糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病严重的并发症之一，也是终末期肾病(end stage renal disease，ESRD)的致病原因。近年来，我国DN的发病率呈不断上升的趋势。多聚二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，ADP)核糖聚合酶(poly-ADP-ribose polymerase，PARP)是一类存在于多数真核细胞中的蛋白质翻译后修饰酶，能选择性地识别并结合DNA缺口的DNA结合蛋白酶，具有保持染色体结构完整、参与DNA复制和转录的功能，在维持基因组稳定和细胞死亡的过程中发挥作用[1]。有研究表明，高糖可通过过度激活PARP来诱导tPA/PAI-1功能紊乱，促进细胞外基质的增生，提示其在糖尿病病程中可能发挥重要作用[2-4]。 MicroRNA(miRNA)是一类由内源基因编码长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子，其在动植物中参与转录后的基因表达调控。有研究表明，多种miRNA在肾有表达，其异常调控与肾疾病密切相关[5]。目前，有研究发现，miR-222是重要的肿瘤相关基因，调控肿瘤细胞周期、增殖及侵袭[6]；还可能参与糖尿病的发生[7]。Neijenhuis等[8]研究发现，hsa-miR-222能增强PARP-1抑制剂对癌细胞PARP-1的敏感性。因此，本研究旨在探讨miR-222是否参与高糖刺激下人肾系膜细胞PARP-1的调控。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 D-葡萄糖(D-glucose)购自Sigma公司，miR-222模拟物、miR-222抑制物均购于上海吉玛生物公司[模拟物：5’-agcuacaucuggcuacugggu-3’hsa-miR-222成熟体序列)；抑制物：5’-ucgauguagaccgaugaccca-3’(hsa-miR-222成熟体反义序列)]。miR VanaTM PARlSTM Kit、iScripTMcDNA Synthsis Kit、QPCR的SYBR Green Mix Kit由吴斯佳硕士惠赠。细胞培养用RPMI 1640，胎牛血清购自Gibco公司；Trizol溶液购自美国Invitrogen公司；胰岛素购自甘李药物公司；细胞裂解液、辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)标记的兔抗大鼠Ⅱ抗购自Cell signaling公司；兔抗大鼠PARP-1一抗购自CHEMICON公司；小鼠抗人纤维连接蛋白(fibronectin，FN)一抗购自Santa Cruz公司；兔抗大鼠PARP-1一抗购自CHEMICON公司；RevertAid TM First Strand cDNA逆转录试剂盒购自Fermentas公司；Taq DNA聚合酶购自Takaka公司。其他化学试剂为国产分析纯。

1.2 研究方法

1.2.1 细胞培养 人肾系膜细胞株(HMC，由吴斯佳硕士惠赠)培养于含有15 %胎牛血清及0.6 U/ml胰岛素的RPMI 1640培养基中。细胞培养至85%融合，换用无血清培养基培养24 h后，换用新鲜无血清的低糖DMEM培养基(5.5 mM葡萄糖)。将HMC细胞分成6组：对照组(5.5 mM葡萄糖)、高糖培养组(25 mM)、高糖(25 mM)+抑制物阴性对照组、高糖(25 mM)+miR-222抑制物组、高糖(25 mM)+模拟物阴性对照组、高糖(25 mM)+miR-222模拟物组。采用高糖(25 mM葡萄糖)刺激HMC 24 h后，部分细胞分别转染miR-222抑制物阴性对照、miR-222抑制物，miR-222模拟物阴性对照及miR-222模拟物，采用正常糖培养(含5.5 mM葡萄糖)培养HMC作对照。

在教学的过程中，教师应该时刻注重知识内容与生活的结合，促进生活化教学模式的构建，实现教学活动的不断优化。生活指导式教学和生活实践式教学，是生活化教学的主要方式。生活指导式教学，就是教师在开展道德与法治教学的过程中，将生活中的小常识或者生活道理融入到教学内容中，帮助学生培养起基本的道德与法治意识。生活实践式教学，则是教师在教学的过程中能够不断引导学生通过直接参与生活的方式，掌握必要的生活技能。

1.3 统计学方法 采用SPSS 23.0统计学软件对数据进行分析。计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用ANOVA方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2.1 高糖刺激下HMC的miR-222表达情况 实时定量PCR显示，高糖培养组HMC在24 h时miR-222的表达上调，较对照组上调2.53倍，两组间比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。

