端粒DNA(GDNA)是富含G碱基的高度保守的重复核苷酸序列，在K+、Na+等阳离子以及一些药物小分子的存在下，通过Hoogsteen氢键形成稳定的G -四链体结构[1-4]。研究表明，能够诱导端粒DNA形成G -四链体结构的小分子化合物具有重大的抗肿瘤意义，而以G -四链体为抗肿瘤药物作用靶点筛选配体的方法是目前研究的热点。

寻找以端粒DNA为作用靶点，毒性低的抗肿瘤药物引起了科研工作者的极大的兴趣。目前人们采用紫外吸收光谱、荧光光谱、电化学、圆二色光谱、核磁共振波谱、X-射线衍射、表面等离子体共振等多种方法[5-10]，从不同角度来研究GDNA与小分子配体的相互作用。荧光光谱法具有操作简单、灵敏度高、响应速度快，尤其是已经被广泛应用的基于构型转换的荧光共振能量转移(FRET)方法是研究GDNA与配体之间作用机理的一个重要方法。Simonsson和SjÖback研究小组[6]在单链GDNA的两端分别标记荧光基团和猝灭基团，在一些金属离子或者四链体配体的作用下，GDNA自身折叠形成G -四链体，引起荧光共振能量转移导致荧光强度减低，可以通过荧光强度的变化来检测G -四链体的形成。Jin等[11]基于荧光共振能量转移，用纳米金作为猝灭剂，5′标记荧光素(FAM)的人端粒DNA(F-GDNA)作为探针，设计了一端标记的、简单快速地筛选G -四链体配体的方法。虽然GDNA与小分子配体的荧光分析方法有很多，但是这些方法大多需要荧光标记，操作复杂，仪器昂贵，成本较高。因此非常有必要建立一些简单、快速并且能够被广泛应用的方法来筛选与G -四链体作用的配体。

而对于唯一性问题，1999年， Mischler和Wennberg首先在硬势和角截断条件下得到了一个最优的结果，即如果初值质量和能量有限， 能量保持守恒的解一定是唯一的[8].但是Wenenberg通过具体的例子表明方程存在能量增加的解[9].Toscani和Villani利用概率空间里的一个距离在麦克斯韦势、非角截断条件下得到了解的唯一性[10].最近，Desvillettes和Mouhot在初值满足一定条件下，在硬势及非角截断情形下得到了解的唯一性[3，11].

中药单体是天然化合物的提取物，研究发现一些中药单体像槲皮素、芦丁、白杨素、大豆苷元等黄酮类化合物[12-15]对肿瘤治疗有一定的化学预防作用。本文以天然抗肿瘤中药单体槲皮素作为研究对象，基于GDNA结构的转变，构建了一种无标记荧光方法考察GDNA与槲皮素的相互作用，根据N-甲基卟啉二丙酸Ⅸ(NMM)/GDNA体系中加入槲皮素前后荧光强度的变化，快速有效地筛选能够诱导GDNA形成G -四链体结构的药物，为抗肿瘤药物的开发和研究以及肿瘤的临床治疗等提供重要的。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

F-4600型日立荧光分光光度计(日本，日立公司)；UV-1600PC型紫外-可见分光光度计(上海美谱达仪器有限公司)；pHS-3C型pH计(上海精密科学仪器有限公司)；TGL-18C离心机(上海安亭科学仪器厂)。

人端粒DNA(F-GDNA)：(5′-TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGG-3′)，RDNA:(5′-GTTCATGCCGCCCATGCTCG-3′)由上海生物工程有限公司合成，用TE缓冲溶液(10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，pH=7.2)配制成100 μmol/L的储备液；槲皮素、芦丁、大豆苷元、黄连素、木犀草素、山奈酚、苦参碱、绿原酸、黄连素、熊果酸等(上海金穗生物科技有限公司)均用无水乙醇溶解，用超纯水配制成浓度为100 μmol/L的母液；NMM(北京百灵威科技有限公司)、EDTA、无水乙醇等所用试剂均为分析纯。实验缓冲体系为pH=7.2的10 mmol/L Tris-HCl；用水均为Milli-Q(18.2 MΩ·cm)超纯水。

