牙周病是成人失牙最主要的原因，其特征是牙槽骨的病理性吸收。菌斑微生物及其毒性产物是引发牙周病必不可少的始动因子，消除细菌感染、促进新骨形成是牙周再生治疗的重点。米诺环素（minocycline，又名二甲胺四环素）是一种半合成的盐酸四环素族药物，给药后吸收迅速、完全，组织穿透力强，生物利用度高[1]，对牙周致病菌有较强的抑制作用，还可抑制基质金属蛋白酶的活性[2]，抑制破骨细胞活性、减少骨吸收[3-4]，促进牙周组织再生[5]等。但常规用药剂量较大，易产生耐药和菌群失调等不良反应，亚抗菌剂量的四环素作为宿主免疫调节剂治疗慢性牙周病在临床实验中显示出了良好的治疗效果[6-7]。1 μg·mL-1是口服标准剂量米诺环素后常见的血浆和龈沟液内药物浓度，具有一定的抑菌作用。任蕾等[8]通过药物筛选试验发现：米诺环素对牙龈卟啉单胞菌、中间普氏菌、具核梭杆菌等的最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）为0.25 μg·mL-1，对黏性放线菌的MIC为1 μg·mL-1。国外研究表明，米诺环素对伴放线放线杆菌的MIC为0.25 μg·mL-1[9]，对齿垢密螺旋体的MIC<0.125 μg·mL-1[10]。口服标准用量米诺环素后，1 h血浆药物浓度约1.37 μg·mL-1，2 h达峰值2.18 μg·mL-1，相应的龈沟液内药物浓度分别为0.75、1.45 μg·mL-1，唾液药物浓度分别为0.2、0.31 μg·mL-1[11]。 

牙周膜细胞（periodontal ligament cell，PDLC）是牙周再生的主要细胞。研究[12]发现，一定浓度的米诺环素可以促进PDLC的增殖和蛋白合成等生物活性，促进牙周新附着的形成。葛少华等[13]还发现，米诺环素可以提高PDLC的碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性，促进其向成骨转化的趋势。成骨细胞是骨形成的主要功能单位，其增殖和分化等生物活性控制着骨的形成，促进成骨细胞的增长是有效修复骨缺损的关键因素[14]。研究[15]发现，在牙周骨缺损的修复过程中成骨细胞增生活跃，紧密排列在骨小梁表面，并可见新骨和结缔组织形成。由此可见，成骨细胞也参与了牙周骨缺损的再生和修复过程。但是目前关于米诺环素和成骨细胞的研究相对较少。如果米诺环素在维持有效抑菌活性的同时对成骨细胞的功能活性也具有一定的促进作用，对于牙周骨缺损的修复治疗效果将更加理想。因此本实验拟通过米诺环素与成骨细胞共培养，探讨抑菌浓度的米诺环素对成骨细胞的影响，为牙周病引起的骨缺损修复治疗提供更多的参考和依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物

选取由重庆医科大学动物实验中心提供的新生SD鼠（≤3 d）5只，雌雄不限，实验过程中对动物的处置符合伦理学要求。

1.2 主要试剂和仪器

盐酸米诺环素、Ⅱ型胶原酶（Sigma公司，美国），CCK-8试剂盒（日本同仁公司），0.1%TritonX-100、ALP活性检测试剂盒（上海碧云天生物技术公司），电解质分析仪（南京攀事达电子仪器有限公司），荧光定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）检测试剂盒（Takara公司，日本），α-MEM培养基、PBS（Hyclone公司，美国），β-甘油磷酸钠、维生素C和茜素红S（北京索莱宝科技有限公司），荧光定量PCR仪（Bio-Rad公司，美国），酶联免疫吸附测定法（enzyme-linked immunosorbent assa，ELISA）试剂盒（北京Bioss公司），倒置相差显微镜（Nikon公司，日本）。

1.3 实验方法

1.3.1 培养基的配置   基础培养基：α-MEM培养基+10%胎牛血清+1%青-链霉素；成骨诱导培养基：基础培养基+50 μg·mL-1维生素C+10 mmol·L-1 β-甘油磷酸钠+10 nmol·L-1地塞米松；不同浓度的米诺环素：用成骨诱导培养基将米诺环素配置为5个浓度组（0、0.1、0.5、1、10 μg·mL-1）。

缺氮矫正技术：合理确定氮肥施用量和施用时期，按目标产量和土壤速效氮含量水平确定氮肥用量，一般每年每株柑橘施纯氮0.5-1.2千克，分3-4次施用；一般用尿素1%-1.5%水溶液进行叶面喷施，最好是下午4时以后施用。

