各种原因导致的牙周炎、牙缺失是临床常见口腔疾病。牙齿缺失严重影响患者的咀嚼、语言等重要生理功能，严重危害患者的身心健康并降低生活质量。目前传统的治疗方式疗效有限，不能完全满足临床治疗的要求。近些年来，随着再生医学的发展，干细胞介导的牙齿组织再生已成为牙周炎及牙缺失治疗的新的发展方向[1]。目前，包括牙周膜干细胞、牙髓干细胞、脱落乳牙干细胞、根尖牙乳头干细胞(stem cells from apical papilla，SCAPs)等在内的牙源性间充质干细胞，因来源于牙及周围支持组织，具有更强的牙向分化能力，已经广泛用于牙及牙周组织再生。在动物模型上，利用自体及异体的间充质干细胞成功再生了生物牙根和牙周组织[2-6]。尽管牙源性间充质干细胞介导的牙及牙周组织再生取得了一些研究成果，但如何进一步提高组织再生效果成为当前研究的热点。组织再生依赖于干细胞的定向分化能力，但牙源性间充质定向分化与组织再生的调控机制尚不十分清楚，因此通过研究牙源性间充质干细胞定向分化调控机制，可有效促进牙及牙周组织再生。

研究发现B细胞淋巴瘤因子6(B cell lymphoma 6，BCL6)的共转录抑制因子(BCL6 co-repressor，BCOR)通过抑制下游基因——转录因子AP2A的表达，进而抑制牙源性间充质干细胞的成骨/成牙分化功能[7]。BCOR具有几种同源蛋白，但如何进一步明确BCOR调控AP2A的剪切体及功能结构域，对提高BCOR调控干细胞分化功能的效果具有重要的作用。BCOR截断蛋白(BCOR isoform short，BCOR-short)是BCOR蛋白的一种亚型，只表达BCOR蛋白部分肽段，分子量较小，容易在细胞内表达[8]。但BCOR-short对牙源性间充质干细胞定向分化的影响尚不清楚。本研究通过在SCAPs过表达BCOR的同源异构基因BCOR-short进行获得性功能研究，来揭示其对牙源性干细胞成骨分化的功能影响。

1　材料与方法

1.1　主要试剂和材料

pQCXIN载体、包装质粒(VSVG和GPZ)(Clone tech公司，美国)，293T细胞(ATCC细胞库，美国)；α-MEM培养基、DMEM高糖培养基、青/链霉素、PBS、胎牛血清、胰蛋白酶、谷氨酰胺、聚凝胺、RIPA细胞裂解液(Sigma公司，美国)，Ⅰ型胶原酶、Dispase蛋白酶、新霉素、Trizol、SSⅢ反转录试剂盒(Invitrogen公司，美国)，抗HA的单克隆抗体(Cell Signaling公司，美国)，抗GAPDH的单克隆抗体(Sigma公司，美国)，HRP标记的小鼠二抗(Amersham公司，美国)，碱性磷酸酶(ALP)活性试剂盒、ALP染色试剂盒、茜素红(Sigma-Aldrich公司，美国)，CD90和CD146(BioLegend公司，美国)；70 μm细胞筛(BD Biosciences公司，美国)，细胞培养瓶(Corning公司，美国)，PVDF膜(Bio-Rad公司，美国)。

1.2　SCAPs分离、培养与鉴定

收集北京口腔医院口腔颌面外科门诊无菌条件下完整拔除阻生牙，用大量含抗生素的PBS冲洗，用眼科剪平根尖分离根尖牙乳头组织，立即在含有青/链双抗的D-Hanks液中反复浸泡；剪碎后加入含3 g/L Ⅰ型胶原酶和4 g/L Dispase蛋白酶的消化液，轻轻震荡，37 ℃消化30 min；过70 μm细胞筛，收集细胞，1 000 r/min离心 10 min，获得单细胞悬液；加入含15%胎牛血清、2 mmol/L谷氨酰胺、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素的α-MEM培养基，接种于60 cm培养皿，37 ℃、5% CO2培养，每2～3 d换液1次。每天在倒置显微镜下观察细胞生长状况，待细胞生长汇合，用0.25%胰蛋白酶按1∶2消化传代；CD90和CD146表面标志物鉴定干细胞，从而获得人SCAPs[9-10]。本研究选用第3～4代的SCAPs用于下列实验。

1.3　质粒构建、病毒包装和稳定转染细胞的建立

全基因合成HA-BCOR-Short(序列来自NCBI数据库，NM_020926.2，基因合成由中美泰和公司完成)克隆至逆转录病毒质粒pQCXIN载体中，构建成pQCXIN-HA-BCOR-Short。

[3]　Wei F, Song T, Ding G, et al. Functional tooth restoration by allogeneic mesenchymal stem cell-based bio-root regeneration in swine[J/OL]. Stem Cells Dev，2013，22(12)：1752-1762[2018-01-04]. http://dx.doi.org/10.1089/scd.2012.0688.

