膝骨关节炎（knee osteoarthritis,KOA）是一种常见的关节退行性病变。其病理改变包括进行性的关节软骨丢失和破坏、软骨下骨增厚、骨赘形成、滑膜增生及韧带、半月板和关节囊的变性[1]。临床治疗以减轻或消除疼痛、矫正畸形、改善或恢复关节功能及提高生活质量为主[2]。作为关节软骨组织中唯一的细胞，近年来软骨细胞凋亡在KOA发生发展中的作用受到越来越多的关注[3]。软骨细胞凋亡与软骨退变的严重性及细胞外基质的破坏成正相关[4]。因此，如何减少软骨细胞凋亡，保持相对的软骨细胞数量是治疗KOA的关键。本研究从膝关节软骨细胞凋亡与KOA相关性的角度出发，观察芪防膝痹颗粒对软骨的作用，为临床治疗KOA提供科学依据。

协整检验就是为了研究它们之间的长期稳定关系，经过前文的平稳性检验，得到GDPL、LGAS、LENERGY这三个变量可能存在协整关系的结论。接下来将对GDPL、LGAS、LENERGY这三个变量平稳的二阶差分序列进行协整检验，检验所呈现出来的结果如下：

1 材料与方法

1.1 试剂及仪器 胰蛋白酶、苏木素、伊红、Orange G染料及Alcianblue（Sigma）；Bcl-2、Bax和Fas一抗（abcam公司）；TUNEL试剂盒 (Roche公司)；免疫组化试剂盒和 DAB显色试剂盒 (北京中杉金桥)；硫酸氨基葡萄糖胶囊（RottapharmLtd,Ireland）；芪防膝痹颗粒（黄海制药公司，生产批号20120916）。组织脱水机、轮转式切片机、摊片机、烘片机(LEICA)；光学显微镜 (日本Olympus)，Micro-CT（scanco，vivaCT80）。

1.2 实验动物 8周龄SPF级健康雄性SD大鼠（北京维通利华）60只，由上海中医药大学动物试验中心提供，动物房室温控制在18℃～22℃，昼夜各12 h。

1.3 实验方法

1.3.8 TUNEL染色组织切片脱蜡至水，20g/mLProteinaseK通透15min，多聚甲醛固定15min，平衡液平衡10 min，TUNEL反应混和液于样品上，阴性对照加50L标记溶液，湿盒暗室中37℃孵育60 min，2×SSC终止反应15min，PBS冲洗3次，DAPI封片、镜检。

1.3.2 模型制备 造模前大鼠禁食12h，N组大鼠右后膝内侧皮肤行约1cm纵形切口，余5组参照Hulth法制备KOA模型[5]。术后每天注射青霉素40万U/Kg，连续注射3 d，8周后给药。

2.2 HE及阿尔辛兰/橙黄G染色结果 N组软骨表面平滑，软骨基质着色均匀。软骨层次结构及潮线清晰可见，表层为平行排列、扁平的软骨细胞，移行层为圆形的软骨细胞，放射层细胞排列成柱状，各层细胞排列整齐。S组软骨表层有明显撕裂，软骨细胞排列紊乱，有大量簇集细胞团，结构难以分辨，部分出现碎裂、剥脱，甚至软骨全层缺失，软骨下骨外露，潮线变得模糊。G组软骨表层欠光滑，出现浅表裂隙，软骨层变薄但尚完整，部分软骨细胞增生肥大但细胞排列整齐，潮线完整。G组软骨情况好于 Z组和 D组，Z组与A组相当，D组软骨破坏仍较为明显。见图2及图3。

本研究尚存在样本量少、观察时间短、缺乏客观定量方法测定感觉功能等方面的不足,使研究结果可能存在一定偏差，后续工作中将收集更多临床病例继续研究。

虽然新会计制度的实行存在以上难点，但是新会计制度功能更全面，体现更大生命力。因此，行政事业单位一定要克服各种困难，确保政府会计制度按时有序实施。

1.3.4 标本采集 大鼠10%水合氯醛麻醉下腹腔取血5 mL，取右后肢，福尔马林固定48 h后置于75%酒精中室温保存。行Micro-CT扫描后，用14%乙二胺四乙酸脱钙6周，经脱水、浸蜡和包埋后，5m厚度切片。

Z组、G组与A组Mankin’s评分较S组和D组低（<0.05），Z组、G组与A组间Mankin’s评分差异无统计学意义，D组与S组Mankin’s评分差异无统计学意义。见图4。

