一氧化氮（NO）是一类具有多种生物学活性的自由基，其在多种肿瘤组织内均有表达，且功能与自身浓度的高低有着密切的关系[1-3]。越来越多的证据表明，NO在肿瘤细胞的生长、转移和凋亡等过程中也发挥着十分重要的作用[4-5]。与此同时，以NO为作用靶点的抗癌研究也广泛受到关注[6-7]。

蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）作为G蛋白偶联系统中的效应物，因其参与细胞信息的传递、代谢物的调控、细胞增殖分化等生命相关活动而备受关注。研究[8-9]表明，诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，NOS-2）基因的表达受到PKC的调控。

本文采用聚类分析方法对不同载荷分布比例的车辆进行区分，聚类后同类数据尽可能地聚集到一起，不同类的数据尽量分离，以找到隐含的规律。聚类算法的选择取决于数据的类型和聚类的目的。K-均值(K-Means)是划分方法中比较经典的聚类算法,效率较高，广泛应用于大规模数据的聚类。

细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）是将细胞信号从表面受体传递到细胞核过程中的关键作用因子，无论是在细胞的多种生理功能调节上，还是在多种疾病的发病机制及病理生理过程中都发挥着重要的作用。关于其参与肿瘤细胞中PKC生理作用和NOS-2表达调控的研究，近年来，成为各医药学者探索的方向[10]。

基于以上研究，本文进一步探究NOS-2、PKC和丝裂原活化蛋白激酶激酶（motigen-activated protein kinase kinase，MEK）/ERK通路三者在口腔鳞癌细胞系Tca8113中相互作用的机制，为口腔鳞癌用药的研究提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试剂和材料

1.4.3 CCK8 细胞活性实验   按照试剂说明书进行操作，将细胞接种到 96 孔板中，每孔100 μL，细胞数量为1×104个。37 ℃，5%CO2条件下进行培养。测定时，分别向每孔加入10 μL CCK8溶液，之后，继续在培养箱内孵育2 h。最后，酶联免疫检测仪450 nm处测量各孔OD值，进行细胞活力测定。

1.2 舌鳞癌Tca8113细胞株的培养

Tca8113细胞复苏后，置于含有10%FBS的RPMI-1640培养基中培养，培养基中加入100 U·mL-1的青霉素和100 μg·mL-1链霉素。37 ℃，5%CO2恒温细胞培养箱中培养。每隔2~3 d按1︰3比例进行传代。

[5]  Cheng H, Wang L, Mollica M, et al. Nitric oxide in cancer metastasis[J]. Cancer Lett, 2014, 353(1):1-7.

1.3 实验设计

1.3.1 NOS-2/NO对Tca8113细胞增殖的影响   实验分为3组，分别为空白对照组（NC组）、空载质粒组（MOCK组）和siRNA处理组。细胞转染24 h后，采用q-PCR法检测NOS-2基因表达量；Griess Reagent检测NO生成量；CCK8法检测细胞活性。每种检测内容分别独立实验。

1.3.2 PKC对NOS-2表达的调控   1）PMA对细胞活性的影响。实验分为5组，分别为NC组和处理组（10、25、50、100 nmol·L-1 PMA）。处理24 h后，CCK8法检测细胞活性。2）PMA对NOS-2基因表达的影响。实验分为3组，分别为NC组和处理组（25、50 nmol·L-1 PMA）。处理24 h后，q-PCR法检测NOS-2基因表达量。

1.3.3 PKC-α、PKC-β和PKC-δ对NOS-2表达的调控 1）个体转染。实验分为3组，分别为PKC-α、PKC-β和PKC-δ组。每组又分为3小组，即NC组、MOCK组和siRNA处理组。转染处理24 h后，q-PCR法检测转染效率。2）共同转染。实验分为4组，分别为PKC-α、PKC-β、PKC-δ和PKC组（3种亚型共同转染组）。每组又分为3小组，即NC组、MOCK组和siRNA处理组。24 h后，q-PCR法检测转染效率。3）不同转染方式对NOS-2基因表达的影响。实验分为6组，分别为NC组、MOCK组和处理组（4种不同siRNA转染组）。24 h后，q-PCR法检测NOS-2基因表达量。