机构共现能够反映某一领域的核心机构及其合作强度，科学客观地评价研究机构的学术影响力，并得到发表论文数量6次及以上的机构是5个(见表1)。由表1可知，我国老年人运动干预研究机构主要是各地方高校，以北京体育大学为首，发文量为12篇。从区域角度来看，该领域的研究主要集中在北京、上海、南京、沈阳等发展较快的城市，一定程度上说明我国老年人运动干预领域的科研能力与地区的发展水平成正相关。

1.2.2 目的microRNA转染 转染前1 d，将2 ml无抗生素培养基中接种(2.5～10.0)×105个细胞，待细胞融合度达到70%后，准备转染。使用Opti-MEM低血清培养基250 μl稀释4 μg目的microRNA(所有对照组加入等量的无菌水)并轻轻混匀；Opti-MEM低血清培养基250 μl稀释Lipofectamine 2000转染试剂10 μl，轻轻混匀后室温静置5 min，将稀释好的目的microRNA及转染试剂溶液混合(总体积500 μl)，轻轻混匀并室温下静置20 min，每个孔中加入500 μl混合液，十字交叉法摇动细胞培养板，使溶液与培养基充分混匀，置入37℃，5%CO2培养箱培养24 h后，更换新鲜培养基，再转移入培养箱继续培养24 h。

2 结果

1.2.3 miR-222表达水平的检测 采用实时定量PCR检测miR-222表达时，将细胞分为对照组(5.5 mM葡萄糖)、高糖培养组(25 mM)两组，检测高糖(25 mM葡萄糖)刺激24 h，HMC的miR-222表达情况。对照组培养HMC作对照，每份样品重复检测3次。先利用miR VanaTM PARlSTM Kit提取包括miR在内的总RNA。采用iScripTM cDNA Synthsis Kit逆转录为模板DNA，然后使用SYBRGren Mix Kit进行定量PCR，每份样本设3个复孔，按说明书进行具体操作。所有反应均应用ABI750实时定量PCR仪完成。

  

图1 高糖(25 mM)刺激下HMC细胞miR-222的表达

习近平总书记在革命圣地井冈山视察时提出，“井冈山要在脱贫攻坚中作示范、带好头”。如今，井冈山在全国600多个国家重点贫困县中第一个“摘帽”。

2.3 miR-222对HMC的FN表达影响 HMC细胞转染miR-222模拟物，可有效下调FN的表达，是高糖培养组的60.9%，两组间比较，差异有统计学意义(P<0.05)；而转染miR-222抑制物可上调其靶蛋白PARP-1的表达，较高糖培养组升高18.8%，两组间比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见图3。

1.2.4 Western blot的检测 收集各组细胞，用PBS清洗后加入细胞裂解液,经超声粉碎、离心后留取上清。取10 μl上清测定浓度，剩余储存于-80 ℃备用[1-2]。细胞总蛋白提取物做Western blot检测，分析6组细胞PARP-1、FN蛋白的表达。以β-actin为内参，用目的蛋白条带灰度值与内参灰度值的比值代表目的蛋白的相对表达含量。

2.2 miR-222对HMC的PARP-1表达影响 高糖+miR-222模拟物组HMC转染miR-222模拟物，可有效下调其靶蛋白PARP-1的表达，是高糖培养组的52.2%，两组间比较，差异有统计学意义(P<0.05)；高糖+miR-222抑制物组HMC转染miR-222抑制物可有效上调其靶蛋白PARP-1的表达，较高糖培养组升高17.3%，两组间比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2。

  

图2 miR-222对HMC细胞PARP-1表达的影响

  

