慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease,慢阻肺)是以气流受限不可逆为特征的慢性炎症性肺部疾病[1]。调查显示其发病率高，预后差，每年死于慢阻肺的美国患者就高达1万人，高达美国疾病死亡率第4位[2]。在我国慢阻肺患病率在15岁以上人群的3%，因此控制或减少慢阻肺是一个重大的公共卫生健康话题。有研究显示熊果酸具有抗炎、 抑制肿瘤、抑拮抗凋亡、调节免疫等功效[3-4]，本研究拟用熊果酸处理慢阻肺 大鼠，探讨熊果酸对慢阻肺 大鼠的保护作用及潜在机制。

资料与方法

一、实验动物，试剂 和设备

健康成年雄性SD大鼠30只,体重(220±20) g，购自武汉大学实验动物中心。熊果酸(质量分数>99%,泽郎，南京); 脂多糖(Sigma，美国，1 mg/mL)，水合氯醛(武汉谷歌生物)。TLR-4(CST, USA), MyD88 (CST, USA)，p-p65 (CST, USA) , p65(CST, USA), 白介素-6(IL-6)，白介素1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子(TNF-α)ELASA试剂盒(RD，美国)；引物(擎科生物)，逆转录仪(Eppendorf)，逆转录试剂盒(GeneCopoeia, USA)，紫外分光光度计(Thermo fisher，美国)，显微镜(Olympus BX51，日本)和成像系统(HITMAS-30，日本)

二、实验动物分组

30只SD大鼠随机均分为对照组(Control)，模型组(慢阻肺)和熊果酸组(UA)。采用烟雾暴露联合气道滴入脂多糖构建大鼠慢性阻塞性肺疾病(慢阻肺)模型。熊果酸组烟雾暴露前30 min给予熊果酸(40mg/kg)灌胃，对照组和模型组给予等量生理盐水灌胃，共30天，剂量参考文献[5]。慢阻肺和UA组大鼠每天置于烟室4次，每次1h，共30 d，在第15天起UA和慢阻肺组大鼠气道内注入200 μL脂多糖 ，对照组正常饲养，具体操作参考文献[6]。在第30天，利用腹腔注射水合氯醛麻醉大鼠后，行气管插管，用PBS行灌洗左侧支气管肺泡。将BALF离心、重悬，送医院检验科利用血细胞分析仪检测中性粒细胞数和中性粒细胞之比，并收集右肺和血清，-80 ℃冰箱冻存。

（2）关联规则分析法，该算法是比较基本的数据挖掘算法，其主要的思想是通过大量的数据来提取有用的数据，通过提出对提取数据和过去数据进行比较，找出数据与数据之间的关联性，从而发现其潜在的关系。该算法可以帮助许多商务决策的制定，为商务活动的决策提供可靠的数据依据。

三、肺组织病理检查

取肺组织放置于4%甲醛固定48h后, 石蜡包埋，切片,制片, HE染色观察肺组织病理形态。

但另一方面，即便率先曝光事件并对3位中国当事人表达同情的一些媒体在了解更多细节后也坦言，中国游客在异国他乡也应“入乡随俗”、遵守当地的风俗与规矩，也不能“过度维权”。正如许多熟悉当地情况的朋友所指出的，欧美许多酒店入住时间晚，且并不像东亚酒店那样愿意开放大堂给尚未到入住时间的客人，3名游客凌晨抵达，订单规定入住时间却是当天15时，一家三口在大堂“安营扎寨”十多个小时“不触犯法律”，但对方作为私域管理者不愿通融并要求离开，同样是其权利和自由。

四、ELISA检测血清中和BALF中炎症细胞因子表达水平

取各组血清和BALF按照ELISA试剂盒说明书操作步骤检测血清和BALF中IL-6, TNF-α 和 IL-1β表达水平。

五、RT-PCR检测肺组织炎症细胞因子信使RNA(mRNA)水平

与Control组相比, 慢阻肺组血清中TNF-α ，IL-6和IL-1β表达量均明显增高 (P<0.05)；与慢阻肺组相比,UA组血清中TNF-α ，IL-6和IL-1β表达量均明显降低(P<0.05)。(见表5)。

六、Western blotting检测肺组织蛋白表达:

取肺组织，提取总蛋白。采用10%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，按说明书进行Western blotting 实验，检测TLR4,MyD88, p-p65和p65表达。最后采用ECL 试剂盒显影并成像。每组实验重复3 次，具体步骤参见文献。

