心房颤动(atrial fibrillation，AF)是临床上最常见的持续性心律失常，房颤发病率随患者年龄的增加而变化。老年非瓣膜性心房颤动(nonvalvular atrial fibrillation，NVAF)在75岁以上的人群发病率可达到10%[1]。极易诱发栓塞性脑卒中，预防卒中是AF治疗重要目标之一。抗凝是降低卒中及病死率的关键，临床上常采用华法林长期应用，预防卒中的发生。华法林具备抗栓及抗凝活性，能减少病死率，但是其治疗窗窄，个体差异大，遗传因素是造成个体剂量差异的主要原因之一[2-3]。华法林的代谢主要受药物代谢酶的影响，细胞色素P450酶是华法林的主要代谢酶。CYP2C是细胞色素氧化酶P450的主要成分，占总量的20%。有研究表明，CYP2C9和CYP2C19在华法林的代谢过程中发挥重要作用，CYP2C9及CYP2C19基因的多态性导致酶活性的改变，可能影响患者华法林体内血药浓度的个体差异[4-5]。本研究旨在探讨CYP2C9与CYP2C19基因多态性对老年NVAF患者华法林疗效的影响。现报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2013年6月至2015年6月解放军305医院收治的156例老年NVAF患者为研究对象。其中，男性86例，女性70例；年龄65～86岁，平均年龄(70.36±6.73)岁；体质量指数17.86～35.92 kg/m2，平均体质量指数(24.37±5.63)；基础疾病：合并高血压病93例，合并冠心病48例，合并糖尿病38例。本研究经医院伦理委员会批准，患者均签署知情同意书。

1.2 纳入与排除标准 纳入标准：服用华法林的时间至少3个月；服用剂量相同的情况下，连续3次国际标准化比值(international normalized ratio，INR)在治疗范围内。排除标准：患肝功能异常、癌症、先心病、肝疾病、出血性疾病等抗凝药物禁忌证；同服抗癫痫药物、抗结核药物、巴比妥类药物等与华法林有相互作用的药物。

在本文收尾时，不禁要追问一句：既然“以古文为时文”有助于应举，那么桐城派中的一些重要作家如刘大櫆、方晞原、方东树、刘开等人为何科名不显，始终中不了举人？按常理，这些在古文上造诣良深的作家写作时文也会得心应手，中个举人，应该没有多大问题。

1.3 研究方法

3.由于招标代理机构对有关政策规定把握不住，业务能力不强引起的不规范行为。一是招标采购文件存在以不合理的条件对供应商实行差别待遇或者歧视待遇条款。二是采购文件未体现政府采购促进中小微企业发展之政策。三是采购公告内容信息不完整。四是采用综合评分法时评审标准中的分值未与评审因素的量化指标相对应。五是采购需求中的技术要求指向特定产品。六是采购文件将非进口投标产品生产厂家授权函原件及售后服务承诺函原件作为资格条件。

1.3.2 CYP2C9和CYP2C19基因型的检测 静脉采集抗凝血5 ml，按照QIAGEN基因组DNA 提取试剂盒说明书从血细胞中提取基因组DNA。取1 μl上游引物，1 μl下游引物，80 ng基因组DNA，10 μl 2×Taq Master Mix，去离子水补足20 μl 进行PCR扩增 [7-8]。见表1。

 

表1 CYP2C9 和CYP2C19 基因扩增

  

基因位点引物退火温度片段大小CYP2C9*3F:5'-AATAATAATATGCACGAGGTCCAGAGGTAC-3'61141R:5'-GATACTATGAATTTGGGACTTC-3'CYP2C19*2F:5'-AATTACAACCAGAGCTTGGC-3'60169R:5'-TATCACTTTCCATAAAGCAAG-3'CYP2C19*3F:5'-TATTATTATCTGTTAACTAATATGA-3'53329R:5'-ACTTCAGGGTTGGTCAATA-3'

2.2 不同基因变异情况的患者初始抗凝疗效 CYP2C9和CYP2C19基因均变异的患者INR首次达标天数、华法林总剂量及平均日用量均低于其他患者，差异有统计学意义(P<0.05)；只有CYP2C9基因变异的患者首次INR达标时所需的华法林总剂量和平均日用量减少，与2个基因均无变异的患者比较，差异有统计学意义(P<0.05)；而CYP2C9和CYP2C19 基因同时变异的患者与只有CYP2C9基因变异患者相比，INR首次达标的平均时间缩短，差异有统计学意义(P<0.05)；需要的华法林总剂量及平均日用量有减少的趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)。

1.3.1 药品与试剂 选择美国NEB公司的限制性内切酶及缓冲液(SmaI酶、BamHI酶和KpnI酶及NEBuffer 4和NEBuffer 1)；引物参考文献[6]，设计由北京普洛麦格生物技术有限公司合成；2×Taq Master Mix(北京普洛麦格生物技术有限公司)；QIAamp DNA Blood Mini Kit(德国QIAGEN公司)。

2.1 不同CYP2C9和CYP2C19基因型患者华法林初始抗凝疗效 CYP2C9野生基因型患者的INR首次达标时间较突变型患者明显延长，且INR首次达标时所需的华法林总量高于突变型患者，差异有统计学意义(P<0.05)；CYP2C19突变基因型患者的INR初次达标天数、华法林达标时总用量及达标平均日用量与野生型患者比较均有所降低，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