1.2 实验方法

1.2.1 荧光光谱法 取100 μL 5 μmol/L NMM溶液于微量比色皿中，测量其荧光光谱。向NMM溶液中加入1 μL 100 μmol/L GDNA，混合均匀后放置15 min，测定其荧光强度(F0);然后向体系中加入2 μL浓度为100 μmol/L槲皮素溶液，混合均匀后放置30 min，测定其荧光强度(F)。

从表2看出，在交互性特征一栏，《政府工作报告》的每个特征频数均低于《美国国情咨文》，且每千词频数均不高，几乎保持在个位数，如:动词do只有0．6个/千词，而第二人称使用甚至低至0．2个/千词;而在信息性特征类别上，《政府工作报告》除了类形比率52．25%低于《美国国情咨文》的56%以外，其他各项均超越《美国国情咨文》，尤其在于名词和修饰形容词的大幅度使用，每千词频数多达231．4和113．7。

参考文献：

激发光源采用氙灯激发，激发波长λex为610 nm，发射波长λem为600～700 nm，激发与发射光狭缝均为10 nm，光电倍增管电压950 V。

1.2.2 紫外-可见吸光光谱法 移取2 mL 8 μmol/L NMM溶液于1 cm为石英比色皿中，测量其紫外光谱。向NMM溶液中加入5 μmol/L GDNA，混合均匀后放置15 min，测量其紫外光谱，然后再分别加入浓度为2 μmol/L和10 μmol/L的槲皮素溶液，混合均匀后放置30 min，进行紫外检测。

[10] LIU P,CHEN F Y,XIONG Z D,et al.Journal of Analytical Science(刘萍,陈凤英,熊泽东,等.分析科学学报),2015,31(6):851

2 结果与讨论

2.1 实验原理

NMM是一种特殊的阴离子卟啉化合物，能够与G -四链体特异性结合，而对单链、二链体、三链体都无特异性结合[16-17]。NMM游离状态时，荧光强度微弱，但NMM与G -四链体结合后，荧光强度显著增强[18-19]。NMM已经广泛应用于DNA[20]、核酸酶[18]和一些生物小分子检测。本文基于NMM与G -四链体的特异性结合，通过考察槲皮素与NMM/GDNA 作用前后体系荧光强度的变化，实现筛选 G -四链体小分子配体的目的。实验原理见图1。

图1 无标记筛选G -四链体小分子配体的实验原理 Fig.1 Schematic illustration of label-free screening small molecule ligands of G-quadruplex

2.2 实验可行性分析

2.2.1 荧光光谱 为验证方法的可行性，我们选取槲皮素作为研究对象，分别测量了NMM、NMM/GDNA、NMM/GDNA+槲皮素体系的荧光强度。结果如图2所示，NMM溶液荧光强度很低，当与 GDNA结合后，NMM的荧光强度有所增加，可能是NMM的环境改变引起，加入槲皮素配体后，体系的荧光强度明显增强。可能是槲皮素诱导GDNA形成G -四链体结构，NMM嵌入G -四链体结构中后使体系荧光强度大大增强。

为验证实验体系荧光强度的增加是因为槲皮素与GDNA相互作用形成了G -四链体，选择了一条对照链RDNA，这条链含有少量鸟嘌呤G碱基，在其它条件不变的情况下，将GDNA换成RDNA，研究不同浓度槲皮素对NMM/RDNA的荧光强度的影响。结果表明，不同浓度的槲皮素不能使NMM/RDNA体系荧光强度增加。只有在NMM/GDNA体系里加入槲皮素，荧光强度才有明显的增加，这与实验原理相符合，即槲皮素能够诱导单链的端粒DNA折叠形成G -四链体，从而使体系的荧光强度大大增强。

