昆虫是世界上最多、分布最广的动物群，它们能适应各种环境。昆虫免疫在昆虫对各种环境的适应中起着重要的作用，它包括物理屏障、体液免疫和细胞免疫等。昆虫对抵抗病原体如细菌、真菌和原生动物的防御机制是多种多样的，但人们对其对抗病毒的相关机制却知之甚少，因此了解昆虫抗病毒机制是至关重要的，这对农业经济和人类的健康都有重要的作用［1］。

家蚕是一种重要的鳞翅目模式昆虫，它的基因组序列和大部分的家蚕病毒已经被完全测序，因此家蚕可以作为研究病毒和昆虫之间相互作用的生物模型。家蚕只存在先天性免疫而缺乏特异性免疫，使得蚕体容易受到病毒的侵染，从而给养蚕业造成巨大的经济损失［2］。引发家蚕病毒病的病毒类型主要有：家蚕核型多角体病毒（Bombyx moriNuclear Polyhedrosis Virus，BmNPV）、家蚕质型多角体病毒（Bombyx mori Cytoplasmic Polyhedrosis Virus，BmCPV）、家蚕二分浓核病毒病病毒（Bombyx moriDensonucleosis Virus，BmDNV）和家蚕病毒性软化病病毒（Bombyx moriInfectious Flacherie Virus，BmIFV）［3］。 其 中BmNPV是危害最为严重的一种家蚕病毒，常常造成蚕农严重的经济损失。

通常情况下，家蚕病毒是通过蚕儿食下被污染的桑叶时入侵蚕体的。病毒在消化道中以出芽或共膜的形式进入宿主的肠道上皮细胞，然后病毒粒子大量复制并聚集在细胞核或者细胞质中，原发性感染的肠道上皮细胞所释放出来的病毒粒子可以对蚕体其他细胞和组织造成继发性感染。因此，消化道是家蚕抗病毒的主要场所之一。研究家蚕消化液中的抗病毒因子，提供提高家蚕对病毒抗性的有效途径，意义非常重大。

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1 家蚕病毒

1.1 家蚕核型多角体病毒

家蚕核型多角体病毒是一种由囊膜包裹的双链环状DNA病毒，属于杆状病毒科成员，具有包埋型病毒粒子（ODV）和出芽型病毒粒子（BV）两种形态不同但基因相同的病毒粒子，能在细胞核中形成坚固的多角体结构。BmNPV通过食下感染进入家蚕中肠，BmNPV多角体在肠道高pH环境中被裂解，内部包裹的ODV被释放病毒被游离在消化液中。释放出来的ODV通过受体介导的膜融合作用感染中肠上皮细胞，在中肠上皮细胞中大量的BV再感染其他细胞或组织。BV通过受体介导的细胞内吞作用进入细胞，穿过质膜后病毒粒子移向细胞核开始大量复制之后不久形成包涵体使细胞裂解，最后致使幼虫组织细胞崩解，导致多角体释放到环境中引起病毒的传播［4-7］。

1.2 家蚕质型多角体病毒

在小学高年级的语文教学中，要通过长篇文章的学习锻炼学生阅读长篇文章的能力。学生要能分析出文章的主次，抓住重点，才能在较短的时间内理解文章，这就需要对文本进行细读。教师在教学中，应首先引导学生抓住文章的关键词、中心句，理解文章要表达的观点与思想；然后在对文章结构把握的基础上进行分段；接着对文章进行细读，分析出文章的主要内容和所要表达的中心思想。