1.3.4 MEK/ERK通路对NOS-2表达的调控   U0126和PD98059均是MEK抑制剂。1）U0126和PD98059对细胞活性的影响。两种药物分组方式相同，实验分为5组，即NC组和处理组（5、10、25、50 μmol·L-1 U0126，10、25、50、100 μmol·L-1 PD98059）。处理24 h后，CCK8法检测细胞活性。2）U0126和PD98059分别对NOS-2基因表达的影响。实验分为5组，即NC组和处理组（U0126和PD98059分别2种不同浓度处理组）。24 h后，q-PCR法检测NOS-2基因表达量。

1.3.5 PKC对MEK/ERK通路的调控   1）药物对NOS-2基因表达的影响。细胞分为6组，分别为NC组、PMA组、U0126组、PD98059组、PMA+U0126组和PMA+PD98059组。24 h后，q-PCR法检测NOS-2基因表达。2）PMA对ERK1/2磷酸化的影响。细胞分为2组，即NC组和PMA处理组。处理24 h后，Western blotting法检测ERK1/2和ERK1/2磷酸化的程度。

应用低温等离子技术，可以对生物医学中的高分子材料进行表面镀膜、聚合、改性和修饰等，从而改善生物医用材料的亲水性、透气性等，通过优化人造移植材料的性能，推动医疗技术的发展。

1.4 方法

1.4.1 NO含量的检测   收集处理后的细胞上清液，按Griess Reagent试剂说明书进行标准操作。标准曲线绘制：用培养基将标准品稀释成不同浓度梯度的溶液，然后分别加入100 μL的试剂Ⅰ和试剂Ⅱ，充分混匀后，测定其在550 nm处的光密度（optical density，OD）值，根据不同浓度梯度的OD值绘制成NO测定标准曲线。

Qian Y, Li JP. Biological effects of nitric oxide in oncology[J]. Chin J Modern Oper Surg, 2011, 15(4):310-316.

1.4.2 RNA的提取和Real-time PCR   RNA的提取与逆转录、定量PCR的操作均按照厂家操作说明而完成。定量PCR的结果用2-ΔΔCt计算。内参基因选用磷酸甘油醛脱氢酶（glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH）。实验中所需引物序列见表1。

 

表1 引物序列Tab1 Sequences of primer

  

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Tca8113细胞（上海基尔顿生物科技有限公司）；RPMI-1640、Optimum培养基和胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）（Gibco公司，美国）；青霉素和链霉素（生工生物工程上海股份有限公司）；细胞培养载体（Thermofisher公司，美国）；Griess Reagent、PKC激动剂丙二醇甲醚醋酸酯（PMA）、MEK抑制剂PD-98059和U0126（Sigma公司，美国）；RNA提取试剂盒（北京康为世纪生物科技有限公司）；逆转录和实时定量荧光聚合酶链反应（quantitative realtime polymerase chain reaction，q-PCR）试剂盒（大连Takara公司）；实时定量扩增仪MX3000P（北京安捷伦公司）；转染试剂Lipofectamine RNA iMAX（Invitrogen公司，美国）。聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）引物和siRNA由上海吉玛生物设计和合成。

1.4.4 特异性siRNA干扰实验   细胞种植于培养载体（96孔板种植密度为每孔1×104个，60 mm培养皿种植密度为每皿1×106个）中，待细胞汇合率达到80%以上时进行细胞转染。转染前，10 μL的转染试剂 Lipofectamine RNA iMAX和10 μL siRNA分别加入到500 μL的Optimum中进行稀释后，将二者合并混匀并置于室温下孵育20 min。随后，去掉培养载体中细胞培养液，加入新鲜的RPMI-1640培养基和转染混合液进行24 h转染。转染后采用q-PCR方法检测转染效率，即分别检测目的基因在对照组和实验组中的表达量后，采用实验组与对照组的比值作为判定转染效率的方法。转染经预实验选用的特异性siRNA基因序列如下（表2）。

 

表2 特异性siRNA基因序列Tab2 Target sequences of siRNA

  

?