2.2 两组影像学缓解情况的比较 为明确胸腺肽α1在结核性胸腔积液患者影像学吸收方面的作用，分别统计了治疗1个月、2个月、3个月后实验组和对照组在影像学吸收率方面的差异，结果显示，在治疗1个月、2个月、3个月后实验组的影像学吸收率均明显高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），提示在应用胸腺肽α1后患者的影像学吸收率和吸收速度均有所提高，缩短了患者的病程，见表3。

转染前，将SCAPs以5×105个/孔铺到10 cm2培养皿中。24 h后，用含有6 μg/mL聚凝胺的5 mL新鲜培养基替换原培养基，加入pQCXIN-HA及pQCXIN-HA-BCOR-Short的逆转录病毒悬液，37 ℃孵育24 h，用新鲜培养基替换含有病毒的培养基。48 h后，用600 μg/mL新霉素筛选10 d后得到pQCXIN-HA(对照组)及pQCXIN-HA-BCOR-Short(BCOR-Short过表达组)的稳定转染细胞，Western Blot在蛋白水平检测BCOR-Short的过表达效果。

1.4　Western Blot

制造业是我国国民经济的主体，是立国之本、兴国之器、强国之基。中国政府在各种场合提出要把我国从制造业大国建设成为制造业强国，2015年3月5日，李克强总理在全国两会上作《政府工作报告》时首次提出“中国制造2025”的宏大计划。这些愿景要成为现实还需要依靠一大批的高素质应用技术人才。而目前我国正处在制造业转型升级的关键时期，制造业对高素质的应用技术人才需求巨大而且很迫切，因此借鉴德国双元制高等职业教育模式对我国职业教育进行改革，培养符合社会经济发展的高素质应用技术人才势在必行。

应用SPSS 13.0统计学软件，采用Student-T检验进行统计学分析，P<0.05为差异有统计学意义。

1.5　成骨诱导分化

将稳定转染的两组SCAPs以1×105个/孔的密度接种于6孔板，培养至80%汇合后，更换成骨分化诱导培养基(含15%胎牛血清、2 mmol/L谷氨酰胺、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素、100 μmol/L抗坏血酸、2 mmol/L的β-磷酸甘油和10 nmol/L地塞米松)进行培养，每3 d换液。

1.6　实时定量RT-PCR

检测稳定转染后两组SCAPs中AP2A的基因和成骨诱导后0、3、7、14 d骨涎蛋白(bone sialoprotein，BSP)、骨钙素(osteocalcin，OCN)基因的变化。将两组SCAPs以2×105个/孔的密度接种于6孔板，加入1 mL Trizol，利用氯仿、异丙醇抽提，75%乙醇洗涤，室温干燥，用20 μL DEPC水溶解RNA，紫外分光光度计检测纯度和完整性。SSⅢ反转录试剂盒将总RNA反转录成cDNA。反应体系：2×SYBR Green QPCR master mix 10 μL，稀释的Reference Dye 0.3 μL，10 μmol/L上、下游引物各0.2 μL，cDNA 0.3 μL，DEPC水9 μL，总体积为20 μL。反应条件：95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，40个循环。以GAPDH为内参进行实时定量RT-PCR检测SCAPs中BSP、OCN和AP2A的基因表达。PCR引物由上海生工生物公司合成，引物序列见表1。

 

表1　引物序列Tab.1　Sequences of primers

  

基因名称引物序列(5'→3')BSPF:CAGGCCACGATATTATCTTTACAR:CTCCTCTTCTTCCTCCTCCTCOCNF:AGCAAAGGTGCAGCCTTTGTR:GCGCCTGGGTCTCTTCACTAP2AF:CTGCAGGGAGACGTAAAGCR:GGCTAGGTGGACAGCTTCTCGAPDHF:CGGACCAATACGACCAAATCCGR:AGCCACATCGCTCAGACACC

1.7　成骨活性相关检测

成骨诱导5 d后，采用ALP活性试剂盒检测两组SCAPs的ALP活性，总蛋白质浓度作为内参。诱导7 d后，采用ALP染色试剂盒进行ALP染色。诱导2周后，细胞用4%多聚甲醛固定20 min，用2%茜素红染色。钙离子浓度测定：10%氯化十六烷基吡啶(溶在10 mmol/L磷酸钠中)在室温下作用30 min将茜素红染色脱色，利用酶标仪(波长562 nm)测定吸光度值，通过标准钙离子浓度曲线计算样本的钙离子浓度，总蛋白质浓度作为内参。

