近年来，随着空气污染的加重，尤其是细颗粒物（PM2.5），已严重威胁到公众的健康，其已成为世界各地学者的研究热点。PM2.5（particulate matters 2.5，PM2.5）是空气动力学直径≤2.5m的细颗粒物，主要来源于工业生产、汽车尾气、秸秆焚烧等，故其成分十分复杂，因其粒径小，比表面积大，易携带大量有毒有害物质（如重金属、微生物等），且在大气中停留时间长，输送距离远，可进入呼吸道深部，并沉积于各级支气管、肺泡，进而进入血液循环，对人群，尤其是老年群体造成严重的危害[1]。大量研究证实，PM2.5含量与呼吸系统疾病、心血管疾病、糖尿病、肿瘤等众多老年相关疾病的发病率和死亡率呈正相关[2-4]。目前认为PM2.5的作用机制主要是通过吸入肺部的颗粒物引发炎症和氧化应激等反应导致系统性炎症反应以及神经调节改变，从而引发一系列系统损伤，但对PM2.5诱导凋亡的研究相对较少，故本文以人支气管上皮（humanbronchial epithelial，HBE）细胞作为研究对象，研究PM2.5暴露对HBE细胞凋亡作用的影响，为预防和治疗 PM2.5引起的呼吸系统疾病提供实验和理论基础。

由于运动副连续接触，使运动副的销轴与套圈中心始终保持运动副间隙的距离.可以将各运动副间隙假设为无质量的刚性杆.刚性杆长度为运动副间隙量，即r=(r1,r2,r3,r4)，各刚性杆与X轴正方向的夹角称为运动副间隙角，记为α=(α1,α2,α3,α4).用刚性杆表示运动副间隙，运动副间隙角反映销轴与套圈的接触位置的变化.

1 材料和方法

1.1 主要仪器 CO2培养箱 (新加坡Esco)；倒置显微镜（德国Leica）；酶标仪 (美国BioTek)；流式细胞仪（美国BD）；蛋白电泳仪（美国Biorad）、凝胶成像仪(美国Biorad)；低温高速离心机 (美国Beckman)。

1.2 主要试剂 胎牛血清 (Gibco)，DMEM培养基 (凯基)，胰酶（Gibco），CCK-8试剂盒 (Zomanbio)，活性氧检测试剂盒(碧云天)，凋亡试剂盒（Invitrogen），抗 -actin(Affinity)，Bax(Abcam)，Bcl-2(Abcam)，caspase-3(Abcam)抗体，山羊抗兔（碧云天），蛋白预染Marker（碧云天），脱脂奶粉（生工），蛋白定量试剂盒 (碧云天)，RIPA裂解液（碧云天）。

1.3 PM2.5的采集与制备 具体方法和步骤[5]。

两化融合能有效推动技术进步、提升生产效率，推动我国经济提质升级。假设检验结果充分说明，第二产业两化融合发展水平与投入产出比、人均工业增加值、全要素生产率呈现显著的正相关关系(如图8)。这表明，两化融合的深入推进，伴随着固定资产投资效率的不断提升、劳动生产率的不断增长，还伴随着技术进步的快速发展。因此，两化融合对于处理好我国经济发展速度与质量的关系，实现质量提升“对冲”速度放缓，将经济发展推向质量效益时代具有重大意义。

1.7 Annexin V-Alexa Fluor488/PI双标记流式细胞术检测细胞凋亡 以每孔1×106个细胞接种于6孔板内，分组和处理同上，24 h后收集细胞，冷 PBS洗涤1次，用 annexin-binding buffer重悬稀释细胞至1×106个/mL，然后每100L细胞悬液加入5L AlexaFluor488和1L碘化丙啶 (propidiumiodide，PI)，室温避光孵育15 min后，加入400L annexin-binding buffer混匀，立即以流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

2.3 PM2.5对HBE细胞凋亡的影响 如图3所示，暴露于100g/mL、200g/mL、400g/mL的PM2.5浓度下的HBE细胞凋亡率明显高于对照组，并呈浓度梯度性增高，且与对照组相比差异均有统计学意义（<0.01）。在用NAC预处理后再给予PM2.5暴露可以减轻细胞凋亡，与对应浓度的 PM2.5组比较细胞凋亡率明显下降，且差异有统计学意义（<0.01）。

1.6 DCFH-DA荧光标记法检测细胞内ROS水平 以每孔1×106个细胞接种于6孔板内，分组和处理同上。在细胞染毒24 h后，将培养液弃去；用1×PBS洗细胞2次，加入终浓度为10mol/L的DCFH-DA探针，于5%CO2、37℃条件下继续培养；在培养4h后再用1×PBS洗细胞3次，洗掉不被结合的DCFH-DA探针以减小背景值；用胰酶消化细胞，收集细胞后用流式细胞仪对细胞内的ROS进行检测。

1.4 细胞培养 HBE细胞株由复旦大学附属中山医院呼吸病研究所赠予。用含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100mg/L链霉素的DMEM不完全高糖培养基在37℃、5%CO2培养箱中培养HBE细胞，取对数生长期的细胞进行实验。