PMA对Tca8113细胞活性的影响见图2左。q-PCR检测NOS-2基因表达的结果表明，25 nmol·L-1（P<0.01，95%的置信区间分别为0.685~0.735）和50 nmol·L-1（P<0.05，95%的置信区间分别为0.587~0.621）两种浓度PMA分别作用于细胞，NOS-2的表达与PKC活性成负相关（图2右）。

党和国家监督体系中的审计监督作为权力监督和权力制约的一项制度安排和制度设计，其独特的政治逻辑在于其政治权力基础、政治体制优势和民主政治动因。国家审计(政府审计)是民主政治发展的根本要求。现代国家审计(政府审计)发展的深层次动因与其说是经济的，不如说是政治的，其最真实的动因来自政治民主化进程的推动。

1.5 统计学处理

采用SPSS 13.0统计软件对所有实验数据进行分析，两组间比较采用t检验分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。总体均值μ的95%置信区间的计算方法参照统计学应用。

2 结果

2.1 NOS-2/NO促进Tca8113细胞的增殖

Tca8113细胞转染NOS-2的siRNA 24 h后，q-PCR方法检测NOS-2基因表达量（图1左），Griess Reagent方法检测NO生成量（图1中）及CCK8法检测细胞增殖率（图1右）。由图1可见，当Tca8113细胞转染NOS-2的siRNA后，无论是NOS-2的基因表达水平（P<0.001，95%置信区间为0.371~0.392），还是其最终产物NO的含量（P<0.05，95%置信区间为5.970~6.530）均有显著降低，这说明转染成功。转染后细胞增殖检测结果可见，30%的降低率表明NOS-2/NO对Tca8113细胞的生长有促进增殖的作用（P<0.01，95%置信区间为0.612~0.781）。此外，NC组和MOCK组间差异均无统计学意义（P>0.05）。

  

图1 NOS-2的siRNA对Tca8113细胞中NOS-2基因表达量（左）、NO生成量（中）及细胞活性（右）的影响Fig1 The influence of siRNA-NOS-2 on the expression of NOS-2 (left), NO product (middle) and cell viability (right) in Tca8113 cells

2.2 PKC负调控NOS-2的表达

1.4.5 Western blotting实验   待测细胞以PBS润洗3遍后，4 ℃条件下经1 mL RIPA裂解液（上海碧云天生物技术有限公司）处理10 min，提取细胞总蛋白。BioRad Protein Assay kit检测蛋白浓度。100 ℃ doublestrength sample buffer（2×上样缓冲液）条件下煮沸5 min后，取35 μg总蛋白行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）。待电泳完成后，将蛋白电转移至聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜（GE Health Care公司，英国）。用1%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）封闭1 h后，加Ⅰ抗4 ℃条件下过夜孵育。TBST洗涤缓冲液洗膜后，用HRP标记的Ⅱ抗（1︰5 000 dilution）室温条件下孵育2 h。最后，用化学发光试剂检测并进行仪器分析条带。

  

图2 不同浓度PMA对Tca8113细胞活性（左）及NOS-2基因相对表达量（右）的作用Fig2 The effect of PMA on cell viability (left) and NOS-2 expression (right) in Tca8113 cells

2.3 PKC-α、PKC-β和PKC-δ三者共同参与NOS-2的调控

在Tca8113细胞中，PKC各种亚型的表达情况通过q-PCR检测后，只有PKC-α、PKC-β和PKC-δ有表达，其他亚型均不表达或低量表达。由图3可见，两种不同转染方式处理细胞24 h后的效果均很明显。PKC-α、PKC-β和PKC-δ三种亚型的转染效率，无论是单独转染，还是共同转染的结果均有统计学意义（P<0.05）。在以上两种转染方法处理条件下，q-PCR检测NOS-2基因表达的结果表明，PKC-α、PKC-β和PKC-δ三种PKC亚型共同参与NOS-2基因表达的调控（图3右，P<0.01，95%的置信区间为2.117~2.652）。此外，NC组和MOCK组间差异均无统计学意义（P>0.05）。

