic responses of leucocytes isolated from the gills of rainbow trout(Oncorhynchus mykiss)[J].Fish Shellfish Immunol，1999，(9)：211-226.

[23]Clerton P，Troutaud D，Deschaux P.The chemiluminescence response of leucocytes isolated from the gut of rainbow trout(Oncorhynchus mykiss)[J].Fish Shellfish Immunol，1998，(8)：73-76.