1.3.3 细胞增殖活性检测   将生长良好的第4代成骨细胞以每毫升2×104个接种于96孔板，每孔100 μL，次日换液。将各浓度组含米诺环素的培养基分别加入96孔板（0 μg·mL -1为对照组，其余各组为实验组），37 ℃、5%CO2条件下孵育，倒置相差显微镜观察细胞形态，分别于培养的1、3、7 d按照试剂盒操作说明每孔加入CCK-8检测液10 μL，37 ℃、5%CO2条件下孵育3 h，于450 nm处测定各组光密度（optical density，OD）值。

1.3.4 ALP活性检测   成骨细胞以每毫升2×104个接种于24孔板，每孔1 mL，次日换液，分组同前。分别于培养的3、7 d行ALP活性检测。ALP活性检测采用0.1%TritonX-100获得细胞裂解液，按照ALP活性检测试剂盒进行检测，于405 nm处测定各组OD值。

1.3.5 骨桥蛋白（osteopontin，OPN）含量检测    细胞培养及分组同1.3.4，收集7 d的细胞上清液，按照ELISA试剂盒操作说明，于450 nm处测定各组OD值，根据标准品标准曲线计算出蛋白含量。

采用SPSS 17.0软件对实验数据进行统计分析，组间差异比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD多重检验法。P＜0.05表示差异有统计学意义。

1.3.7 矿化结节染色   细胞培养及分组同1.3.4，于21 d弃培养基，PBS漂洗2~3次，4%多聚甲醛室温固定30 min，PBS振荡清洗5次，每次5 min，每孔加入茜素红S染液200 μL，37 ℃摇箱孵育30 min，PBS清洗2~3次，每次5 min，镜下观察拍照。

1.3.8 荧光定量PCR   成骨细胞以每毫升2×104个接种于6孔板，次日换液。分组同前，于第7天按总RNA提取试剂盒操作说明提取各组总RNA，按照cDNA合成试剂盒将所得总RNA逆转录为cDNA，荧光定量PCR反应参照试剂盒（TakaRa No.RR820A），目的基因为ALP、Runt相关转录因子2（Runt-related transcription factor 2，Runx2）、OPN，内参为βactin。引物序列如下。ALP上游引物序列：5’-CTC CATCTTTGGTCTGGCTCC-3’，下游引物序列：5’- CATTTTCCCGTTCACCGTCC-3’；Runx2上游引物序列：5’-CCAACTTCCTGTGCTCCGTG-3’，下游引物序列：5’- TCGTTGAACCTGGCTACTTGG-3’；OPN上游引物序列：5’-TTCACTCCAATCGTCCCTACAG-3’，下游引物序列：5’-TCCTTAGACTCACCGCTCTTCAT-3’；β-actin上游引物序列：5’- AGATTACTGCTCTGGCTCCTAGC-3’，下游引物序列：5’- ACTCATCGTACTCCTGCTTGCT-3’。反应条件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40个循环；95 ℃ 10 s；65 ℃ 5 s，95 ℃ 5 min。

1.4 统计学分析

1.3.6 钙含量检测   细胞培养及分组同1.3.4，收集21 d的细胞培养基，使用电解质分析仪检测细胞基质总钙含量。

2 结果

2.1 成骨细胞原代培养和鉴定

成骨细胞分化成熟后多层重叠生长形成结节样结构，并不断分泌基质和矿物质，形成矿化结节。茜素红染色等方法可以观察矿化结节的形成情况，测定成骨细胞的钙化程度。由于本实验采用了成骨诱导培养基，β-甘油磷酸钠经ALP的水解作用释放出磷离子，有利于矿物盐的沉积和矿化结节的形成，故对照组和各实验组均可见橘红色钙化结节形成。其中0.1、0.5、1 μg·mL-1组的矿化结节和钙含量均多于对照组；而10 μg·mL-1米诺环素形成的矿化结节少而散在，钙含量也较对照组低。表明适宜浓度的米诺环素对成骨细胞的矿化能力有一定的促进作用。

  

图1 成骨细胞原代培养和鉴定 倒置相差显微镜 Fig1 Primary culture and identification of osteoblasts  inverted                         microscope

