特发性肺纤维化是间质性肺炎中最常见的一种，高发于老年人群，以胸膜下肺基底部分布为主，HRCT上可表现有数量不等、范围有限的磨玻璃影及网格影[1]。有研究报道肺纤维化是由肺组织受到损伤后，修复调节失控及重建异常引起的病理改变，是一系列细胞因子、炎性因子、生长因子等通过多条信号转导通路共同作用的结果[2]。近年来研究发现，肺组织损伤可导致组织蛋白酶及ROS大量释放，诱导炎症小体(NLRP3)高表达，参与慢性炎症形成[3]。白细胞介素-18(Ilterleukin-18，IL-18)通过调控多种细胞信号转导通路，促进炎症发生，细胞分化，细胞因子生成等作用[4]。本实验采用大鼠气管滴注博来霉素制作肺纤维化动物模型，旨在探讨NLRP3/IL-18轴在博来霉素致大鼠肺纤维化中的表达及作用机制，可为阐明这类疾病发病机制及为治疗提供新思路。

资料与方法

一、实验动物

健康清洁级Wistar大鼠45只(雌雄各半)，6周龄，体重180-220g，由哈尔滨医科大学实验动物学部提供[许可证号：SCXK(黑)2013-001]，随机分为健康对照组(N组)、博来霉素组(B组)和地塞米松治疗组(D组)，每组各15只大鼠，于佳木斯大学动物中心饲养。

二、实验材料与试剂

注射用盐酸博来霉素BLM(海正辉瑞制药有限公司提供)，HE染色试剂(湖北锦源医疗科技有限公司提供)；Nikon eclipse 50i显微镜(北京中仪光科科技发展有限公司提供)；NLRP3大鼠ELISA试剂盒(上海恒远生物科技有限公司提供)，大鼠HYP试剂盒(上海劲马实验设备有限公司提供)，RNA提取试剂盒(北京艾德莱生物科技有限公司)，cDNA反转录试剂盒及PCR试剂盒( 大连宝生物工程有限公司)。

三、模型建立及标本留取

B、D组以4mg/kg剂量博来霉素一次性快速推注至气管内，N组给予等体积生理盐水。D组大鼠于肺纤维化造模基础上第2日开始每日腹腔注射地塞米松3mg/kg，N、B组大鼠腹腔注射生理盐水作为对照。各组大鼠于造模后分别于7、14、28天处死，取右上肺组织置于10%甲醛溶液中固定、脱水、石蜡包埋、常规切片HE染色，观察肺组织结构的病理形态学变化；从左肺组织上留取50mg肺组织，制备组织匀浆，用于HYP、IL-37检测；取右肺组织100mg，放入Eppendorf 管内，-80℃保存，用于检测IL-18mRNA表达水平。

四、实验方法

碱水解法测定肺组织HYP含量，ELISA法检测肺组织NLRP3表达水平，均严格按照试剂盒说明书进行操作。

随着时间进展B、D组肺组织IL-18mRNA表达量第7天达高峰，后逐渐下降，于28天仍高于N组，差异有统计学意义(P<0.05)。(见表3，图2)。

五、RT-PCR检测肺组织IL-18mRNA表达水平

N组大鼠肺组织气道上皮光滑，无炎性细胞渗出，无纤维化形成。B、D组大鼠第7天肺组织沿支气管、肺组织大量炎性细胞渗出浸润，累及肺泡腔及肺间质；第14天肺组织、气管、动脉周围炎细胞渗出较前略减少，部分肺泡结构消失，成纤维细胞增生；第28天肺组织大量结构破坏，肺泡间隔明显增宽，肺组织呈明显纤维化改变，B组与D组比较，纤维化程度加重。(见图1)。

六、统计学方法

1)该形式的外置式电流互感器在户外使用时，由于其结构形式极易造成外部水分进入互感器腔体内部，从而导致互感器线圈受潮，安装时应加强其密封，避免雨水进入；

结 果

一、大鼠肺组织病理形态学HE染色结果

提取肺组织总RNA，反转录为cDNA。目的基因IL-18mRNA上游引物：5′-GAGGACTGGCTGTG ACCCTATC-3′，下游引物5′-CCTGGCACACGTTTCT GAAA-3′，扩增片段151bp：内参照 β-actin mRNA 上游引物：5′-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3′，下游引物5′-TTTAATGTCACGCACGATTTC -3′，扩增片段150bp。PCR反应条件按照试剂盒说明书进行。

二、HYP在各组大鼠肺组织中含量

B、D NLRP3含量于第7天达高峰，后逐渐降低，于28天仍高于D组，差异有统计学意义(P<0.05)。(见表2)。

三、NLRP3在各组大鼠肺组织中含量

与N组比较，B、D组大鼠肺组织匀浆中HYP含量于造模后第7天明显升高，28天达高峰，差异有统计学意义(P<0.05)。(见表1)。

其政逆则神怒，神怒则材失性，不为民用。其他变异皆属沴，沴亦神怒。凡神怒者，日、月、五星既见适于天矣。［8］3266

采用SPSS22.0软件进行统计分析 实验结果采用±s表示，多组均数比较采用单因素方差分析，组间多重比较应用LSD-t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

  

图1 各组大鼠肺组织病理像(HE×200 )

a(N 200×)；b(B7 200×)；c(B28 200×)；d(D28 200×)

 

表1 实验大鼠肺组织羟脯氨酸含量(μg/mg)

  