 

表1 RT-PCR引物序列

  

基因种属正义链反义链TNF⁃α大鼠ACCAAGGATGAGGGCGACTACAGGCTTATGCCACCACACTTIL⁃6大鼠TGCGCTGGGCTTAGATCATTTGGATGCCTTTTATGTCGTCTIL⁃1β大鼠AGGGAAATCGTGCGTGACATGAACCGCTCATTGCCGATAGβ⁃actin大鼠AGAGGGAAATCGTGCGTGACCAATAGTGATGACCTGGCCG

七、统计

与Control组相比, 慢阻肺组肺脏中TNF-α ，IL-6和IL-1β mRNA表达水平均明显增高(P<0.05)；与慢阻肺组相比,UA组肺脏中TNF-α ，IL-6和IL-1βmRNA表达水平均明显减少(P<0.05), (见表4)。

结 果

一、各组大鼠一般情况

对照组大鼠毛发白皙，光滑，活动性良好，无咳嗽，饮食良好，体重增加率为(85.12±9.23)，慢阻肺组大鼠毛发萎黄，大量脱落，活动性差，经常出现咳嗽，饮食明显减少，体重增加率为(58.23±6.17)，一般情况较对照组明显变差。UA组大鼠毛发少量萎黄和脱落，活动性较差，偶尔出现咳嗽，饮食欠佳，体重增加率为(71.45±7.23)，一般情况较慢阻肺组好。

二、熊果酸对各组大鼠肺组织病理形态的影响

各组大鼠的肺功能主要通多测定肺顺应性(CL)，第0.3 秒用力呼气容积(FEV0.3%)与用力肺活量(FVC) 用力肺活量(FVC)之比和用力呼气流量(MMEF)。结果显示与Control组相比，慢阻肺组大鼠CL，FEV0.3%/FVC和MMEF均明显降低(P<0.05)；与慢阻肺组相比，UA组大鼠CL，FEV0.3%/FVC和MMEF均明显增高(P<0.05)，提示熊果酸可明显改善慢阻肺大鼠肺功能。(见表2)。

三、熊果酸对各组大鼠肺功能的影响。

对照组肺泡壁完整，肺泡间隔均匀一致，肺泡腔充气好，无炎症细胞浸润。慢阻肺组与Control组相比，肺泡间隔明显增厚,肺泡壁厚度明显变薄，肺泡腔萎陷，管腔变窄，萎缩肺泡陷明显增多，可见大量炎症细胞浸润。UA组与慢阻肺组相比，肺泡间隔大多正常，肺泡腔充气良好，可见少量萎缩肺泡，炎症细胞浸润明显减少。(见图1)。

  

图1 HE检测熊果酸对肺组织病理改变的影响

A:Control组(×200); B: 慢阻肺组(×200); C:UA组(×200)

 

表2 熊果酸对CL，FEV0. 3%/FVC和MMEF的影响

  

组别CLFEV0．3%/FEVMMEFControl0．52±0．130．98±0．084．52±0．9COPD0．23±0．07∗∗∗0．54±0．05∗∗∗1．22±0．47∗∗∗UA0．44±0．11#0．81±0．07#3．18±0．63#

注：COPD组与Control组比较，***P<0.001；UA与COPD组比较，#P<0.05

四、熊果酸

与Control组相比，慢阻肺组 BALF 中白细胞计数和中性粒细胞百分比均明显增加(P<0.05)；与慢阻肺组相比，UA组 BALF 中白细胞计数和中性粒细胞百分比均明显降低(P<0.05)。

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2011年，黄委与流域8个省（自治区）水利、环保部门共同签署《黄河流域突发性水污染事件信息通报与沟通协作框架意见》。该成果不仅是黄河突发性水污染事件应急机制在流域层面的拓展，也是建立和完善流域与区域相结合、水利与环保相联合的黄河水资源保护管理体系的一项重要实践。

Western blotting检测结果显示，与Control组相比,慢阻肺组大鼠肺脏中TLR4,MyD88和 p-p65表达明显上调(P<0.05)，而p65表达水平无差异(P>0.05)；与慢阻肺组相比, UA组大鼠肺脏中TLR4,MyD88和 p-p65表达明显下调(P<0.05)，而p65表达水平无差异(P>0.05)。(见图2)。结果显示, 熊果酸可抑制TLR-4/NF-KB信号通路激活。