2.2 米诺环素对成骨细胞增殖的影响

成骨细胞的增殖活性随培养时间的增加而增高，1、3 d时，0.5、1 μg·mL-1组的细胞增殖活性均高于对照组（P<0.05）。7 d时，0.1、0.5、1、10 μg·mL-1组的细胞增殖活性均高于对照组（P<0.01），其中1 μg·mL-1为最大促增殖浓度，10 μg·mL-1组的细胞增殖效应较1 μg·mL-1组有所下降（图2）。表明一定浓度的米诺环素可以促进成骨细胞的增殖，而随着浓度的增加这种促增殖作用开始下降。

有些行业设计规范对使用高强钢筋无明确的强制性要求，设计人员也就依照固有的设计理念进行工程设计。此外，随着城镇化的推进和对各类基础设施的持续投入，设计院承担的任务也日益繁重，设计人员已经习惯于采用335 MPa钢筋，若在图纸设计中全面推广应用高强钢筋，则整套设计思路需要改变，对各种应力、强度、安全系数等参数要重新进行计算、试验和验证，因此，设计人员在主观上不愿投入精力将高强钢筋的应用研究融入到设计工作中。

  

图2 米诺环素对成骨细胞增殖的影响Fig2 Effect of minocycline on the proliferation of osteoblasts

2.3 米诺环素对成骨细胞ALP活性的影响

[2]  包柳明, 叶皓玫. 米诺环素对慢性牙周炎龈沟液中MMP-2及其TIMP-2的影响及疗效观察[J]. 放射免疫学杂志, 2013, 26(4):530-532.

  

图3 米诺环素对成骨细胞ALP活性的影响Fig3 Effect of minocycline on osteoblasts ALP activity

2.4 OPN含量检测

0.1 、0.5 μg·mL-1组OPN表达量与对照组差异无统计学意义（P>0.05），1 μg·mL-1组蛋白表达量高于对照组（P<0.01），10 μg·mL-1组蛋白表达量明显低于对照组（P<0.01）（图4）。

2.5 钙含量检测

米诺环素处理21 d后0.1、0.5、1 μg·mL-1组钙含量高于对照组（P<0.05），10 μg·mL-1组钙含量较对照组明显降低（P<0.01）（图5）。

2.6 矿化结节染色

倒置显微镜下观察可见细胞呈多层重叠生长，各组细胞间均可见橘红色矿化结节，与对照组相比，0.1、0.5、1 μg·mL-1米诺环素可以促进成骨细胞钙盐沉积和矿化，其中以1 μg·mL-1促进效果最佳，矿化结节形成较多；10 μg·mL-1组则表现出一定的抑制作用，形成的矿化结节少而散在（图6）。 

  

图4 OPN表达检测Fig4 Expression of OPN

  

图5 钙含量检测结果Fig5 Results of calcium content

  

图6 成骨细胞茜素红染色结果 茜素红染色 × 100Fig 6 Alizarin red staining results of osteoblasts alizarin red staining × 100

2.7 荧光定量PCR

1 μg·mL-1米诺环素可以上调成骨细胞相关基因Runx2、ALP、OPN mRNA的表达，与对照组相比差异有统计学意义（P<0.01）；0.1、0.5 μg·mL-1组可以上调Runx2、ALP mRNA表达水平（P<0.01），10 μg·mL-1组相较于对照组Runx2 mRNA表达水平上调，ALP和OPN mRNA表达水平下调，其中OPN与对照组相比差异有统计学意义（P<0.01）（图7）。

岩矿鉴定显示，自然金为金黄色，银金矿多为黄色—淡黄色。金矿物随银含量的增高而颜色变淡。其形态以尖角粒状为主，其次为枝叉状、麦粒状等。金矿物粒度，矿石以微粒金、细粒金为主，少量中粒金、粗粒金及巨粒金(表2)。

  

图7 成骨细胞相关基因mRNA表达水平Fig7 Gene expression level of osteoblasts

3 讨论

研究[17]发现米诺环素可以有效减少牙松动度、牙龈指数及牙槽骨吸收等。刘迪等[5]指出：米诺环素脂质体控释凝胶能够改善牙周组织病变，制抑单核细胞和破骨细胞的数量，并可促进新牙周纤维及新骨的生成。近期有学者[18]提出米诺环素可以促进间充质干细胞的增殖、迁徙、细胞外基质的附着以及黏附因子、生长因子的释放等，从而调节其再生能力。

