血管内皮细胞是血管内膜的主要组成部分，通过细胞间连接形成一层保护屏障，防止血管内的大分子进入内皮下或血管外。病理情况下，内皮细胞通透性增加，利于血管内某些特殊成分进入内皮下间隙，诱发病理过程，这见于动脉粥样硬化的发病过程[1]。内皮细胞通透性增加，血管内大分子进入血管外，导致血管内外渗透压改变，引起组织间隙水肿，可以导致组织的血流灌注减少，这种情况见于心肌缺血再灌注损伤[2]；另外，内皮细胞通透性增加，方便血管内某些细胞跨越内皮层，进入组织中定居，这种情况见于肿瘤的转移[3]。因此，内皮细胞层通透性的改变，涉及多种疾病的病理过程，通过有效调节和控制血管内皮细胞的通透性，可能改变疾病的发展过程如动脉粥样硬化、心肌再灌注损伤和肿瘤经血运转移，具有潜在的临床治疗价值。血管生成素样蛋白-4（angiopoietinlike 4，ANGPTL4）是由脂肪细胞、心肌细胞、内皮细胞等分泌的一种细胞因子，与血管生成素有类似结构，但作用途径和生物效应不同;受缺氧、炎症介质等刺激增加，具有抑制脂蛋白酯酶，调节脂质代谢等作用[4]。有研究[2]发现，在小鼠心肌缺血再灌注损伤模型中，ANGPTL4能降低内皮细胞通透性，减少炎症细胞的浸润，缩小心肌坏死面积。由于ANGPTL4具有调节内皮细胞通透性的作用，具有潜在的临床应用价值；因此有必要对其生物效应的特点进行深入研究，评价其在临床中应用的可能。本文应用体外培养的脐静脉内皮细胞，对ANGPTL4的体外作用、量效关系及可能的机制进行探讨。

1 材料与方法

1.1 实验材料 Transwell24孔板（美国corning)，BSAFITC（北京翰谱医药生物研究所），Alexa Flour 594标记Phalloidin(Invitrogen)，AlexaFlour595标记Phalloidin(AATBioquest)，DAPI(罗氏公司)，免疫荧光标记试剂盒-抗兔 Alexa Flour 488(碧云天)，Human VEGF ELISA Kit(Bendor)，细胞培养基（GIBCO）,Angiopoietinlike4(Prospec)，抗人ZO-1抗体、抗人-catenin、AlexaFlour488标记的各种二抗（北京博奥森）。

1.2 方法

在高压输电线路检修工作中采用相对温差判断法非常合适，而且效果很好。该检修技术通常被应用到2个设备间，这2个设备无论是负荷电流情况、支线环境温度，还是型号，都毫无差别。在所处的监测点上比较二者的温差，并收集温度较高的监测点上的温度上升比值，用作后期比较的数据基础。高压输电线路检修过程中，检修人员往往采用相对温差判断法，判断和剖析电流型致热设备故障问题。该检修技术应用过程中，检修人员不需要过多担心负荷情况、环境温度等细部性指标干扰诊断结果，准确性非常高，鲜有误差。

台州是浙江海洋经济发展示范区南翼的重要组成部分，而地处长三角和海西经济圈交汇接合部的台州各个港口，以服务台州地区为主，兼顾服务浙中南地区，是浙江沿海地区的重要港口，也是台州融入长江经济带的重要交通枢纽。而目前在台州，每年集装箱的总量达110-120万标箱。

正常氧分压与缺氧对ANGPTL4效应的影响，见图2。

2.2.1 -Catenin免疫荧光染色结果 -Catenin免疫荧光染色结果提示随浓度增加，细胞核附近及细胞核中-Catenin荧光染色阳性面积更大，低氧分压组较正常氧分压组更显著。随处理药物浓度增加，细胞连接受损加重，缺氧状态更为明显。

1.2.4 细胞免疫荧光检测 HUVEC细胞培养传代后接种在2块6孔板的玻璃载玻片中培养，细胞长至融合后，将其中一块载玻片转移至乏氧培养箱继续培养12 h。加入处理药物孵育3 h，D-Hank’s洗3遍，PFA固定15 min，PBS洗3遍，5%BSA封闭1 h。加入100MZO-1和 -catenin一抗4℃孵育过夜，PBS洗3×5min，加二抗孵育 2h，PBS 洗3遍3×5min，DAPI染核15min，封片。共聚焦显微镜物镜60×/油镜观察拍照。