Groupn7d14d28dN1529．25±0．9329．47±0．4629．290±1．39B1548．62±0．62△51．87±1．27△55．69±1．46△D1541．64±2．22△46．205±1．4△50．20±1．45△F84．44101．85139．25P<0．05<0．05<0．05

注： △与N组对照, P<0.05

 

表2 NLRP3在各组大鼠肺组织中含量比较(pg/mL)

  

Groupn7d14d28dN1542．72±0．8643．21±1．2743．13±0．20B1569．39±0．66★62．21±0．69★55．24±0．74★D1564．60±0．71★58．10±1．56★47．90±2．56★F724．95284．8129．27P<0．05<0．05<0．05

Note: ★ is compared with group N, P<0.05

四、大鼠肺组织中IL-18mRNA表达水平

首先，将评估目标使用层次分析法确定评估指标，根据项目评估指标的特征，将评估目标划分为多级评估指标，每级评估指标划下可分为多个次级指标。

 

表3 IL-18mRNA在各组大鼠肺组织中表达水平

  

Groupn7d14d28dN150．35±0．050．39±0．050．37±0．06B151．23±0．07※0．98±0．10※0．70±0．07※D151．10±0．03※0．82±0．07※0．62±0．05※F291．1566．01025．43P<0．05<0．05<0．05

注: ※ 与N组对照, P<0.05

  

图2 为IL-18mRNA扩增图

讨 论

肺纤维化是多种肺部疾病的最终表现，严重影响患者的生存质量[5]。因此研究肺纤维化发生发展机制尤为重要。采用当前国内外公认并广泛应用的气管内滴注博来霉素的实验方法，建立大鼠肺纤维化动物模型[6]，由于HYP含量可以一定程度上反映机体胶原代谢情况，故测定组织中HYP含量，可以反映肺纤维化严重程度[7]。本实验通过一次性快速气管内推注博来霉素4mg/kg后，B、D组大鼠肺组织病理由初期的肺泡炎阶段发展为后期的肺纤维化性变。B、D组HYP含量随时间进展逐渐升高，于28天达高峰，这与Huang等报道一致[8],提示肺纤维化动物模型成功建立。

近年来，关于肺纤维化发病机制中，大量动物实验证明起关键作用的可能不是Th1/Th2型细胞因子[9-10]。目前，有学者认为造成肺纤维化的基础可能是细胞因子的调控失衡作用。因此，细胞因子参与肺纤维化过程中机制的研究逐渐成为热点。

为探讨NLRP3及IL-18在肺纤维化中的表达及意义，实验采用ELISA法测定肺组织匀浆NLRP3含量，RT-PCR法检测IL-18在大鼠肺纤维化模型中动态表达。结果发现，B组中NLRP3、IL-18表达在不同时间点均高于N组，尤其在第7天肺泡炎阶段，NLRP3含量及IL-18mRNA表达达高峰(P<0.05)，这与文献[11]报道相一致。提示NLRP3、IL-18可能与肺纤维化形成过程中早期炎症损伤及纤维化形成密切相关。其可能机制为：配体刺激细胞产生活性氧(reactive oxygen species，ROS)、内吞结晶及特殊分子破坏溶酶体膜[12]，导致释放的组织蛋白酶B进入细胞质，促进NLRP3活化，继而诱导ASC依赖的细胞编程性坏死，导致组织中性粒细胞浸润的炎症反应[13]。有学者发现，在金黄色葡萄球菌肺炎小鼠模型中，NLRP3基因缺乏型小鼠肺炎程度减低，提示NLRP3可加重机体炎症反应发生[14]。IL-18可促进IL-9、IL-13、TNF-ɑ及GM-CSF等的表达[15]；诱导细胞间黏附因子ICAM-1的表达促进炎细胞募集，上调NF-κB的表达和活性[16]。另外，IL-18作用于NK细胞时，上调FasL的表达，增强对阳性靶细胞的毒性[17]，Fas-FasL介导的支气管和肺泡上皮细胞的凋亡也参与博来霉素诱导的肺纤维化[18]。故我们认为IL-18可能是肺纤维化中重要的前炎因子，通过在一定高度调节细胞因子表达参与和维持炎症发生、发展，并因此参与早期肺损伤。本实验中，B、D组NLRP3、IL-18表达均于第7天达高峰，后逐渐下降，提示两者均参与肺纤维化早期肺泡炎症反应阶段，NLRP3高水平表达促进IL-18表达上调，从而加重炎症反应。临床研究证实，NLRP3通过激活CASP1，对下游因子IL-1β及IL-18进行加工，进而释放成熟的炎症因子，进一步募集中性粒细胞，从而放大炎症反应[19]。推测，NLRP3、IL-18在大鼠肺纤维化早期炎症反应阶段发挥重要作用，可能参与了肺纤维化发生与发展。与B组比较，D组NLRP3、IL-18表达量不同程度降低，表明地塞米松干预下肺组织的炎症反应减轻。作为糖皮质激素，通常认为其抗纤维化作用与抑制巨噬细胞增殖和分泌，抑制淋巴细胞及中性粒细胞浸润等有关[20]。

冬虫夏草。冬虫夏草是由冬虫夏草的子壤菌座及其寄生的昆虫残骸构成的复合体。主要分布于海拔3000-4000米高山草甸区的土层中，比如四川、云南、西藏、贵州、青海等省区常见。每100克虫草含有蛋白25.3克、碳水化合物28.9克、脂肪8.4克、粗纤维18.5克，中医认为，其性平味甘，具有补肺肾、止咳嗽、益虚损、养精益元等功能[2]。

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