(四)非独立的尖翎鸟纹。反山遗址出土玉琮、玉钺上的神人兽面纹上神人的上臂靠近肘部左右各有一个尖翎鸟纹，神人兽面纹的下部左右下腿近爪处也有一个尖翎鸟纹。

1.8　统计学处理

第一阶段：建立一个融合标准，第一部分由所有民用要素构成，第二部分由军有民无的要素构成。这样既保证了民用要素分类与代码构成不发生变动，又包含了所有需要考虑的军用要素。

深松作业必须要依靠专业的深松机具，为了提高深松水平，必须要定期对深松机具进行保养，确保设备可以正常使用，提高深松作业水平。

2　结　果

2.1　BCOR-short过表达稳定转染SCAPs建立

分别将pQCXIN-HA及pQCXIN-HA-BCOR-Short逆转录病毒转染SCAPs，经药物筛选，Western Blot检测外源性BCOR-short蛋白水平变化，通过检测HA表面标签结果发现过表达组有外源性BCOR-short的明显表达(图1)。

2.2　过表达BCOR-short抑制SCAPs成骨分化

将稳定转染的两组SCAPst成骨分化诱导后，发现过表达BCOR-short后，SCAPs成骨早期指标ALP染色及活性均明显降低(P<0.01)，茜素红染色及钙离子定量分析结果显示过表达组茜素红染色及钙离子定量均明显降低(P<0.01)(图2)。实时定量RT-PCR结果显示，与对照组相比，过表达BCOR-short后成骨分化指标BSP在成骨诱导后第3和第7天表达明显降低(P<0.01)(图3A)，OCN在成骨诱导后第14天表达明显降低(P<0.01)(图3B)。以上结果表明过表达BCOR-short后，SCAPs体外成骨分化能力明显受到抑制。

2.3　过表达BCOR-short抑制AP2A的表达

[5]　Zhang Y, Xiong Y, Chen X, et al. Therapeutic effect of bone marrow mesenchymal stem cells pretreated with acetylsalicylic acid on experimental periodontitis in rats[J/OL]. Int Immunopharmacol，2018，54：320-328[2018-01-04]. http://dx.doi.org/10.1016/j.intimp.2017.11.028.

  

图1　Western Blot结果Fig.1　Western Blot results

 

A：ALP染色；B：ALP活性；C：茜素红染色；D：钙离子定量分析；**：与对照组比较，P<0.01

图2　成骨活性相关检测

Fig.2　Osteogenesis related markers analyses

3　讨　论

SCAPs存在于牙齿根尖孔的牙乳头组织中，具有较强的增殖率、端粒酶活性和细胞迁移率，增殖能力较牙髓干细胞强2～3倍[11]，具有多向分化潜能，在体外可以诱导分化为成牙本质细胞、成骨细胞、脂肪细胞及软骨细胞等，在体内可以形成牙髓-牙本质复合体样结构、骨、软骨等，是一种很好的牙组织工程种子细胞，可用于牙髓、牙本质的再生和生物学牙

当下，流行文化引导下的时尚健身观更像一种全新的身体规训机制，它划定界限和区域，从体重、体型、饮食以及生活方式上规定着人们不应该逾越的边界，并且有一整套体系，通过健身俱乐部和运动项目作为中介，规训着人们在这个边界里应该做的事情。但是，因为管理、教育、文化及经济方面的因素，这种规训可能显得不合时宜，或者科学性不够。但无论如何，在身体机能日益退化的背景下，这可能是一种不可逆的趋势，我们能够做的，就是在这样的趋势下保持分辨良莠的能力。因此，身体意识的培养，行业的规范化和自我评估就显得尤为重要，惟有如此，健身业在中国才能发展得更好。

 

A：BSP；B：OCN；C：AP2A；**：与对照组比较，P<0.01

图3　实时定量RT-PCR结果

Fig.3　Real-time RT-PCR results

根的再生，具有非常良好且广阔的临床应用前景。但目前其定向分化的调控机制尚不十分清楚，限制了其临床应用。本研究发现在SCAPs过表达BCOR-short基因抑制转录因子AP2A的表达，并且抑制了SCAPs成骨分化。