2.4 MEK/ERK通路负调控NOS-2的表达

遵循权威性、严谨性和完整性三大原则，本文的政策样本主要来自于北大法宝法律数据库和北京市环境保护局门户网站。在北大法宝法律数据库中，将发布部门设置为北京市，以“机动车”、“车辆”、“汽车”、“交通”等作为关键词，检索时间设置为2013-2017年。在北京市环保局门户网站中，以“权威发布”栏目为主要信息来源，从中筛选出2013-2017年与机动车污染防治相关的规范性文件。共搜集政策文本56份，经筛选确定本研究的样本47份，形成政策一览表（如表1）。

本次研究结果显示，疾病疗效的总有效率，试验组为96.40%，对照组为94.55%，非劣效检验成立，试验组不劣与对照组。咳嗽起效时间的组间比较，差异有统计学意义（试验组＜对照组），提示试验组较对照组能缩短咳嗽起效时间。两组中医证候疗效、单项症状及体征的消失率的组间比较，差异均无统计学意义。试验期间，试验组未发生不良事件。综上可认为，在头孢呋辛酯干混悬剂基础上，应用止咳橘红颗粒对小儿急性支气管炎（痰热壅肺证）的病情改善作用不劣于金振口服液，且具有更好的止咳对症治疗作用，临床应用的安全性较好。

  

图3 PKC三种亚型个体或共同转染效率及对NOS-2基因相对表达量的影响 Fig3 The individual treatment and co-treatment transfection ratio of PKC-α, PKC-β and PKC-δ and transfection effect on NOS-2 expression in                        Tca8113 cells

  

图4 PD98059和U0126对细胞活性的影响和NOS-2基因表达的作用Fig 4 The effect of PD98059 and U0126 on cell viability and NOS-2 expression in Tca8113 cells

2.5 PKC通过MEK/ERK通路负调控NOS-2的表达

Tca8113细胞经过不同浓度的药物处理后，q-PCR检测NOS-2的基因表达，与2.2和2.4相一致，PMA能够降低NOS-2的表达量（P<0.05），而U0126（P<0.01，95%的置信区间为1.441~1.824）和PD98059（P<0.05，95%的置信区间为1.032~1.491）均能够抑制PMA所引起的NOS-2表达量的降低（图5左）。在PMA的作用下，Western blotting蛋白检测结果显示，ERK磷酸化程度显著升高（图5右，P<0.05，95%的置信区间为2.390~3.011）。以上结果表明，PKC通过MEK/ERK通路负调控NOS-2的表达。

  

图5 PMA、U0126和PD98059对NOS-2基因表达的影响及PMA对ERK1/2磷酸化的影响Fig 5 The effect of PMA, U0126 and PD98059 on NOS-2 expression, the influence of PMA on the phosphorylation of ERK1/2