闪电劈开雷雨交加的黑夜,瞬间照亮站在铁轨中间的杨秉奎。他左右摆动着手中的信号灯。一列封闭的货车缓缓驶来,车灯橘黄色的光透过密集的雨点,照在杨秉奎身上。

细胞比率，求平均值。

1.3.6 阿尔辛兰/橙黄G染色 石蜡切片常规脱蜡至水后，盐酸乙醇分化30s，1%阿尔辛兰/苏木素30min，盐酸乙醇分化5s，1%氨水返蓝30s，清水冲洗，95%乙醇lmin，0.5%橙黄G30s后脱水、透明、封片。关节软骨参照Mankin′s评分法 [6]，总分14分。（1）软骨结构：正常0分、表面不规则1分、表面不规则及血管翳2分、裂隙深达软骨移行层3分、裂隙深达软骨放射层4分、裂隙深达软骨钙化层5分、结构完全破坏6分；（2）软骨细胞：正常0分、弥漫性细胞数量增多1分、增生性细胞簇2分、细胞数量减少3分；（3）阿尔辛兰染色：正常0分、轻度减弱1分、中度减弱2分、重度减弱3分、未显色4分；（4）潮线：完整0分、有血管穿过1分。

1.3.7 免疫组化 采用链霉亲和素-生物素复合物法检测，石蜡切片脱蜡至水，3%H2O2室温15 min阻断内源性过氧化酶，胰蛋白酶修复抗原15 min，5%BSA室温封闭15 min。一抗4℃孵育过夜，一抗稀释比例Bcl-2（1∶200）、Bax（1∶200）、FAS（1∶200），阴性对照以 PBS代替一抗。二抗室温孵育20 min，滴加辣根酶标记的链酶亲和素20 min，DAB显色，苏木精衬染后脱水、透明、封片。凋亡的软骨细胞核呈棕黄色，随机选取6个视野计数阳性细胞，计算阳性

1.3.5 HE染色 石蜡切片60℃烤箱20 min，二甲苯I、二甲苯Ⅱ、二甲苯Ⅲ、无水乙醇、95%乙醇、85%乙醇、75%乙醇各3min，苏木素2min，1%盐酸乙醇分化5s，1%氨水返蓝30s，清水冲洗1min，伊红溶液1 min，后梯度脱水，二甲苯透明，封片。

1.3.1 分组采用随机数字表法将60只大鼠随机分为对照组（N）、生理盐水组（S）、氨基葡萄糖组（A）、芪防膝痹颗粒低剂量组（D）、芪防膝痹颗粒中剂量组（Z）及芪防膝痹颗粒高剂量组（G）6组，每组10只。

1.4 统计学分析 采用SPSS20.0进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA），两两比较采用LSD-检验，<0.05为差异有统计学意义。

近年来随着我我国糖尿病患者，特别是2型糖尿病患者人数的不断增长与发病比例的不断上升，使得当前对于在临床治疗中如何提升对此类糖尿病患者的治疗效果和血糖控制水平成为了当前糖尿病治疗的重要问题。而相关研究显示，糖尿病患者若无法对其血糖水平进行及时有效的控住，患者各器官及机体组织功能将在高血糖水平的条件下受到不同程度的功能性损伤情况，增加患者各类严重并发症的诱发风险，进而对患者正常生活质量及健康造成一定影响，因此采取有效治疗方法对患者血糖水平进行控制对患者病情的控制具有重要意义[3]。

2 结果

2.1 Micro-CT影像学结果 N组膝骨关节软骨面光滑平整，无骨赘生成；矢状切面见软骨下骨骨小梁粗大，排列较均匀。S组关节软骨面粗糙不平，表面局部出现碎裂剥脱，关节边缘可见骨赘形成，软骨下骨囊性变。G组膝骨关节软骨面较D组和Z组平滑，骨赘增生较轻，Z组软骨和软骨下骨损伤程度低于D组，3组膝关节骨赘均不同程度优于S组。A组较S组膝骨关节损伤较轻，优于D组，与Z组相当，但不及G组。见图1。

1.3.3 给药方法 药物根据大鼠体重及体表面积计算给药剂量，硫酸氨基葡萄糖剂量0.1g/（kg×d），芪防膝痹颗粒剂量1.672g/（kg×d）。N组和S组每日予3mL生理盐水灌胃；A组每日予3 mL硫酸氨基葡萄糖溶液灌胃；D组、Z组及G组每日予3 mL芪防膝痹颗粒溶液灌胃，剂量分别为1/2大鼠剂量、1倍大鼠剂量和2倍大鼠剂量。连续灌胃8周后取材。

根据双曲线模型公式计算时间折扣率：Vt=V/(1+kt)，其中t表示延迟的时间(1/3/6/12个月)，Vt是远期结果的现值(100元)，V是被试所期待的远期结果，k是时间折扣率。k值越小表示在跨期决策中的远期偏好越强烈，k值越大表示越为短视。分别计算出被试在4个不同延时的跨期决策任务中的k值，取其平均数作为因变量指标。

2.3 免疫组化结果 S组凋亡蛋白Bax、Fas较N组增多，A组、G组和Z组Bax及Fas差异无统计学意义，且均较S组减少，差异有统计学意义（<0.05），D组抑制凋亡的作用不显著，与S组比差异无统计学意义。A组、G组和Z组Bcl-2基因差异无统计学意义，但均较S组增多，差异有统计学意义（<0.05），D 组及S组Bcl-2基因差异无统计学意义。见图5。