1.5 CCK-8法检测细胞活性 以每孔6×103个细胞接种96孔板，分别设对照组、PM2.5（100，200，400g/mL）组[6]、PM2.5+NAC（用终浓度10mol/L的NAC预处理1h后再给予400g/mL的PM2.5）组，每组设4个复孔，根据实验分组处理细胞，24h后按照CCK-8试剂盒说明书，用酶标仪在450 nm处检测各孔吸光度值，按照公式计算细胞活性：细胞活性（%）=[(实验组OD值-空白组OD值)/(正常对照组OD值-空白组OD值)]×100%。

1.8 Western Blot法检测凋亡相关蛋白的表达 以每孔1×106个细胞接种于6孔板内，分组和处理同上，24 h后用PBS洗涤细胞1次，加入RIPA裂解液冰上裂解细胞25 min，高速离心提取蛋白并用BCA法进行蛋白定量。每个泳道加载20g蛋白，并使用10%分离胶进行SDS-PAGE电泳，常规转膜后用5%脱脂奶粉室温封闭1 h，再将膜分别与1∶1 000稀释的一抗 -actin，Bax，Bcl-2，Caspase-3孵育过夜，TBST洗涤4次后膜与二抗山羊抗兔（1∶2 000）在室温下孵育1h，TBST洗涤4次后用ECL发光液进行曝光拍照。

传统语言学将隐喻看作是一种修辞手法，但认知语言学则认为，隐喻不仅仅是一种语言现象，它还是一种更为广泛的认知范畴，是人类基本的思维和认知方式，是人类形成、组织和表达概念的基础和手段。

1.9 统计学分析 采用GraphpadPrism7统计软件进行分析，数据以均数±标准差（±s）表示，多样本组间比较采用单因素方差分析（One-WayANOVA），P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

  

图1 PM2.5对HBE细胞活性的影响（n =4）

 

注：与对照组相比，**P<0.01；与400 g/mL PM2.5组对比，##P<0.01

2.4 PM2.5对HBE细胞凋亡蛋白表达的影响 如图4所示，不同浓度的PM2.5作用于HBE细胞24 h后，与对照组相比，细胞内促凋亡蛋白Bax、Caspase-3表达水平增高，抗凋亡蛋白 Bcl-2表达水平下降。在用NAC预处理后再给予PM2.5暴露，可以抑制Bax、CCaspase-3蛋白的表达，上调Bcl-2蛋白的表达，说明氧化应激参与了PM2.5诱导细胞凋亡的过程。

2.2 PM2.5对HBE细胞内ROS水平的影响 如图2所示，暴露于100、200、400g/mL的 PM2.5浓度下的HBE细胞内ROS水平明显高于对照组，并呈浓度梯度性增高，且与对照组相比差异均有统计学意义（P<0.01），在用NAC预处理后再给予PM2.5暴露，可以降低对应浓度的PM2.5组HBE细胞内ROS水平，且差异有统计学意义（P<0.01）。

  

图 2 PM2.5对ROS生成的影响（n =4）

 

注：与对照组相比，**<0.01；与400 g/mL PM2.5组对比，#<0.01

(1) 设定合理的土仓压力来保持开挖面稳定。盾构施工参数较为复杂，例如掘进速度、千斤顶推力、刀盘扭矩、刀盘转速以及排土量等参数都会对开挖面产生一定的影响，且这些参数不易做单方面控制。对开挖面而言，最为关键的是实现土仓压力的动态平衡，通过实时监测土仓压力判断掌子面稳定，并根据土仓压力的变化控制排土量，调整土仓内外土压的差值[11]。

  

图3 PM2.5对HBE细胞凋亡的影响（n =4）

 

注：与对照组相比，**<0.01；与400 g/mLPM2.5组对比，##<0.01

2.1 PM2.5对HBE细胞活性的抑制作用 如图1所示，暴露于100、200、400g/mL的PM2.5浓度下的HBE细胞活性明显低于对照组，并呈浓度梯度性降低，且与对照组相比差异均有统计学意义（P<0.01）。在用NAC预处理后再给予PM2.5暴露，可以减轻对应浓度的PM2.5对HBE细胞活性的抑制，且差异有统计学意义（P<0.01）。

(2)将患者作为护理的中心，需要结合患者的具体需求和性格特点等实施护理干预措施，将和谐的护患关系建立，以提升患者的配合程度及满意度。患者入院以后，护理人员即需要为其开展优质的健康宣教，通过组织患者开展健康讲座、发放图文健康宣传手册等方式将心力衰竭以及高血压等相关知识向患者详细介绍，提升患者与家属的认识，帮助其掌握疾病防治的相关措施，进一步提升疾病控制效果。

  

图4 PM2.5对HBE细胞内Bax、Bcl-2、Caspase-3表达的影响（n =3）

 