3 讨论

作为近些年来各国学者致力于研究的小分子明星物质，NO在机体内参与了各类生理与病理上的调控过程。研究[2]证明，在肿瘤的发生、转移和侵袭等过程中也出现了NO的身影并扮演重要的角色。NOS作为机体内催化合成NO的关键酶，按其产生部位和功能可以分为3种类型：神经元型（nNOS）、诱导型（iNOS）和内皮型（eNOS）。常用基因名称为NOS-1、NOS-2和NOS-3。作为非钙离子依赖性的关键酶，NOS-2的活性直接影响NO生成量和生物学反应。尽管国内外已发表过各类关于NOS-2生成的NO和肿瘤二者关系的文章，但是说法不一，各有所据[3]。PKC广泛分布于各类组织和器官的细胞当中。当细胞受到外来刺激，如细胞病变、外源物药物等，PKC在Ca2+和二酰甘油（diacylglycerol，DAG）的协同作用下，激活后产生多种生物学作用。尽管很多学者[11-12]一直在努力阐述PKC和肿瘤的发生、增殖和转移等生理现象密切相关，但是关于口腔鳞癌中PKC作用的报道并不常见。作为传递丝裂原信号的信号转导蛋白，ERK及其家族的成员共同构成Ras-Raf-MEK-Erk三级酶促级联反应信号通路。该通路已被证实参与机体内多种生物学调控途径。在肿瘤方面，MEK/ERK通路调节着细胞的增殖、分化和存活等，是多种生长因子的下游蛋白，在肿瘤侵袭和转移过程中起到放大信号的作用。作为MEK/ERK通路激活途径之一，PKC的很多生物学功能是通过激活MEK/ERK通路而实现的[13]。同时，关于PKC和NOS-2二者关系、MEK/ERK通路和iNOS相互作用的文章也屡见不鲜[14-15]。基于以上事实研究基础，本研究选取舌鳞癌Tca8113细胞为研究对象，利用分子生物学手段，进一步探索舌鳞癌Tca8113细胞中NOS-2、PKC、MEK/ERK三者的关系以及对细胞增殖的影响。

据报道，NO和肿瘤细胞的增殖有着密切的关系，高浓度的NO可以抑制肿瘤细胞的增殖，反之，低浓度则促进增殖[3]。本实验的结果表明，当细胞转染NOS-2的siRNA后，NO的生成量和细胞的增殖活性均有不同程度的降低。这一发现与杨岚等[16]研究结果一致，进一步证实了NO对Tca8113细胞的增殖有促进作用。作为小分子物质的NO，其在体内受到多种方式的调控，包括PKC和MEK/ERK通路。为了验证在Tca8113细胞中这种调控现象是否也存在，笔者分别使用了PKC的激动剂PMA和MEK/ERK通路的抑制剂U0126、PD98059作用细胞。当PKC被PMA激活时，细胞内NOS-2的mRNA表达量依剂量地降低。而用U0126和PD98059两种药物特异性地抑制MEK/ERK通路时，细胞内NOS-2的含量却依剂量地升高。研究结果表明：PKC和MEK/ERK通路分别负调控Tca8113细胞内NOS-2的基因表达。在此研究基础上，进一步探索另外两个问题：PKC的哪些亚基参与到NOS-2的调控；PKC是否通过MEK/ERK通路而实现对NOS-2的负调控。为了解决第一个疑问，实验中，检测了Tca8113细胞中所有可能存在的PKC亚型。q-PCR的结果表明，只有PKC-α、PKC-β和PKC-δ三种亚型表达，其他亚型均不表达或极少量表达。随后，使用siRNA对3种亚型进行了基因沉默。从结果可见，PKC-α、PKC-β和PKC-δ三种亚型单独转染细胞后，NOS-2的表达均不受到任何影响。但是，3种亚型共同转染细胞后，NOS-2的表达量则明显得到提升。这一结果表明：PKC-α、PKC-β和PKC-δ三种亚型共同参与对NOS-2的表达调控。对于第二个疑问，实验中发现，MEK/ERK通路抑制剂U0126和PD98059均可以抑制PKC激动剂PMA所引起的NOS-2的低表达。与此同时，Western blotting蛋白检测的结果显示, ERK1/2的磷酸化程度在PMA的作用下也都得到了明显的提升。以上结果证实：PKC通过MEK/ERK通路负调控Tca8113细胞中NOS-2的基因表达。

现阶段，油田已经进入了云计算时代，其已经由原本的传统架构转变成为云架构。油田的云架构可以被进一步的分成两个层次，其分别是油田云数据中心，还有油田云业务中心。需要把各个采油厂的数据中心整合在一起，构成一个统一化服务的数据中心平台，打造出一个油田服务器的资源池，帮助其给公司以及下属采油厂提供更为精确且完整的数据服务，逐步的将其迁移到油田云数据的中心平台上，集中性的管理信息系统。合理的使用ERP、A2、A5等数据信息，各类系统都应当以公共技术平台为基准，将其信息系统整合成为一些信息组合体，将其效能更为精准的展现出来。