1.2.3 低氧状态下内皮细胞的通透性检测 细胞于上室培养至融合后，培养板转移至乏氧培养箱（37℃,5%CO2,1%O2，饱和湿度）继续培养12 h。弃去培养基，D-Hank’s清洗3次，换上无血清无酚红DMEM培养基稀释的处理药物孵育3 h。其余步骤同正常氧分压检测流程。

1.3 统计学分析 SPSS20.0统计软件处理，计量资料用均数±标准差（±s）表示，组间比较采用学生t检验。以P<0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 正常氧分压状态及低氧分压状态内皮细胞的通透性检测 正常氧分压状态及低氧分压状态内皮细胞的通透性检测，见表1。

正常氧分压状态浓度-通透性的关系，见图1。

 

表1 正常氧分压状态及低氧分压状态内皮细胞的通透性检测

  

注：同对照组相比，0.625 g/mL、1.25g/mL、2.5 g/mL和5g/mL组通透性均显著增加，*P<0.05；低氧状态同相对应的正常氧分压状态相比，除5 g/mL组以外，其它各组通透性均增加，△P<0.05

 

浓度（ g/mL） 正常氧分压 低氧状态空白对照0.625△1.25△2.5△5△283+16 320+12*338+21*369+33*423+31*335+18 396+21*404+16*416+18*452+32*

每个实验都有相应的实验步骤，有时学生往往记住了步骤，但并没有真正理解要按照这个顺序进行实验的原因。教师可以尝试让学生思考能否颠倒顺序，通过实践检验步骤的原理。例如，在“检测生物组织中的蛋白质”实验中，需要用到双缩脲试剂。双缩脲试剂分为双缩脲试剂A和双缩脲试剂B，在使用时应该先加A后加B。有学生提出：若顺序加反是否可以。这时，教师可以让学生进行尝试，观察、分析实验结果。经过错误的实验尝试后，学生会发现由于不能先提供一个碱性环境，就不能出现紫色反应，从而更加理解双缩脲试剂检验蛋白质的机理。

  

图1 正常氧分压状态浓度-通透性的关系

 

注：同con相比，*P<0.05、**P<0.01、***P<0.01

1.2.1 细胞培养与分组 人脐带内皮细胞（HUVEC细胞，购自博古生物）置于37℃、5%CO2、饱和湿度条件下的培养箱（DMEM+10%FBS）中培养，细胞传代后接种于24孔transwell上室中，每孔100L，下室600L，设空白对照组，4个不同浓度 ANGPTL4实验组，分别为0.625g/mL、1.25g/mL、2.5g/mL和5g/mL。

  

图2 正常氧分压与缺氧对ANGPTL4效应的影响

 

注：同con相比，*P<0.05、**P<0.01、***P<0.01；同相同的处理浓度相比，缺氧状态通透性增加更明显，#P<0.05、##P<0.01、###P<0.01

现在，轩轩上了幼儿园，他的身体还真强壮了很多，不再经常生病，也愿意去幼儿园，就是脾气太难琢磨了。有时他跟小朋友玩得正高兴，突然就没来由地推别人一下、抓别人一把、跺别人一脚。我们真的很纳闷：宝宝的身体不招病了，不会是心理又出问题了吧？

1.2.2 正常氧分压状态下细胞通透性检测 细胞于上室培养至融合后，弃去培养基，D-Hank’s清洗3次，换上无血清无酚红DMEM培养基稀释的相应浓度的处理药物孵育3 h时。弃上室培养基，加入100L DMEM培养基稀释的1M的BSA-FITC，1h后取下室的液体于96孔黑色酶标板中，酶标仪测定读数（激发波长492 nm，发射波长525 nm）。