注：与对照组相比，*<0.05、**<0.01、***<0.001；与400g/mL PM2.5组对比，#<0.01

3 讨论

PM2.5已经成为许多城市特别是中国的主要空气污染物，是影响公众健康，尤其是老年群体健康的主要环境因素之一[7]。PM2.5经呼吸道进入肺组织后，与肺上皮细胞相互作用，导致呼吸系统损伤[8]，流行病学的研究结果亦表明，PM2.5与呼吸系统的发病率和死亡率密切相关，在老年群体中更为突出[9-10]，所以PM2.5的肺毒性机制已成为研究热点。

近年来越来越多的研究表明PM2.5引起病变的主要原因是 ROS的参与 [11]。PM2.5含有很多氧自由基、有机化合物，当其吸入并沉积在气道和肺泡上皮后，可进入支气管上皮细胞、肺巨噬细胞等，促使细胞内ROS产生增加 [2，12]；PM2.5中含有的过渡金属元素如铁、钒、铜、锰等，还可通过芬顿反应或者破坏某些相关酶的功能来促使细胞内ROS产生增加[13-14]，进而引起氧化应激反应，损伤组织细胞。ROS化学性质活泼，作用范围广泛，不仅可以直接造成生化大分子如核酸、蛋白质等的氧化损伤，导致DNA交联、断裂及DPC形成2，而且造成生物膜脂质过氧化，导致膜活动性降低，膜通透性增高，引起细胞功能障碍，导致细胞凋亡、坏死等[15-16]。本实验ROS流式检测结果显示，PM2.5暴露下的HBE细胞内ROS产生较对照组明显增多，并且随着PM2.5浓度的增加而增加，CCK-8法检测HBE细胞活性结果亦证实PM2.5可以降低HBE细胞的活性，与上述研究结论一致。在此基础上，我们采用流式细胞术检测了PM2.5对HBE细胞凋亡的影响，结果显示PM2.5处理的HBE细胞凋亡明显强于对照组，并且同样呈浓度梯度增加效应。此外，实验进一步采用NAC作为ROS清除剂进行了研究，结果显示，加入NAC后明显抑制了PM2.5诱导的HBE细胞ROS的生成，同时NAC干预组与同浓度的PM2.5组相比较，HBE细胞凋亡显著下降，说明减少ROS生成可以抑制PM2.5引起的HBE细胞凋亡，证实了 PM2.5诱导的HBE细胞凋亡与ROS相关。

细胞凋亡是一个程序化的过程，是一种与细胞坏死截然不同的由基因调控的主动性非炎症性细胞死亡形式，只有当细胞受到来自细胞内外的凋亡诱导因素作用时才会启动。细胞凋亡又受到细胞内凋亡调节蛋白的调控，凋亡蛋白分为促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白两大类，Bcl-2是其家族蛋白中最主要的抗凋亡蛋白，其可以稳定线粒体的膜功能，并且可以阻止线粒体释放caspase、凋亡诱导因子（AIF）及细胞色素C等[17-18]；Bax是最早发现的促凋亡家族蛋白，当受到凋亡刺激后Bax转位到线粒体膜上，与膜共同形成渗透性膜转移孔复合物，可使Caspase-3活化为C-Caspase-3，而C-Caspase-3是Caspase家族在凋亡级联反应中是最为关键的凋亡蛋白酶，故最终引起细胞凋亡[19]。另外，Bax/Bcl-2比值的高低对细胞凋亡起了直接的调控作用，即Bax增高，促进细胞凋亡；Bcl-2升高，抑制细胞凋亡[20]。本实验通过Western blot检测显示，随着 PM2.5刺激浓度增加，Bax、Caspase-3蛋白表达也呈递增趋势，而 Bcl-2蛋白表达呈下降趋势，Bcl-2/Bax比值下降，提示支气管上皮细胞凋亡增加，其与流式检测细胞凋亡结果一致。此结果说明了 PM2.5诱导HBE细胞凋亡可能与Caspase-3、Bax蛋白高表达、Bcl-2蛋白低表达有关。此外，在用 NAC作为 ROS清除剂干预后，NAC组Bax、Caspase-3蛋白表达较同浓度PM2.5组有所减少，Bcl-2蛋白表达则有所增加，提示PM2.5诱导的凋亡相关蛋白表达变化与ROS相关。另外，Adams等[17]研究还证实ROS可能直接调控死亡受体的活化，通过 ROS诱导受体聚集和形成脂筏信号平台来诱导细胞凋亡。

综上所述，本实验结果证实PM2.5可以引起HBE细胞内ROS生成增加，进而促使HBE细胞凋亡的发生，实验同时亦证实抑制细胞的 ROS生成可以保护PM2.5造成的HBE细胞损伤，为防治PM2.5呼吸系统疾病提供了研究思路。此外，因本实验是采用体外细胞模型，将PM2.5直接作用于HBE细胞上来观察PM2.5的毒性作用，其可能于 PM2.5作用于体内的机制并不完全一致，故在后续实验中会采用 PM2.5呼吸道自然吸入的方式建立 PM2.5动物暴露模型来进行下一步的研究。

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