综上所述，在舌鳞癌Tca8113细胞中，初步证实了NO可以促进细胞的增殖，同时，PKC通过MEK/ERK通路负调控NOS-2的表达。这一结果的证实或许会为舌鳞癌治疗药物的研究和开发提供理论上的依据。然而，PKC三种亚基PKC-α、PKC-β和PKC-δ如何共同调控NOS-2表达以及三者之间是否存在某种联系和相互作用还需要进一步研究。通过本实验结果，可以初步假设：PKC-α、PKC-β和PKC-δ三种亚型是“串联”在一起共同调控NOS-2的表达，三者缺一不可。所以，为了验证这个假设的正确性，可以运用药物和基因技术抑制或过表达三种亚型中的一种或两种，观察其他亚型的基因水平和蛋白磷酸化水平，从而探寻三种亚型之间是否存在潜在的通路和相互作用。

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待测样本NO浓度测定：取100 μL待测样本，分别加入100 μL的试剂Ⅰ和试剂Ⅱ，测定550 nm处OD值，然后根据标准曲线计算出待测样品中NO的含量。

MEK抑制剂U0126和PD98059对Tca8113的细胞活性均具有统计学意义（P<0.05，图4左和中）。由图4可见，不同浓度的U0126和PD98059分别作用细胞后，q-PCR检测NOS-2基因表达的结果表明，在Tca8113细胞中，NOS-2的表达受MEK/ERK通路的负调控（P<0.05，5和10 μmol·L-1 U0126 95%的置信区间分别为2.352~2.931和3.174~3.716；25和50 μmol·L-1 PD98059 95%的置信区间分别为1.797~2.209和3.811~4.423）。

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夯实水泥土桩技术一般适用于地下水水位以上的黏性土、素填土、杂填土、粉土等地基的加固[3]。夯实水泥土桩主要有以下作用：（1）成桩夯实过程中，挤密桩间土可以在一定程度上提高桩周土的强度；（2）该桩基由水泥土夯实成桩，且水泥与土混合后可产生离子交换等物理化学反应，使桩体具有较高的强度和水硬性，可以使处理后的复合地基的强度和抗变形能力明显提高。

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人工开挖孔桩之前必须进行成孔工艺试验，并且数量应在两个以上，检验孔桩内壁是否出现土层坍塌、涌砂等现象，同时检验混凝土护壁是否达到预期效果。

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4月14日早晨，正在青海省海南州同德县调研水利工作的青海省水利厅厅长于丛乐一行得悉玉树州结古镇发生7.1级地震后，立即就近在兴海县唐乃亥乡召开紧急会议，部署抗震救灾工作。他要求青海省水利厅迅速查清玉树地区水电站等水利设施受损情况，并带队从兴海县出发立即赶赴灾区展开抗震救灾工作。

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在吉老师的引领下，学生与文本进行跨越时空的心灵对话，学生、文本、教师、编者四者之间的情感得到了交流和沟通，整个课堂也在心灵的对话和情感的交流中活力四射。

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G市遏制腐败增量效果并不理想，腐败案件呈上升趋势。据调研数据显示，总体来看，2017年，全市共受理群众举报9147件，同比增加23.5%；处置问题线索4887件，同比增加18.4%。其中，初步核实线索4556件，同比增加25.8%，初核转立案1690件，同比增加49.0%；立案1917件，涉及1924人，同比分别增加42.6%和43.2%；结案1861件，同比增加38.3%；处分1725人，同比增加39.2%；从基层视角看，2017年全市立案涉及镇(街)、农村基层的案件855件，增加32.1%。其中，关于扶贫领域违纪违法问题线索61条，查结48件，立案审查25件。