2.2 细胞免疫荧光检测内皮细胞间连接的改变

2.2.2 ZO-1免疫荧光染色结果 ZO-1免疫荧光染色结果提示在未经药物处理状态，细胞间隙正常，在药物处理后，无论是2.5g/mL还是5g/mL，细胞间的间隙均增大,缺氧状态及正常氧分压状态均有相似趋势。

3 讨论

本研究结果提示，ANGPTL4能增加人脐静脉内皮细胞通透性，效应呈浓度依赖；缺氧状态下效果更强。ANGPTL4的作用与内皮细胞间连接破坏，致密连接受损相关。Huang等[4]研究发现cANGPTL4结合并激活整合素 5介导的Rac1/PAK信号传导的细胞间接触,cANGPTL4随后与内皮钙黏蛋白(VE-cadherin)和闭合蛋白-5(claudin-5)相关联，并引起内皮破坏,干扰cANGPTL4复合物的形成,延迟了血管破坏。但Galaup的研究表明，Angptl4基因敲除小鼠使在缺血心肌中表达的血管VE-cadherin和claudin-5下降，VEGFR2/VE-cadherin复合体解离，破坏了粘附连接[2]。最近Zhang等[7]研究表明ANGPTL4抑制了中风后血管内皮中血管内皮生长因子（VEGF）的上调，其通过抵消VEGFR信号传导并减少下游Src信号传导而被抑制，并导致结合稳定性增加并改善内皮细胞屏障完整性。

目前关于ANGPTL4对血管通透性开展的研究包括炎症反应、肿瘤转移和缺血/缺氧损伤等三个方面。针对肺组织炎症反应的研究发现[5]，在小鼠流感病毒感染模型中，应用ANGPTL4抗体和ANGPTL4-表达缺陷两种方法，均能阻断ANGPTL4，减少肺组织渗出，促进感染后损伤恢复。但体外研究发现[6]，肺微血管内皮细胞 (PMVECs)过度表达 ANGPTL4能抑制LPS诱导的RPMVEC通透性增加。同样相互矛盾的结果也见于对肿瘤转移的研究。Huang等[4]研究发现，应用ANGPTL4-敲除小鼠模型证实，cANGPTL4诱导血管渗漏，促进肿瘤肺转移。

播种架倾角α(°)、种勺线速度v(m/s)及种勺空间尺寸a×b(mm×mm)3因素影响土豆播种机播种质量的显著性不同，如表3～表5所示。排种器试验装置参数优选试验的试验指标分析如表6所示。

但更早前的Galaup等 [3]研究发现，3LL转移瘤细胞异体移植到过表达ANGPTL4的小鼠中。原代瘤细胞在二组中生长类似，但表达ANGPTL4的小鼠肿瘤肺转移更少。Galaup等的研究结论在肿瘤转移和细胞缺血方面具有一致性。Galaup等[2]2011年的另一项研究中发现，ANGPTL4-缺陷小鼠心肌梗死模型中，血管通透性，出血、水肿和炎症及梗死的严重程度增加。小鼠和兔体内注射重组人ANGPTL4能，缩小心肌梗死面积和无复流程度。这些结论迥异的研究，可能源于ANGPTL4的结构不同（如应用ANGPTL4的末端片段而不是全长）、操作方法差别（如过度表达或表达缺陷）和细胞种类的不同（动脉端内皮细胞与静脉端内皮细胞不同）。这也提示 ANGPTL4的效应可能具有复杂性和环境依赖性的特征，需要对其生物效应进行更充分、详细的研究。

参考文献

[1]葛均波.动脉粥样硬化和冠状动脉粥样硬化性心脏病[M].北京：人民卫生出版社，2013：221-227.

[2]Galaup A,Gomez E,Souktani R,et al.Protection against myocardial infarction and No-Reflow through preservation of vascularintegritybyAngiopoietin-Like4[J].Circulation,2012,125(1):140-149.

[3]GalaupA,CazesA,LeJanS,etal.Angiopoietin-like4prevents metastasis through inhibition of vascular permeability and tumor cell motility and invasiveness[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2006,103(49):18721-18726.

[4]Huang RL,Teo Z,Chong HC,et al.ANGPTL4 modulates vascular junction integrity by integrin signaling and disruption of intercellular VE-cadherinandclaudin-5clusters[J].Blood,2011,118(14):3990-4002.

[5]Li L,Chong HC,Ng SY,et al.Angiopoietin-like 4 Increases Pulmonary Tissue Leakiness and Damage during Influenza Pneumonia[J].Cell Rep,2015,10(5):654-663.

[6]WangY,ChenH,Li H,etal.Effect of angiopoietin-like protein 4 on rat pulmonary microvascular endothelial cells exposed to LPS[J].Int J Mol Med,2013,32(3):568-576.

[7]ZhangB,XuX,ChuX,etal.Protectiveeffectsofangiopoietinlike 4 on the blood-brain barrier in acute ischemic stroke treated withthrombolysisinmice[J].Neurosci Lett,2017,645:113-120.