肺纤维化(pulmonary fibrosis，PF)是一种发病机制复杂并且尚不十分明确的肺部间质性疾病。其主要病理改变呈现为弥漫性肺泡炎及肺成纤维细胞灶形成、细胞外基质过度沉积[1]。相关研究指出多种细胞和细胞因子与其发病机制有关，前期实验工作中针对Th17细胞、IL-17与肺纤维化发生机制的关系已有所研究[2-4]，并且近些年关于Th17/Treg失衡的探讨备受瞩目。相关研究[5]指出自身免疫性疾病发生的重要原因之一就是Th17/Treg比例失衡，Th17与Treg之间保持动态平衡对于机体内环境的维持意义重大。IL-35作为一种对免疫系统和免疫反应有负向抑制作用的细胞因子，可能对维持Th17/Treg细胞平衡有着重要意义。本研究拟通过建立大鼠肺纤维化模型，观察IL-35与Th17/Treg失衡在大鼠肺纤维化模型的肺组织中变化特点，探究IL-35和Th17/Treg比例失衡与肺纤维化发病机制的关系和意义，为指导肺纤维化治疗提供新的靶点。

资料与方法

一、实验动物与试剂

60只健康Wistar大鼠(雌雄各半,体重200g左右,合格证号:scxle(黑) 2013007),佳木斯大学动物实验中心提供，清洁级标准饲养；盐酸博来霉素(美国Invitrogen公司)；10%水合氯醛、乙醇、蒸馏水等(天津化学试剂三厂生产)；PE-Cy5 anti-Rat CD4(大鼠抗小鼠 CD4单克隆流式抗体，美国BDP harmingen);PE anti-mouse IL-17及同型对照(大鼠抗小鼠 IL-17单克隆抗体，美国 BDPharmingen )；PE anti-rat Foxp3(大鼠抗小鼠Foxp3 单克隆抗体)及同型对照(美国ebioscience)；酶联免疫(ELISA)试剂盒(大鼠IL-17、大鼠IL-35。

二、动物分组

按随机数字表将60只雌雄各半Wistar大鼠分为两组: 对照组(生理盐水组)、肺纤维化组(博来霉素组)，每组各30只。

三、制作模型及标本采集

以10%水合氯醛溶液(0.30mL/100g)腹腔注射麻醉，将大鼠仰卧固定于鼠板上后，颈部备皮消毒，沿正中线剪开颈部皮肤，分离组织充分暴露气管，肺纤维化组快速推入0.2-0.3mL(BLM-A5,5mg/kg)于大鼠气管分叉处，对照组注入0.9%生理盐水0.2-0.3mL。然后将大鼠直立，以及迅速顺逆时针旋转鼠板，皮肤缝合，清洁级饲养。分别于实验第 7、14及28天,采用随机原则从三组大鼠中抽取10只处死并留取肺组织。

四、肺组织病理改变

对留取的各组肺组织行HE染色和Masson三色染色，观察肺组织炎症程度及纤维化程度变化。

五、检测肺组织IL-35、IL-17表达水平

PF(肺纤维化)作为一种呼吸道慢性间质性改变疾病，早期病理表现为肺部炎症性改变，晚期以纤维蛋白沉积、肺组织纤维化为主。患者多有干咳、进行性加重的呼吸困难等症状，活动耐力受限，晚期严重乏氧，发生呼吸衰竭、心脏衰竭，生活质量极度降低，被称为不死的癌症。发病机制至今尚未十分明确。随着前期实验对Th17细胞的研究[2-4]，Th17/Treg细胞失衡学说在PF发病机制中的作用逐步被认识和了解，本研究就新型抑制性细胞因子IL-35与Th17/Treg失衡在肺纤维化发病机制中的关系展开探讨。

使用SPSS21.0统计学软件，计量资料采用±s表示；两组间比较采用独立样本t检验，多样本比较应用单因素方差分析，相关性应用pearson相关分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

六、肺组织Th17、Treg细胞表达检测

与对照组相比，肺纤维化组各时间点检测指标IL-17含量、Th17细胞百分率结果均明显增高(P<0.05)，具有统计学意义。检测结果于第7天时达到最高值，第14、第28天呈现逐渐降低趋势，但总体上仍高于对照组。D组检测结果低于同时间点F组值、明显高于N组值，差异存在统计学意义(P<0.05)。F、D组各时间点Treg细胞百分比与对照组相比结果降低(P<0.05)，有统计学意义，并且结果呈现逐渐降低。(见表1-5)。