为进一步验证实验原理，还考察了一种生物碱类小分子苦参碱(Matrine)与NMM/GDNA体系的作用，在其它条件不变的情况下，研究不同浓度苦参碱对NMM/GDNA的荧光强度的影响，实验所取条件与槲皮素相同，结果如图3所示。从图中可以看出，在NMM/GDNA体系中加入2、4、6、8和10 μmol/L的苦参碱以后，体系的荧光强度几乎没有改变，说明苦参碱不能诱导GDNA形成G -四链体结构。结果表明，苦参碱也不能使体系荧光强度增加，只有在NMM/GDNA体系中加入槲皮素，才能使体系的荧光强度得到增强，进一步说明槲皮素能够诱导GDNA形成G -四链体。

图2 NMM/GDNA体系与槲皮素作用的荧光光谱 Fig.2 Fluorescence emission spectra of NMM/GDNA+Quercetin a:5 μmol/L NMM;b:5 μmol/L NMM+1 μmol/L GDNA;c:b+2 μmol/L Quercetin.

图3 NMM/GDNA体系与苦参碱作用的荧光光谱 Fig.3 Fluorescence emission spectra of NMM/GDNA+Matrine a:NMM;b:NMM/RDNA;c - g:2,4,6,8,10 μmol/L Matrine.

2.2.2 紫外-可见吸收光谱 实验还采用紫外-可见吸光光谱法来考察槲皮素与GDNA之间的相互作用。实验结果如图4所示，可以看出在NMM/GDNA体系中加入槲皮素后体系的吸收光谱发生了减色现象，可能是配体与G -四链体的氢键对发生π电子堆积，配体嵌插到G -四链体结构中，插入的配体π*空轨道与碱基的π电子轨道发生耦合，耦合后π*轨道因部分填充电子，使π -π*跃迁几率减小，产生了减色效应[5]。吸收光谱变化越大减色效应越明显，表明嵌入程度越强。实验结果也说明了槲皮素能诱导GDNA形成了G -四链体结构，并嵌插入G -四链体中从而引起减色效应。

图4 不同浓度的槲皮素与GDNA/NMM体系的紫外-可见(UV-Vis)吸收光谱 Fig.4 UV-Vis absorption spectra of GDNA/NMM with different concentrations of Quercetin a:8 μmol/L NMM;b:5 μmol/L GDNA;c:2 μmol/L Quercetin;d:8 μmol/L NMM+5 μmol/L GDNA;e:d+2 μmol/L Quercetin;f:d+10 μmol/L Quercetin.

2.3 实验条件的优化

2.3.1 稳定时间的选择 实验考察了槲皮素与NMM/GDNA体系荧光强度随时间的变化关系。5 μmol/L NMM+1 μmol/L GDNA，混匀放置15 min，向该体系中加入2 μmol/L槲皮素后，每隔5 min测量该体系的荧光强度。结果显示随着作用时间的增加，体系荧光强度逐渐增加，但到30 min时，荧光强度变化趋于稳定，说明槲皮素与NMM/GDNA已经充分作用，实验选择混合30 min后测定。

[1] Blackburn E H,Szostak J W.Annual Review of Biochemistry,1984,53:163.

1）施工前的准备工作，主要包括对施工道路用水用电的施工场地以及设备进行准备，同时对需要进行土方填筑的相关材料进行碾压以及土料试验，相关工作人员以及机械设备等也要就位。除此之外，土方填筑时，填筑对象的堤身和铺盖压载的堤基面，都需要进行全面的清理，并且保证清理的范围要超出边界30～50cm。清理完成后，还需要对清理部位进行打磨、平整以及碾压工作。