2 结果

1.4 统计学方法 采用SPSS 18.0统计学软件对数据进行分析，计量资料采用均数±标准差表示，组间比较采用t检验；计数资料以例(百分率)表示，组间比较采用χ2检验，以P<0.05表示差异有统计学意义。

 

表2 不同基因型患者华法林初始抗凝疗效比较

  

基因型INR初次达标天数/d华法林剂量/mg达标时总用量平均日用量CYP2C9野生型10.06±2.6435.28±14.973.94±1.05突变型6.91±1.4621.44±12.743.21±0.74CYP2C19野生型9.01±2.8332.43±16.953.27±1.03突变型7.07±2.6329.03±15.842.71±0.61

1.3.3 基因型的确定和分组 利用限制性酶切片长度多态性法检测PCR产物。根据CYP2C9和CYP2C19 的基因多态性将患者分为4种：CYP2C9野生型(CYP2C9*1*1)、CYP2C9突变型(CYP2C9*3)、CYP2C19野生型(CYP2C19*1*1)、CYP2C19突变型(CYP2C19*2 或CYP2C19*3)。其中，CYP2C9*1*1等位基因频率为92.3%(144/156)，CYP2C9*3为7.7%(12/156)；CYP2C19*1等位基因频率为66.0%(103/156),CYP2C19*2等位基因频率为28.2%(44/156)，CYP2C19*3等位基因频率为5.8%(9/156)，比较不同基因型患者采用华法林的初始抗凝疗效。

 

表3 不同CYP2C9 + CYP2C19 基因型患者初始抗凝疗效比较

  

CYP2C9CYP2C19INR初次达标天数/d华法林剂量/mg达标时总用量平均日用量*1*1*1*111.02±1.4136.37±19.484.61±0.69*1*1*2 or *39.01±1.8734.08±15.523.62±0.98*1*3或*3*3*1*18.04±1.6125.52±13.162.84±0.90*1*3或*3*3*2或*36.57±1.1120.81±12.472.06±0.40

3 讨论

近年来，NVAF的发生明显增多，NVAF发生脑卒中是同年龄段的无AF患者的5.6～7.1倍，且危险性随着年龄的增加而增加，80岁以上人群发病率高达32.86%[9-10]。口服抗凝药物可降低AF血栓栓塞的危险性，减少出血等并发症[11]。以华法林为代表的维生素K 拮抗剂现已广泛用于AF患者中，预防卒中的血栓栓塞事件，抗凝效果明确、可靠。有研究表明，AF患者接受华法林治疗每年可降低8.9%的危险性[12]。

问题导学法在初中数学教学中的应用，可以积极引导学生在学习中的思维导向，帮助学生明确解题思路，更好地对知识进行探索与实践。教师在教学过程中应当结合教学内容，从学习课堂的各个层面对学生进行问题导学法的教学，促使学生良好数学思维能力的提升，也为初中数学教学良好的质量奠定基础。

华法林是临床上最常用的香豆素类口服抗凝药物，主要用于预防和治疗血栓性疾病。临床上使用的华法林是S-华法林和R-华法林的消旋体混合物，其中，S-华法林是主要有效成分，其抗凝活性是R-华法林的3～5倍，主要经CYP2C9酶催化代谢[13]。CYP2C9* 3 可解释10%左右的华法林剂量的个体化差异，还有其他基因位点影响华法林剂量[14-15]。CYP2C19主要代谢R-华法林，但是R-华法林可能与华法林临床效果关系不大，因此一直未受到关注[16]。有研究表明，R-华法林与华法林的药效学有明确的影响，因此猜测CYP2C19多态性与华法林剂量个体间差异是有关系的[17]。CYP2C9、CYP2C19属于细胞色素P450系统中两种非常重要的药物代谢酶，参与体内多种药物的代谢过程。CYP2C9、CYP2C19均具有高度多态性，存在多种碱基突变，对酶的活性产生一定的影响，从而影响药物代谢。CYP2C9主要突变型是CYP2C9*2和CYP2C9*3，但中国汉族人群最常见的突变型基因以CYP2C19*3为主[18]。CYP2C19主要突变型是CYP2C19*2和CYP2C19*3，这些突变由于提前产生终止密码，终止蛋白合成，使酶活性丧失，导致代谢能力下降[7,19]。本研究发现，CYP2C19变异对华法林的药效影响不大，但若CYP2C9和CYP2C19基因均发生变异则作用明显增强，与仅发生CYP2C9变异的患者比较，两基因同时变异可导致患者的INR初次达标天数减少。CYP2C9在华法林的体内代谢过程中起主要作用，但CYP2C19也参与其代谢。CYP2C9和CYP2C19基因的变异会引起部分患者华法林代谢减慢及半衰期延长，从而导致其体内华法林血药浓度增高，抗凝作用更强，若两基因同时变异，则出血的危险可能增加。

中华人民共和国成立前的军用粮票种类丰富，这是我党我军在特定历史条件下的必然产物，极其珍贵，但其种类还无法统计完全，有待继续挖掘和考证。

综上所述，CYP2C9的基因多态性是影响华法林维持剂量重要的遗传因素，而CYP2C19的基因多态性对华法林的维持剂量影响较小，可根据患者基因型的不同合理分配华法林剂量。

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