七、统计学分析

3.3.4 VRF隔离。不同业务系统之间采用独立VRF，业务系统的计算单元分别部署在不同的VRF中，存储单元分别部署在独立的VRF中，计算单元与存储单元的互通采用VRF互通。在一个VRF内部，使用ACL实现网段间隔离。

主要涉及专业知识、技巧以及对特定课程具体要素的理解。在欧洲，所涉及的课程包括中小学各类课程如艺术、经济、数学甚至包括体育等。在中国，少数民族地区中小学阶段对母语不是汉语的少数民族学生用汉语讲授学科知识是一种CLIL课程。在高等教育阶段，则涉及部分院校尝试把一门或数门专业课用英语来讲授。更为普遍的是开设一门冠名为某某英语的综合性课程，涉及多门专业课知识，如航海英语所涉及的专业课有船舶值班与避碰船舶管理等。我们认为这些课程的教学也是一种广义的CLIL。

结 果

一、显微镜下观察HE染色和Masson三色染色肺组织病理改变

选取2016年1月至2016年12月于我院进行CIN筛查的125例患者为研究对象，研究对象年龄20～55岁，平均年龄(41.06±6.29)岁。

对照组大鼠呈现正常肺泡及肺间质结构，无炎症细胞及纤维蛋白沉积。肺纤维化组镜下病理改变与对照组对比，第7天肺组织出现显著炎症细胞浸润，如中性粒细胞、单核巨噬细胞等，肺间质充血、水肿，成纤维细胞计数增多；第14、第21天肺组织炎症逐渐吸收，成纤维细胞逐渐增多，胶原纤维逐渐增生、沉积，肺泡间隔逐渐增宽，肺泡逐渐萎缩、消失。

二、检测各组大鼠肺组织中IL-35、IL-17相关因子、Th17及Treg细胞表达水平

采用流式细胞术方法检查分析肺组织Th17、Treg细胞表达情况。

 

表1 不同时期两组大鼠肺组织IL-35表达水平(pg/mL)

  

组别n7d14d28d对照组1084．45±18．0282．25±15．8283．56±16．94肺纤维化组1059．94±6．30&38．67±8．50&27．01±8．15&

与N组比较，&P<0.05；与F组比较，@P<0.05

 

表2 两组大鼠不同时期肺组织IL-17表达水平情况(pg/mL)

  

组别n7d14d28d对照组107．39±0．367．40±0．377．41±0．38肺纤维化组1054．10±1．54&34．64±1．36&25．62±1．21&

与N组比较，&P<0.05；与F组比较，@P<0.05

 

表3 两组大鼠不同时期肺组织Th17细胞表达百分率(%)

  

组别n7d14d28d对照组70．78±0．030．79±0．020．79±0．06肺纤维化组79．72±0．50&6．90±0．23&4．64±0．17&

与N组比较，&P<0.05；与F组比较，@P<0.05

 

表4 两组大鼠不同时期肺组织Treg表达水平百分率(%)

  

组别n7d14d28d对照组101．12±0．411．14±0．441．13±0．42肺纤维化组100．50±0．25&0．47±0．21&0．46±0．14&

与N组比较，&P<0.05；与F组比较，@P<0.05

 

表5 两组大鼠不同时期肺组织Th17/Treg表达水平情况

  

组别n7d14d28d对照组100．34±0．060．36±0．080．34±0．07肺纤维化组100．74±0．11&0．68±0．10&0．66±0．09&

N组比较，&P<0.05；与F组比较，@P<0.05

三、IL-35表达量与IL-17、Treg细胞计数、Th17/Treg比例相关性的分析

肺纤维化组IL-35与IL-17表达水平呈明显的负相关(r=-0.478，P<0.01)，IL-35与Treg细胞表达水平呈正相关(r=0.461，P<0.01)，IL-35与Th17/Treg细胞表达水平呈负相关(r=-0.486，P<0.01)。

讨 论

采用酶联免疫法(ELISA)检测两组肺组织IL-35、IL-17表达水平。

2.4 人力因素 农村青壮年或赴沿海发达地区及周边大中城市务工，或因学校撤并为方便孩子入学选择进城务工，管护梨园的主要是六七十岁的老梨农，管理水平不高，梨果品质逐年下降，收入逐年下滑。当地果业系统中，许多梨树栽培管理经验丰富的老技术员已经退休或面临退休，年轻技术干部实践技能不足，难以有效指导生产。