2.4 槲皮素浓度变化对 NMM/GDNA体系荧光强度的影响

实验考察了槲皮素浓度与NMM/GDNA体系荧光强度变化之间的关系。结果如图5(A)、5(B)所示。从5(A)可以看出：随着槲皮素浓度逐渐增加，体系的荧光强度也在增强，这说明槲皮素的增加使得越来越多的GDNA形成了G -四链体，使得体系的荧光强度增大，同时也说明槲皮素是一种能够诱导GDNA形成G -四链体的小分子配体。图5(B)表示不同浓度槲皮素与体系荧光强度变化的点线图及线性关系。结果显示槲皮素浓度在2～10 nmol/L时与体系荧光强度变化呈良好的线性，检出限0.7 nmol/L，线性方程[(F-F0)/F0]=0.0473c+0.0157(c的单位为nmol/L)，R=0.9972。

图5 (A)不同浓度槲皮素与GDNA/NMM体系作用荧光光谱;(B)槲皮素浓度与GDNA/NMM体系荧光强度变化的点线图和校准曲线 Fig.5 (A) Fluorescence emission spectra of GDNA/NMM in presence of Quercetin with different concentration;(B)Point plots of change rate of fluorescence intensity GDNA/NMM with the increasing of Quercetin concentration and the calibration plots for Quercetin NMM:5 μmol/L;GDNA:1 μmol/L;Quercetin:b-f:0,2,4,6,8,10,100,200,1 000 nmol/L.

2.5 诱导GDNA形成G -四链体的小分子配体筛选

应用本方法考察了黄酮类化合物、生物碱、蒽醌类化合物和有机酸(表1)等小分子化合物，这些小分子化合物是从中药中提取出来的天然抗肿瘤药物小分子。通过考察加入药物前后NMM/GDNA体系荧光强度的变化来反映不同药物对体系的影响，从而来识别G -四链体的配体。表中ΔF= F-F0，其中F和F0分别表示不存在和存在药物的情况下NMM/GDNA体系的荧光强度。结果发现，在相同实验条件下黄酮类化合物都能使NMM/GDNA体系的荧光强度有一定程度的增加，而生物碱类、蒽醌类化合物(大黄素)及有机酸却变化不大。说明黄酮类化合物能促使GDNA形成G -四链体，而生物碱类、蒽醌类和有机酸等化合物难以诱导GDNA形成G -四链体结构。

表1 加入不同药物引起NMM/GDNA体系荧光强度变化

Table 1 The fluorescence intensity change of NMM/GDNA system induced by adding different drugs*

LigandsIntensityΔFLigandsIntensityΔF1Quercetin633.1303.77Berberine318.6-10.82Daidzein581.9252.58Matrine337.37.93Luteolin620.2290.89Emodin320.7-8.74Rutin641.6312.210Urolicacid349.620.25Kaempferol645.1315.711Chlorogenicacid347.618.26Apigenin587.425812NMM/GDNA329.4

*The concentration of NMM,GDNA and ligands are 5 μmol/L,1 μmol/L and 2 μmol/L,respectively.

3 结论

本文以槲皮素为研究对象，荧光染料NMM为指示剂，利用其与G -四链体结构特异性结合的特点，构建了一种在均相溶液中筛选 G -四链体小分子配体的荧光新方法。研究发现黄酮类化合物能促使GDNA形成G -四链体，而生物碱类和有机酸等化合物难以诱导GDNA形成G -四链体结构。该方法不仅用于考察槲皮素与 GDNA 的作用，还可以用于筛选与 G -四链体作用的离子、蛋白质、合成的药物等小分子配体，对抗肿瘤药物的开发和研究，肿瘤的临床治疗等有重要的理论和实际意义。

第三，从阅读上对色彩进行感知。在古诗的朗读过程中，教师可以引导学生想象古诗所描绘的画面，然后将其用彩笔画出来，这样的教学方法能够激发学生主动创造的热情，丰富学生的情感，提高学生的审美价值，刺激学生对色彩的感知。