BCOR是转录抑制因子BCL-6的转录共抑制因子[8]，可以与组织特异性Ⅰ类及Ⅱ类组蛋白去乙酰化酶相互作用，通过组蛋白去乙酰化酶抑制下游基因转录[12-13]。BCOR-short分子量小，容易在细胞内表达，更能有效的用于调控干细胞分化，但BCOR-short是否具有调控牙源性间充质干细胞定向分化的功能尚不清楚。本研究发现，BCOR-short过表达后，SCAPs的BSP和OCN表达降低，成骨分化能力降低。进一步分析BCOR-short下游转录因子发现，转录激活因子AP2A表达降低。AP2A主要表达在胚胎期的神经嵴细胞、面部的间充质细胞、各种上皮细胞、软骨及骨组织细胞中，在面部及骨骼的发育中具有重要的作用[14-16]。以前的研究发现BCOR全长蛋白可以抑制AP2A的表达，AP2A具有促进间充质干细胞成骨/成牙分化及组织再生的功能[7,17-18]。本研究发现在SCAPs过表达BCOR-short也可以抑制转录因子AP2A的表达，提示BCOR-short对SCAPs成骨分化的调控作用可能也是通过调控转录因子AP2A实现的，但需要进一步的功能研究。

综上，本研究发现过表达BCOR-short可以抑制SCAPs的ALP活性、体外矿化能力及成骨分化相关基因BSP和OCN的表达。提示BCOR-short可能具有抑制牙源性间充质干细胞体外成骨分化的潜能，其功能调控作用可能是通过调节转录因子AP2A的表达。

[参　考　文　献]

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293T细胞在DMEM高糖培养基(含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素)培养，每2～3 d换液1次。pQCXIN-HA-BCOR-Short的逆转录病毒质粒和pQCXIN-HA空质粒，与相应的包装质粒(VSVG和GPZ)在293T细胞进行转染，72 h后，收集上清，进行病毒滴度鉴定，分装后-80 ℃保存。

将稳定转染的两组SCAPs以2×105个/孔的密度接种于6孔板，吸取并弃掉6孔板里的培养基，预冷无菌PBS冲洗1遍，取150 μL RIPA细胞裂解液加1∶100蛋白酶抑制剂于冰上裂解细胞。用细胞刮刮脱细胞，收集裂解液至1.5 mL离心管，13 000 r/min离心15 min，收集上清，加入上样缓冲液加热10 min变性。采用10% SDS聚丙烯酰胺胶电泳，每个样本上样25 μg总蛋白，半干转印法转移到PVDF膜。5%脱脂奶粉室温封闭1 h，加入一抗(抗HA的单克隆抗体1∶1 000，抗GAPDH单克隆抗体1∶100 000)，置于4 ℃摇床上慢速摇晃过夜。TBST洗涤3次，加入采用HRP标记的小鼠二抗(1∶3 000)。TBST洗涤3次后，暗室加发光液液，曝光，显色。

春季使用杀虫药的用量应为低剂量，夏季和秋季可视水质情况适当提高用量。因季节交替而引发的气温、水温剧烈变动时不宜使用有机磷及菊酯类杀虫药，确需杀虫时可选用阿维菌素、伊维菌素为主要成分的杀虫药，同时开动池塘增氧机。

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实时定量RT-PCR结果显示，过表达BCOR-short抑制SCAPs中成骨分化关键转录因子AP2A的表达(P<0.01)(图3C)。

调压井地层岩性为第四系中更新洪积（Q2pl）低液限黏土，淡红、棕色、稍湿、硬塑，结构较密实，含钙质结核。围岩厚度2～36 m，局部地段夹级配不良砂、卵石混合土层透镜体，无地下水影响，围岩土体极不稳定，围岩类别为V类，应及时进行支护和衬砌。调压井横断面见图1。

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1、学员年龄较大，文化程度较低。在我国工业化、城市化进程中，许多有学历、有文化的人离开农村，到城市定居和工作。不同于那些脱离传统农业的人，现有的农业从业人员大多数文化程度较低，学习的主观能动性不强，特别是对理论的学习兴趣不大。又因为年龄偏大，他们对知识技能的理解、接受速度较慢。单纯的灌输理论、单向的讲授知识点，授课效果未必理想。如果讲课不能引起他们的兴趣、契合他们的需求和激发他们的共鸣，那么，在上课过程中，时间一久，他们往往会坐不住、听不进，交头接耳，甚至影响课堂纪律。

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例如，教师可以告诉学生“自己的身体就是最好的乐器”，并要学生通过肢体动作的变换，来让其发出一些节奏感较强的声音，推动教学的开展，达到培养学生节奏感的目的。如，教师可以让学生甩甩头、拍拍腿、跺跺脚、拍拍手等，随着音乐作出相应的摆动，使其的节奏感得以逐步的增强。譬如，在《假如幸福的话拍拍手吧》这一歌曲中，教师就可以让学生借助肢体语言来感知节奏，使其的节奏感得到提高，使得培养效果达到最佳。