李树民[6]等人提出在炎症状态下CCR6可趋化Thl7细胞至肺部组织；辅助性T细胞中只有Thl7分泌表达IL-17，所以IL-17 的水平及功能可间接反映Th17细胞的功能状态，本研究中，与对照组相比，肺纤维化组各时期Th17细胞、IL-17表达水平均明显增高，并且在第7天时大鼠肺纤维化模型炎症反应最明显时达最高值，说明肺纤维化中可能存在Th17 细胞亚群功能的亢进。与鲍文华[2-4]等人关于Th17细胞对肺纤维化大鼠模型中的表达及意义研究一致。

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调节性T细胞(Treg)是对炎症反应起拮抗作用的另一特殊类型T细胞，在维护免疫平衡及调节机体炎症反应中起到重要作用。Sayour EJ等[7-8]学者认为Treg与特发性肺纤维化以及化学因素诱导的肺纤维化密切相关。相关研究证实多种疾病的发生发展与Th17、TH1/TH2及Treg细胞亚群之间相互作用有关，例如自身免疫性疾病、肿瘤、炎症反应以及移植排斥等。正常机体内存在着Th17/Treg动态平衡，Th17/Treg失衡可促进自身免疫性疾病炎症反应的发生[9]。赖小映，钟小宁[10]认为Th17/Treg失衡可能加重肺纤维化免疫炎症，促进肺部胶原纤维的沉积。新型抑制性细胞因子IL-35其主要功能是能明显促进细胞的增殖[11],增强亚群的免疫抑制功能，并可直接对Th17细胞的增殖分化起到抑制作用，从而抑制机体过度的免疫反应，避免或减少机体的免疫损伤,本研究结果显示肺纤维化组相对于对照组各时期Treg细胞百分比降低、并且IL-35与Treg相关性分析呈正相关、与IL-17、Th17/Treg呈负相关，推断IL-35可能参与Th17/Treg细胞失衡致大鼠肺纤维化的形成过程。

IL-35作为IL-12家族中最新识别的成员，主要由nTreg细胞产生[12]，是α和β链组成的异源二聚体蛋白，其具有IL-12家族的典型特点，在T细胞增殖活化和细胞因子产生方面发挥重要的调节作用[13]。多种疾病如类风湿性关节炎[14-15]、系统性红斑狼疮[16]、病毒性乙型肝炎[17]、支气管哮喘[18]和变应性鼻炎(allergic rhinitis,AR)[19]表达均有显著改变。研究学者实验证明IL-35可以通过上调IFNγ来抑制TGF-β受体下游效应器的磷酸化，通过这种途径阻断TGF-β的与其受体的结合，而TGF-β是促进Th17分化的重要细胞因子，因此导致Th17的分化受到抑制[20]。另外，Th17分化的关键转录因子RORγt，在EBI3亚基缺失的情况下，其表达水平增高，也间接说明了，当IL-35数量及功能缺失时，IL-35对Th17细胞的抑制作用减弱[21]。本研究中肺纤维化组IL-17、Th17细胞表达显著高于对照组，IL-35细胞表达水平显著低于对照组，IL-35与IL-17、Th17细胞表达水平呈明显的负相关，而且肺纤维化组Treg细胞表达水平显著低于对照组，IL-35与Treg细胞表达水平呈正相关，与Th17/Treg细胞表达相关性分析呈明显负相关，与Collison等人小鼠模型研究[22]、Chaturvedi等有关人Treg细胞研究[23]试验结果一致。提示肺纤维化中IL-35细胞表达数量的减少可能导致Th17细胞功能亢进及Treg细胞数量或功能的缺失，推测其对于Th17细胞及相关细胞因子的功能状态以及Treg细胞发挥免疫抑制作用、维持Th17/Treg细胞平衡可能起到重要的调控作用。

总之，通过本实验，我们观察到抑制性细胞因子IL-35可能参与Th17/Treg细胞平衡，IL-35表达降低及功能的缺失，可能会影响该平衡机制，甚至出现Th17/Treg失衡参与肺纤维化的发生。从中我们也可以得出新的启发，可否通过增强IL-35表达来调节Th17、Treg细胞表达水平，使IL-35成为肺纤维化免疫治疗提供新的方向，为肺纤维化临床治疗开拓新思路。

参考文献

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