分析反思：妙妙最近对“洞”有了兴趣，连续几天都在美工区研究这个纸杯子。今天我握着杯子的模样，激发了她的生活经验，选择了跟经验很接近的蓝色表示水，而且她把纸折了折塞进杯子里，制造了一种“满”的感觉。妙妙在整个过程中只有戳洞的环节遇到了困难，我发现她的大肌肉力量有待更好的发展，在以后的日常生活中可提供更多的机会，帮助妙妙发展上肢的大肌肉力量，如搬桌子、椅子等。

成骨细胞是骨形成的主要功能单位，能合成有机基质并调节矿化过程。刺激成骨细胞增殖并促进其分化成熟是调节骨代谢、促进新骨形成、修复骨缺损的重要方法。CCK-8法是检测细胞增殖的指标，可以反映生活细胞的代谢水平。本研究采用CCK-8法检测米诺环素对成骨细胞增殖活性的影响，结果显示米诺环素在0.1、0.5、1 μg·mL-1时对体外培养的成骨细胞有明显的促增殖作用，1 μg·mL-1时对成骨细胞有最大促增殖作用，当浓度为10 μg·mL-1时，促增殖效应开始下降。表明一定浓度的米诺环素能促进成骨细胞的增殖，达到高浓度后具有一定细胞毒性，具有抑制细胞增殖的趋势。

ALP是成骨细胞分泌的一组膜结合糖蛋白，是成骨细胞早期分化的特异性标志，在硬组织的形成及矿化中有重要作用。ALP活性的高低，能较客观地反映成骨细胞分化成熟的程度。Runx2是调节成骨细胞分化和骨形成的关键转录因子，是骨形成过程中最具特征性的标志物。本实验中，通过ALP活性检测及荧光定量PCR两种方法检测了米诺环素对成骨细胞分化的影响，取得了一致的结果。在最初的3 d，ALP活性值较低，分析可能与细胞正处于增殖阶段，尚未分化有关。随后ALP活性值开始增加，且ALP mRNA、Runx2 mRNA表达量和ALP活性值均在1 μg·mL-1时具有最大值；而10 μg·mL-1组ALP活性值及ALP mRNA水平均低于对照组。分析米诺环素促进成骨细胞ALP活性的原因可能是：1）与促进细胞增殖有关，成骨细胞数量的增加，分泌的ALP也随之增加；2）上调ALP mRNA表达水平，促进ALP的分泌，调节成骨细胞的分化；3）上调Runx2 mRNA表达水平。有实验证明Runx2能调节多种成骨细胞特异性标志物的表达[19]。OPN是成骨细胞分化中晚期的主要功能蛋白和标志物，具有钙离子螯合作用，是骨基质矿化中非常重要的非胶原蛋白。本实验通过ELISA法和荧光定量PCR两种方法检测了各组OPN的表达情况，结果显示1 μg·mL-1米诺环素可以上调OPN mRNA和蛋白的表达，10 μg·mL-1组蛋白和基因表达量较其他各组明显降低。

原代培养第3天，倒置相差显微镜下见成骨细胞从碎骨块周围爬出，呈放射状贴壁生长，形态不规则，呈多边形或三角形，有较多突起，单核卵圆形，1~2个核仁，胞质丰富清晰，ALP染色呈阳性，蓝黑色颗粒沉积在胞浆及细胞核ALP活性部位（图1）。

综上所述，本实验研究了抑菌浓度的米诺环素对成骨细胞的影响，结果发现0.1、0.5、1 μg·mL-1的米诺环素可促进成骨细胞的生物活性，其中1 μg·mL-1具有最大促进作用，不仅可以增加成骨细胞的数量，还能上调成骨相关基因Runx2、ALP及OPN mRNA的表达，增加ALP活性和骨基质的矿化。由此推测适宜浓度的米诺环素具有良好的抑菌作用和促进成骨双重作用。研究[20]表明，米诺环素对多种牙周致病菌有较强的抑菌作用，其抑菌作用随浓度增加而增强。但本实验发现随着浓度的增加，米诺环素对成骨细胞生物活性的促进作用开始下降，当浓度为10 μg·mL-1时则出现了一定的抑制作用。这也为进一步研究米诺环素用于牙周病导致的骨缺损的治疗奠定了基础，后续本实验组将通过局部用药载体的研究及动物模型进一步研究其机制和实用价值。

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3 d时，米诺环素对ALP活性有一定的抑制作用，各浓度组ALP活性值均低于对照组，0.1 μg·mL-1和10 μg·mL-1组与对照组间差异有统计学意义（P<0.01），0.5 μg·mL-1和1 μg·mL-1组与对照组间差异无统计学意义（P>0.05）。7 d时，0.1 μg·mL-1和1 μg·mL-1组ALP活性值均高于对照组且差异有统计学意义（P<0.01），1 μg·mL-1时达最大促进效应，10 μg·mL-1组ALP活性值低于对照组（P<0.01）（图3）。