1.3 家蚕浓核病毒

家蚕消化液是带有黏性的淡黄色强碱性的液体，主要由中肠的圆筒形和杯状细胞分泌，液体主要成分中含多种消化酶、无机盐和水。已有报道显示，从家蚕的消化液分离出多种抗病毒因子和抗菌因子，如家蚕红色荧光蛋白（red fluorescent proteins，RFPs）［13］、家蚕脂肪酶-1（Bombyx morilipase-1，Bmlipase-1）［14］、家蚕丝蛋白酶-2（Bombyx moriserine protease-2，BmSP-2）［15］、可溶性NADPH氧化还原蛋白（a soluble NADH-oxidoreductase-like protein，BmNOX）［16］、家蚕碱性胰蛋白（Bombyx moritrypsin，Bmtryp）［17］等。家蚕肠液的强碱性和特殊的抗病毒因子，可抑制病原体的生长和繁殖，从而起到抗病毒的作用［18-21］。

1.4 病毒性软化病毒

病毒性软化病毒是一类寄生在中肠上皮细胞的杯状细胞质中，不会形成多角体的线性单链RNA病毒。BmIFV病毒粒子呈球形，主要通过食下传染感染家蚕。病毒粒子经过围食膜侵入中肠前端的杯状细胞，先附着于纤毛层上将病毒核酸释放到细胞中，然后进入细胞核内，后期还可以侵染圆筒细胞。最后家蚕体色灰黄，体壁多皱，排黄褐色的污液而死，死后尸体软化［12］。一般情况下，家蚕病毒是通过食物来侵染家蚕的，病毒通过肠道的肠液穿透围食膜进入和感染肠道上皮细胞，但同时家蚕消化液中也存在一些抗病毒物质，能防御病毒的感染。

2 家蚕消化液和其抗病毒因子的研究进展

家蚕浓核病毒是一类专一性寄生中肠圆筒形细胞核但不形成多角体的线性单链DNA病毒。BmDNV主要是通过食下感染，当病毒粒子进入家蚕的消化道之后，通过围食膜进入中肠圆筒细胞，病毒粒子先进入细胞内，然后进入细胞核内进行复制和装配，最后由于病毒使中肠细胞崩坏导致病毒释放到肠腔中进而失去了消化和吸收养分的能力，造成代谢失调而死［10-11］。

2.1 红色荧光蛋白

脂肪酶存在于家蚕的消化液中，属于细胞外酶，对激活剂、抑制剂的反应类似于高等动物的脂肪酶。脂肪酶1是由PONNUVEL等［14］在家蚕消化液中分离得到的脂肪酶，在家蚕幼虫中肠的上皮细胞中特异性表达。Bmlipase-1基因全长为885 bp，编码294个氨基酸，编码一个31.7 kDa蛋白，最后分泌到肠液被切割为29 kDa的成熟蛋白，它既具有催化脂肪分解的脂肪酶活性，同时也具有强烈的抗病毒能力［25］。已经证实当家蚕在5龄起蚕时口服接种预处理的BmNPV（BmNPV-ODV与Bmlipase-1一起孵育的病毒），幼虫表现出对病毒的抗性并且成功进入了蛹期，从而表明Bmlipase-1对抗BmNPV时，具有抑制BmNPV的ODV粒子的活性。虽然目前尚不明确Bmlipase-1的抗病机制，但有研究指出，对抗BmNPV时，Bmlipase-1可能将ODV的囊膜分解，阻断中肠上皮细胞对ODV的吸附和融合。但是Bmlipase-1不受病毒诱导表达，它的表达是由激素调控，在食桑期大量表达Bmlipase-1，而在眠期和上蔟期等摄食量极少的时期微量表达。在不同家蚕品种间Bmlipase-1基因的表达水平的差异也比较大，对病毒抵抗力越强的品种，Bmlipase-1的表达水平越高，对病毒抵抗力较弱的品种，Bmlipase-1表达水平越低。研究表明，可以把Bmlipase-1表达量较高的家蚕品种应用于家蚕抗性品种的选育，把测定家蚕消化液中Bmlipase-1的表达量作为选育和鉴定抗病毒家蚕品种的辅助方法［26］。