  

图2 Western Blotting检测熊果酸对TLR4,MyD88和 p-p65表达水平影响

注：慢阻肺组与Control组比较，***P<0.001；UA与慢阻肺组比较，#P<0.05

五、熊果酸对各组大鼠BALF中白细胞计数和中性粒细胞百分比的影响

对各组大鼠肺脏中TLR4,MyD88, p-p65和p65表达水平表达水平影响

 

表3 熊果酸对BALF中白细胞计数和中性粒细胞百分比的影响

  

组别白细胞计数(×106)中性粒细胞百分比(%)Control0．82±0．320．21±0．03COPD1．38±0．37∗∗∗0．45±0．07∗∗∗UA1．04±0．34#0．33±0．04#

注：COPD组与Control组比较，***P<0.001；UA与COPD组比较，#P<0.05

六、熊果酸对各组大鼠肺脏TNF-α, IL-6和 IL-1β信使RNA(mRNA)的表达影响

采用SPSS12.0软件进行分析，计量资料用±s)表示，组间比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

 

表4 熊果酸对TNF-α ，IL-6和IL-1β mRNA表达水平影响(n=10,±s)

  

GroupTNF⁃α(mRNA)IL⁃6(mRNA)IL⁃1β(mRNA)Control1．05±0．151．10±0．251．00±0．05COPD12．50±1．05∗∗∗8．00±0．50∗∗∗4．70±0．65∗∗∗UA4．50±0．45#4．00±0．15#2．10±0．25#

注：COPD组与Control组比较，***P<0.001；UA与COPD组比较，#P<0.05

七、 熊果酸对各组大鼠血清中TNF-α, IL-6和 IL-1β表达量的影响

取右肺组织，提取RNA， 检测RNA含量，反转录，上样，IL-6、IL-1β、TNF-α引物序列如表1所示，扩增条件为：变性94℃(10s)→退火59℃(45s)→60℃(1min)×35个循环，利用图像分析仪器上进行扫描分析，具体步骤参见文献[8]。

 

表5 熊果酸对血清中TNF-α, IL-6和IL-1β表达量 的影响(n=10,±s)

  

组别TNF⁃α(pg/mL)IL⁃6(pg/mL)IL⁃1β(pg/mL)Control110±15100±10100±10COPD1200±200∗∗∗550±60∗∗∗750±100∗∗∗UA550±50#250±50#450±60#

注：COPD组与Control组比较，***P<0.001；UA与慢阻肺组比较，#P<0.05

八、熊果酸对各组大鼠BALF中TNF-α, IL-6和 IL-1β表达量的影响

与Control组相比, 慢阻肺组BALF中TNF-α ，IL-6和IL-1β表达量均明显增高 (P<0.05)；与慢阻肺组相比,UA组BALF中TNF-α ，IL-6和IL-1β表达量均明显降低(P<0.05)。(见表6)。

 

表6 熊果酸对BALF中TNF-α, IL-6和IL-1β表达量 的影响(n=10,±s)

  

组别TNF⁃α(pg/mL)IL⁃6(pg/mL)IL⁃1β(pg/mL)Control1．35±0．251．13±0．211．23±0．18慢阻肺7．56±1．24∗∗∗3．66±0．45∗∗∗4．25±0．55∗∗∗UA4．78±0．57#1．75±0．27#2．56±0．32#

注：慢阻肺组与Control组比较，***P<0.001；UA与慢阻肺组比较，#P<0.05

讨 论

慢阻肺是以气流受限不完全可逆为主要特征的慢性肺部疾病，其发病范围广，在全球均有发病，其发病率高，致死率也高，因此控制或减轻慢阻肺具有重要的临床价值[1-2]。但其致病机制目前尚未阐明，目前研究显示由香烟产生的烟雾等有害气体引发的异常炎症反应可能是慢阻肺的致病机制[7]。因此，在动物构建慢阻肺模型进行相关机制研究具有重要的意义。目前大量实验显示香烟和脂多糖联用是构建慢阻肺的动物模型的最佳途径。因此本实验利用此方法在大鼠建模，发现慢阻肺模型组中大鼠一般物理情况变差，肺组织病理改变增加，肺功能急剧下降，肺组织，血清和支气管肺泡灌洗液(BALF)TNF-α，IL-6和IL-1β表达量均明显增加，此外，BALF中白细胞计数和中性粒细胞百分比也明显增高，这与既往研究报道相一致，提示慢阻肺模型构建成功[6]。而熊果酸具有广泛的抑制炎症的活性[3-4]，本研究显示熊果酸能改善大鼠一般情况，减少大鼠肺组织病理改变，改善大鼠肺功能，减少炎症细胞因子的表达和炎症细胞浸润，激活等。研究进一步证实了熊果酸具有抗炎的活性以及熊果酸可通过抗炎反应减轻慢阻肺，但具体机制不明。因此，本实验进一步探索了熊果酸在慢阻肺中抗炎的途径。