在气象站仪器设备的日常使用过程当中，恰当的维护能够避免故障的产生，提升气象站的工作质量以及效率。新型自动气象站的仪器设备相较于以往的气象站设备，对于人力的依赖较为降低，可以节约大量的时间和人工，但是仍需要在购买设备和安装设备时，选择质量较好的设备。选购时，针对设备的质量进行检查，并且按照科学的方案规划安装方式以及各项线路的具体布置。

2.3.2 NMM浓度的选择 NMM的浓度对传感器的荧光信背比产生显著的影响。为了优化实验条件，考察了不同浓度NMM对体系荧光强度变化的影响。结果可以看出随着荧光染料的浓度逐渐增加，传感器的荧光变化值逐渐增加，当浓度增加为5 μmol/L后，传感器的荧光强度变化达到最大。若继续增加的浓度，传感器的背景信号也会增大，荧光强度变化反而减小，实验选择NMM的浓度为5 μmol/L。

泰国同中国不接壤，其陆地邻国均位于东南亚，其中也没有综合实力超越泰国的强国。13世纪前期，邦克朗刀联合帕孟领导泰人摆脱吴哥王朝的统治，建立起泰国历史上第一个有文字记载的国家——素可泰。之后，泰国历代王朝又同高棉和缅甸形成了长期的地缘竞争乃至战争关系。在当代，泰国仍同柬埔寨和缅甸两国存在领土争端。不过鉴于如今柬缅两国的实力偏弱，泰国所处的地缘环境总体上比较理想，无论是来自中国还是邻国的地缘压力均不强。

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在电机控制方面，该系统采用stm32f103rct6定时器3模拟PWM输出来控制电机的调速，利用L298N模块控制电机的正反转。PWM全名为脉冲宽度调制，通过在一定周期时间内调节高低电平各自所占的时间，达到改变PWM占空比的目的。该次使用的直流减速电机，采用10Khz的PWM控制频率，一个PWM周期内高电平的占空比越大，电机的转速越快。因此控制电机转速的问题就演变成了改变PWM高电平占空比的问题，具体控制流程如图5。

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通过分析，三次熔顶都是在大功率工况下出现的。水箱缺水会造成整个柴油机升温，在大功率工况下更易在活塞顶上聚集大量的热量，加速了柴油机拉缸、熔顶的进程，但第一道气环闭口间隙值偏小是产生熔顶的根本原因。柴油机连续三次出现熔顶故障，必须认真总结，为今后维修及装配提供一些经验和教训。

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在摩尔定律的指引下，芯片特征尺寸不断减小，芯片上可集成的功能模块增多，设计的复杂度也逐渐上升.工艺参数波动对芯片良率的影响越来越明显，因此有时不得不进行过度设计，以增加时序阈度提高芯片良率.流片后，工艺参数的波动固定，针对参数的波动和具体的芯片工作需求，对特殊延时器件进行调整，即可提高芯片良率.

5.农田水利施工机械。按照2011年中央1号文件的部署，今后一个时期，中小河流治理、病险水库水闸除险加固、农村饮水安全、抗旱水源工程、灌区续建配套与节水改造、小型农田水利重点县建设等工程将是“十二五”期间国家水利投资的重点，这类项目普遍强度不大，且大部分项目规模相对较小，所以中小型机械特别是一些衍生机种将在水利机械市场占有更大的份额。在挖掘机、推土机或装载机上研发多种附属装置，以适应小河、灌溉渠道的疏浚清淤、坡面修整等施工需要，将大有市场潜力。同时，为支持和配合节水型、环境友好型农业，应研究开发各种节水灌溉机械，渠道的开挖、修坡和混凝土连续衬砌机械以及节水型喷灌机等设备。

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回顾性系列病例研究。采用SPSS 19.0软件进行统计学分析。数据为计量资料通过Kolmogorov-Smirnov检验符合正态分布，采用 ± s 形式表示。组间计量资料的比较采用独立样本t检验、协方差分析，采用单因素及多因素线性回归分析去片裸眼视力的影响因素。以P＜0.05为差异有统计学意义。

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