家蚕肠道内的蛋白酶主要是丝氨酸蛋白酶（serine protease，SP），家蚕丝氨酸蛋白酶作用是进行蛋白质的降解和合成，在免疫防御和生长发育过程中也起着重要的作用，是家蚕维持正常生命活动不可缺少的酶类。现今已鉴定家蚕有143个丝氨酸蛋白酶基因。在家蚕的自我防御中，丝氨酸蛋白酶联级系统起着介导黑化反应、抗菌肽的合成和激活多个免疫应答等作用。丝氨酸蛋白酶在家蚕血淋巴和体壁中起防御作用的同时，在家蚕的消化道中也发挥着防止病原感染的作用。NAKAZAWA等［15］从家蚕消化液中纯化了一种丝氨酸蛋白酶BmSP-2，发现该蛋白只在中肠中表达，并且具有强烈的抗病毒活性。BmSP-2基因全长约为855 bp，编码284个氨基酸。家蚕BmSP-2与Bmlipase-1一样不受病毒诱导表达，其表达是由激素调控的，在食桑期大量表达，而在眠期和上蔟期等摄食量极少的时期微量表达。

2.2 脂肪酶1

红色荧光蛋白是家蚕消化液中最早发现的抗病毒因子，只存在于家蚕的消化液和蚕沙中，且都具有抗病毒活性。研究发现家蚕的RFPs种类繁多，不同品种的家蚕中所含RFPs数量不一样，抗性越强所含的RFPs种类越多，抗性越弱所含的RFPs越少，现今发现含RFPs最多的达到11种［22］。另外，含有脱植基叶绿素a的红色荧光蛋白比不含的对病毒的抗性更强。以含有脱植基叶绿素a的红色荧光蛋白为例，它的合成是家蚕在添食桑叶后，桑叶的叶绿体中的叶绿素a与消化液中的碱性蛋白叶绿素酶反应形成脱植基叶绿素a，在家蚕消化液强碱性和有光的环境下，脱植基叶绿素a与叶绿素酶结合生成RFPs。因此，RFPs作为整体可以被认为是在叶绿素酶存在下与桑叶中的叶绿素结合时发出红色荧光的一组中肠分泌的蛋白［23-24］。尽管RFPs的抗病毒的具体机制尚不明确，但有四种假设：假设一为通过不允许病毒颗粒进入昆虫中肠内的受体细胞，阻止病毒的运输；假设二为RFPs可以通过水解BmNPV的多角体的糖类或者蛋白质部分来使病毒丧失对宿主细胞的识别能力；假设三为与RFPs组成复合物的主要成分四吡咯类化合物可能会使BmNPV的光动力失活；假设四为RFPs可能有核酶活性，导致病毒DNA的降解。需要进一步了解RFPs抗病毒的确切机制。预测可以通过转基因增加家蚕体内RFPs的产生，以研究获得抗病毒的家蚕品种，为家蚕抗病毒育种提供参考思路。

2.3 家蚕丝蛋白酶2

根据培养目标的要求和留学生的实际情况，确定了职业基础课、职业技能核心课、职业技能实践三大类课程。职业基础课主要包括了汉语学习、中国文化、计算机基础、网络基础等，职业技能核心课包括了C语言程序设计、HTML5网页设计、网站开发、网络服务器、网络设备、数据库技术、网络安全等，职业技能实践课包括了实验实训、毕业实习、毕业设计、毕业答辩等。

家蚕质型多角体病毒是一类寄生在中肠圆筒形细胞中，在细胞质内形成多角体的双链环状RNA病毒。BmCPV主要通过食下感染，经过中肠碱性消化液的作用使病毒粒子释放。通过围食膜侵入中肠上皮细胞，病毒在中肠后端的圆筒形细胞的细胞质中增殖，然后病变组织逐渐向前扩及整个中肠，病毒大量复制，增殖，多角体大量形成，破坏了中肠细胞，使中肠丧失消化、吸收能力。最后细胞质膜破裂，多角体病毒粒子以及细胞碎片散落在肠腔中随蚕粪一起排出，污染环境导致下一轮的感染［8-9］。