  

图1 大鼠膝关节Micro-CT

  

图2 大鼠关节软骨HE染色

  

图3 大鼠关节软骨阿尔辛兰/橙黄G染色

  

图4 大鼠膝关节Mankin’s评分

 

注：与S组比较，*<0.05

  

图5 大鼠膝关节免疫组化

 

注：与S组比较，*<0.05

  

图6 大鼠膝关节TUNEL染色

  

图7 大鼠膝关节软骨细胞凋亡率

 

注：与S组比较，*<0.05

2.4 TUNEL染色结果 软骨细胞凋亡主要分布在软骨的表层和中层，N组正常软骨中有少量表达；S组软骨细胞凋亡率较N组增多，G组、Z组和A组软骨细胞凋亡率减少，组间无统计学差异，但与S组比差异有统计学意义（<0.05），D组细胞凋亡率与 S组差异无统计学意义。见图6、图7。

3 讨论

KOA属中医“痹证”和“痿证”的范畴。因肝肾亏虚，经络痹阻，筋脉失养所致。非甾体抗炎药不良反应明显，而软骨保护剂疗效不明确[7]。祖国医学治疗KOA具有效果明显、不良反应少等特点[8-10]。

前期研究表明，益气化瘀利水方能抑制前列腺素等炎症介质，改善关节软骨的微循环 [11-14]。膝关节之痹，往往病程迁延，病机混杂。在益气化瘀利水方基础上改良而成的芪防膝痹颗粒，继承了石氏伤科以气为主、以血为先的理念，针对膝痹证之湿邪为患，进一步总结了针对性的治疗原则。《仁斋直指》曰：“血气和平、关络条畅则痰散而无，气脉闭塞，脘窍凝滞，则痰聚而有。” 石氏伤科亦认为损伤后气血不和，经脉受阻，可生痰湿。而痰湿之论治，重在肾。《景岳全书》云：“夫痰即水也，其本在肾”。本课题组在益气化瘀之外，将利水之法与温补肝肾相结合，以除痰湿，蠲湿痹。生黄芪益气固表，汉防己祛风湿利水，制苍术性虽辛散然燥胃强脾，三者祛邪而不伤正；川牛膝引血下行，地鳖虫化瘀通络，力攻病灶；全当归内润脏腑，外达机表，与仙灵脾可并补肝肾，以助化瘀、利水。本方肝肾同治，补泻兼施，体现了中医整体治疗的理念。

本研究中，Micro-CT、HE染色、阿尔辛兰/橙黄G染色提示芪防膝痹颗粒对大鼠的软骨及软骨下骨有一定程度的改善；免疫组化和TUNEL染色发现相比S组，G组和Z组可以明显减少软骨细胞凋亡。Mankin’s评分与软骨细胞凋亡存在正相关，即凋亡比例越高软骨退变越严重。中医药在治疗KOA上有比较明显的优势，能够通过促进关节液循环，减少细胞炎症因子如白细胞介素1、肿瘤坏死因子 、白介素6[15-16]等在关节内的堆积，从而延缓细胞因子对膝关节软骨的破坏作用。本次研究G组稍优于Z组和D组，与A组相比G组在修复软骨和延缓软骨退变方面均有一定优势；Z组的总体作用效果与A组基本相同。

关节软骨由软骨细胞和细胞外基质组成，是有丝分裂后组织，细胞再生能力很低[17]。关节软骨退行性改变是KOA发病的中心环节[18]，目前尚无有效措施阻止KOA进展，因此延缓软骨细胞调亡，保持关节软骨的完整成为了当前治疗的重点。TUNEL染色发现，KOA模型组关节软骨有大量凋亡细胞阳性表达，主要位于表层和中层，移行层和深层也有阳性细胞表达，高于N组，再次证明软骨细胞凋亡参与了KOA的病理改变。近年来研究发现Wnt/-catenin信号通路在软骨细胞的生长发育、增殖、分化、迁移、凋亡及稳态维持方面起着重要作用[19]，激活Wnt/-catenin在调节软骨生成方面发挥着双重作用，既可以促进关节软骨细胞的分化和成熟增加蛋白酶的表达及活性，又可以增强软骨细胞胶原和蛋白多糖的表达[20]，而该通路的抑制又可以导致软骨细胞凋亡 [21]。

本次研究结果显示，芪防膝痹颗粒可以减少软骨细胞凋亡，延缓 KOA大鼠软骨和软骨下骨的退变，为临床治疗KOA的药物使用提供了科学依据。但其减少软骨细胞凋亡的具体作用机制尚不清楚，还有待于进一步深入研究。

本文研制的是一种无机泡沫吸波材料，是利用碎玻璃或火山灰等为主要原材料，在其中添加电磁损耗物质，熔融发泡而成的一种隐身材料，如图7所示。

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