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近年评书最开始是站在桌子后面，桌上放着折扇和醒木，表演者一袭长衫，“范儿”味十足。不知是否因为广播评书的出现，切断了传统模式中表演者与观众之间的视觉联系——表演形式被去繁化简，桌子没了，扇子没了，长衫没了，只是搞不懂，那个标志性的醒木怎会一同消失。

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二是从可行性角度而言，域外国家规章司法审查的实践经验，特别是行政诉讼制度较为发达的西方国家对于行政规章的司法监督方面的具体做法可以给我们提供有益的借鉴，并且将政府规章纳入行政诉讼附带审查并不影响现有司法体制和行政体制的运行与衔接，目前法院在行政诉讼审判依据中将规章作为“参照适用”的定位，本身在某种程度上就有一种“审查”的意味，将规章纳入行政诉讼附带审查也是目前司法体制可以承受的范围，没有改变人民代表大会这一根本政治制度，也不是西方意义上的“三权分立”，根本上都是全面深化依法治国、将权力纳入监督视野的必要举措。

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在经典文氏桥振荡器并联RC网络的电阻支路上串联一个二极管—电感并联网络,可构成一种改进型文氏桥混沌振荡器,如图2所示。

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学习语言需要了解和体会一种语言所蕴含的文化，因此要更好地学习英语，必须了解英语的文化。课堂教学中教学材料的安排、教学活动的安排设计应该把语言材料和活动的交际性、跨文化体验及语言认知作为重要的原则。教师可以补充大量现实生活中的语言材料，利用多媒体在小学英语课堂的应用，选取时下流行的几部英文动画片，在学生观看影片的时候，对英语国家特定情境下特殊的表达进行讲解。

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1.3.2 乳鼠颅顶骨成骨细胞原代培养   成骨细胞原代培养方法参照文献[16]，结合组织块法和二次酶消化法并稍作改进。5只SD大鼠在75%乙醇中浸泡10 min，无菌条件下剪开头部皮肤，沿骨缝小心分离、取出颅顶骨，置于盛有PBS缓冲液的培养皿漂洗2~3次，小心去除附着的骨膜和结缔组织，剪碎成1 mm×1 mm的碎骨块，加入1 mg·mL-1Ⅱ型胶原酶37 ℃水浴消化1 h，加入0.25%胰酶继续消化30 min，1 000 r·min-1离心4 min，弃上清，将碎骨块均匀接种于T25培养瓶，加入基础培养基，37 ℃、5%CO2孵箱孵育，1周换液2次，待细胞融合约80%时传代，换用成骨诱导培养基。取第3代细胞通过ALP染色和形态观察行成骨细胞鉴定，取生长良好的第4代细胞用于实验。

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1999年，爱彼进入中国市场。在精简的通路策略下，据统计，到2018年6月，爱彼目前在中国大陆仅设有6家专卖店。在这种情况下，如何利用合适的线上渠道，广泛但精准的触达更多中国新兴中高产阶级人群，是爱彼的第一层需求。

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当前，水资源管理方面的法律制度体系已初步形成。主要包括：法律层面的《中华人民共和国水法》（以下简称《水法》）；法规层面的《取水许可和水资源费征收管理条例》、《河北省实施 〈水法〉办法》；规章层面的《建设项目水资源论证管理办法》、《取水许可管理办法》、《河北省取水许可制度管理办法》、《河北省水资源费征收使用管理办法》和《河北省全社会节约用水若干规定》，这些制度为规范地下水开采行为，缓解地下水超采起到了一定作用。

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1）2013年10月前，对应段落也发生路面起拱和隧道底板冒水并影响路面结构，2013年11月重新施作路面结构层并增加横向排水盲沟，现阶段实际情况表明，隧道底板冒水已经终止，但路面起拱依然存在，可以排除水压力影响；

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3.毛毡材料具有可再生性。羊毛是一种天然材料，因此它是一种可以自然降解并且不会对自然环境造成负担的可再生资源。

爸爸欠了别人半年的工资，不是一个人，是村里很多人，易非由一个高高在上的施与者，变成了一个受与者。妈妈把爸爸的材料和钢构变卖了，折旧卖给了他的老同学，只回了四万块钱，妈妈一人给了一点儿，意思了一下。