2.4 可溶性NADPH氧化还原蛋白

细胞将燃料分子经过分解代谢，将高潜能电子以还原力的形式保存下来，供还原性生物合成的需要。还原性烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）在还原性生物合成中起负氢离子供体的作用。在脂肪酸和固醇类的生物合成中，由核糖核苷酸转变为脱氧核糖核苷酸时都需要NADPH的参与。在家蚕的消化液中发现一个相对分子质量为26.5 kDa的蛋白，用它处理活的BmNPV能抑制病毒颗粒在体外感染家蚕细胞的能力。对编码该蛋白的基因进行了部分测序，该基因与NADPH oxidoreductase和黄嘌呤脱氢酶蛋白具有同源性，由于该蛋白具有NADPH氧化酶活性，因此将该蛋白命名为可溶性的NADPH氧化还原蛋白（BmNOX）。这种蛋白在家蚕抗病毒的防御系统中发挥重要作用，研究发现其在抗病的多化性蚕品种比二化性品种的家蚕表达量高。家蚕在感染BmNPV时BmNOX可能有助于灭活ODV，而且可能独立于其他可能的调节亚基发挥作用。BmNOX可能会以一种反应性的依赖氧气的方式启动细胞死亡来抵抗杆状病毒的感染。虽然该蛋白的抗病毒的机制尚不明确，但是我们可以通过将家蚕抗病的多化性品种与易感病但丝质优良的二化性品种进行选育得到性状良好的新品种，从而能适应高温多湿的环境。

样本为2015月5月—2017年5月于我院就职的50名护士，年龄在20～50岁，平均年龄（33.23±2.21）岁。

2.5 碱性胰蛋白

碱性胰蛋白酶（alkaline trypsin protein）是在家蚕中肠上皮细胞中合成并释放到消化液中的蛋白酶。从家蚕消化液中纯化了一种相对分子量约为25.4 kDa的蛋白，确定了该基因的氨基酸序列，发现其编码有271个氨基酸残基。对其进行同源性分析，该蛋白与棉铃虫胰蛋白酶（Helicoverpa armigera trypsin）具有55%的同源性，且该蛋白的活性位点是完全保守的，因此将该蛋白命名为Bmtryp。研究表明Bmtryp对BmNPV在体外条件下具有强烈的抗病毒活性。在抗性越强的家蚕品系中的Bmtryp表达量越高，可能预示着Bmtryp基因的潜在作用，内源性Bmtryp可以与其他抗病毒因子一起灭活病毒，在BmNPV的初始感染部位起到生理屏障作用。Bmtryp的抗病毒机制可能是Bmtryp抑制了BmNPV的ODV附着到中肠上皮细胞，为中肠提供了一种有效的防御机制。

3 展望

综上可知，家蚕消化液是预防病毒感染家蚕的第一道屏障，所以家蚕的消化液在抗病毒方面具有重要的作用。家蚕消化液中含有多种抗病毒因子抵抗病毒的入侵。虽然关于这些病毒因子的抗病毒机制还不清楚，但可以想象病毒在消化液中传播到中肠之前，这些抗病毒因子在消化液中灭活病毒防止其扩散到血细胞中，是一种有效的抗病毒方法。总之，通过表达内源抗病毒因子基因，可以成功获得对病毒具有强抗性的转基因家蚕品系。转基因抗病毒品系可以应用于蚕业生产中，以降低家蚕幼虫的死亡率。还可以把家蚕的抗病性与家蚕消化液中的抗病毒的关系应用到家蚕抗性品种的选育中，作为选育和鉴定抗病毒家蚕品种的一种辅助方法。在这种情况下，研究家蚕消化液中的抗病毒因子是非常重要的。研究家蚕对病毒的免疫反应，不仅有助于控制家蚕和其它一些昆虫的病毒性疾病，还有助于将家蚕作为生物反应器用于开发对人类健康具有重要意义的抗病毒药物。

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