核因子κB(NF-κB)信号途径受上游各种信号刺激分子而激活，跨膜蛋白4(TLR-4)是其中之一，其广泛分布于支气管上皮细胞和肺泡巨噬细胞表面，能通过与革兰阴性杆菌外膜的脂多糖(LPS)结合而激活，继而通过激活髓样分化蛋白88(MyD88)而介导炎症因子的表达。LPS结合TLR4后，激活白介素-1(IL-1)受体相关的活化酶，再磷酸化TGF-β活化酶，继而磷酸化降解NF-κB上游的抑制蛋白IκB等，使p65迁徙入细胞核，诱导TNF-α，IL-6和IL-1β等炎症因子的表达[8-9]。既往有大量研究显示NF-κB介导的炎症信号通路与吸烟引发的气道炎症以及慢阻肺密切关联[9]，因此抑制TLR4/NF-κB信号通路的介导炎症能减轻慢阻肺。实验结果显示慢阻肺组TLR4,MyD88和 p-p65表达明显上调，进一步证实了TLR4/NF-κB信号通路的激活与慢阻肺密切相关，而熊果酸能减少TLR4,MyD88和 p-p65表达。因此，熊果酸能通过抑制 TLR4/NF-κB信号通路介导的炎症而改善慢阻肺。

上海国资委提出，要加快混合所有制改革，优先推进品牌企业整体上市和核心资产上市，鼓励具有一定品牌影响力的国有控股上市公司引入战略投资者实施“二次混改”。

综上所述，熊果酸能改善慢性阻塞性肺疾病，其作用机制与抑制TLR4/NF-κB信号通路介导的炎症相关。但是否还有其他信号通路涉入其中，尚需进一步其中，本实验为防治慢阻肺提供了新的选择。

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参考文献

[1] Putcha N,Drummond MB,Wise RA,et al.Comorbidities and Chronic Obstructive Pulmonary Disease: Prevalence, Influence on Outcomes, and Management[J].Semin Respir Crit Care Med,2015,36(4):575-591.

[2] Hersh CP.Pharmacogenetics of chronic obstructive pulmonary disease:challenges and opportunities[J].Pharmacogenomics,2010,11(2):237-247.

[3] Wo＇zniak ,Skąpska S,Marszaek K. Ursolic Acid——A pentacyclic triterpenoid with a wide spectrum of pharmacological activities[J].Molecules,2015,20(11):20614-20641.

[4] Xie C,Xie Z,Xu X,et al.Persimmon (diospyros kaki L.) leaves: a review on traditional uses, phytochemistry and pharmacological properties[J].J Ethnopharmacol,2015,163(4):229-240.

[5] 彭海兵，储金秀，曹福源，等.熊果酸对矽肺大鼠的早期抗氧化作用[J].环境与职业医学，2015，32(5)：476-480.

[6] 方苏榕，谷伟，谭焰，等.烟熏联合内毒素构建慢阻肺大鼠模型[J].南京医科大学学报(自然科学版)，2013,33(9)：1226-1230.

[7] Kang MJ,Yoon CM,Kim BH,et al.Suppression of NLRX1 in chronic obstructive pulmonary disease[J].J Clin Invest,2015,125(6):2458-2462.

[8] Vijayan V,Khandelwal M,Manglani K,et al.Methionine down-regulates TLR4/MyD88/NF-κB signalling in osteoclast precursors to reduce bone loss during osteoporosis[J].Br J Pharmacol,2014,171(1):107-121.

[9] Metcalfe HJ,Lea S,Hughes D,et al.Effects of cigarette smoke on Toll-like receptor (TLR) activation of chronic obstructive pulmonary disease (COPD) macrophages[J].Clin Exp Immunol,2014,176(3):461-472.