图3 miR-222对HMC细胞FN表达的影响

3 讨论

miR在各种组织和细胞中均有表达，且存在组织特异性。miR-222基因定位于Xp11.3。有研究发现，miR-222在甲状腺乳头状癌、恶性胶质瘤、肝细胞瘤、胃肠间质瘤、结肠癌、肺癌、乳腺癌、膀胱癌等多种肿瘤中均有异常表达[6，9-10]。近年来，有研究证实，miR-222是抗血管生成因子，影响人内皮细胞促肿瘤基因c-Kit受体的表达，调节参与细胞周期及血管生成的干细胞因子活性。miR-222的过表达可显著减少细胞的迁移。miR-222还可调节内皮细胞内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)，NO调节机制是血管生成、毛细血管网络的成熟及血管重构的重要机制[11]。人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)产生的miR-222调节Ets-1转录因子。血管紧张素Ⅱ、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)及凝血酶刺激Ets-1等在炎症及微管形成中发挥关键作用[12]。Togliatto等[13]报道，miR-222调控P27KIPI、P57KIPI进而促进内皮细胞、内皮祖细胞的增殖以及血管生成。有研究表明，在血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)中，miR-221/222具有促增殖，前向迁移及抗凋亡的作用。miR-221/222在内皮细胞(endothelial cells，ECs)中具有抗增殖、抗迁移及促凋亡的作用[14-15]。也有文献报道，SHEV ORF3诱导的miR-221/222可下调HEK293细胞中p27(kip1)的表达[16] 。而miR-222参与调节糖尿病。有研究证实，妊娠期糖尿病患者的miR-222可调节雌激素相关胰岛素抵抗时胰岛素受体的表达[12]。Togliatto等[13]通过小鼠体内实验证实，高糖及晚期糖基化终产物(advanced glycation end products，AGE)能损伤血管，且体外功能性研究显示高糖和AGE可使miR-221/222的表达下调，进一步上调其靶向细胞周期蛋白依赖性激酶阻遏蛋白P27KIPl及P57KIP2的表达而抑制细胞周期的进程，导致内皮细胞和内皮祖细胞增殖受损，进而减少新生血管的生成。Kothapalli等[17]发现，糖尿病和高脂血症诱导的炎症反应[细胞因子如TNF-α，白细胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)和白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)的产生]可以通过选择性下调miR-10a，miR-139b，miR-206及miR-222的表达来上调连接蛋白/Rho激酶。代谢性炎症诱导的miRNAs连接蛋白/Rho激酶调控途径的变化是血管超反应和器官损伤的主要原因。hsa-miR-222的过表达可通过抑制RAD51的表达，损伤细胞功能，进而增加对PARP抑制剂奥拉帕尼(olaparib)的敏感性[8]。

PARP是一类存在于多数真核细胞中蛋白质翻译后的修饰酶，其主要存在于细胞核内，少量存在于细胞浆内。其能选择性地识别并结合DNA缺口的DNA结合蛋白酶，主要通过修复DNA单链及双链断裂维持基因组的完整性。DNA损伤后，PARP被DNA缺口激活，将烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotid，NAD+)拆分为烟酸和二磷酸腺苷核糖(adenosine diphosphate ribose，ADPR)，然后催化生成ADPR多聚体并结合到组蛋白、核转录因子(如NF-κB)等。被化学修饰的ADPR多聚体与GAPDH结合，降低其活性。PARP-1是由1 014个氨基酸残基组成的一条多肽链，分子量为113 kDa，为PARP家族中最早发现、研究最彻底的成员。笔者在前期研究中发现，PARP-1存在于肾小球系膜细胞中，高糖诱导肾小球系膜细胞中PARP-1生成增加，同时上调Ⅳ型胶原(collagenIV，COLIV)、FN，引起tPA/PAI-1比值降低；PARP-1抑制剂(PJ34)能下调PARP-1的表达，并下调COLIV、FN的表达，提升tPA/PAI-1比值[2]。PARP-1能介导血管紧张素Ⅱ引起的系膜细胞增殖及PAI-1与细胞外基质的FN表达[4]，从而证实了PARP-1在DN的发病机制中发挥重要作用。

综上所述，高糖可上调人肾小球系膜细胞miR-222的表达，提示miR-222可能参与糖尿病的发病过程。本研究利用Targetscan生物学信息网站预测分析，发现PARP-1是人miR-222的靶基因，并找出其可能结合的位点。本研究结果证实，HMC细胞转染miR-222模拟物，可有效下调其靶蛋白PARP-1的表达，提示miR-222可能通过靶向下调PARP-1的表达。DN的特征表现包括肾小球系膜细胞外基质的沉积，COLIV、FN是重要的肾小球系膜细胞外基质蛋白。笔者既往的研究证实，高糖诱导肾小球系膜细胞中PARP-1的生成增加，同时上调COLIV、FN[3]。本研究也发现，HMC细胞转染miR-222模拟物，可有效下调FN的表达。因此，miR-222可能通过靶向下调PARP-1的表达，促进肾小球系膜细胞外基质的增生，为深入认识DN的发病机制提供了科学依据。

第三，实验环境的搭建，需要进行特征提取和筛选，建立一个良好的实验环境对图像质量的好坏有很大的作用，在拍照所选择的相机镜头，拍照过程中的背景、灯光、相机的视场等，都会对最终农产品的分类结果产生一定的影响，同时也要利用这个实验环境进行实验验证，因此搭建什么样的实验环境是该设计中的一个重点和难点。

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