龋病是发生在牙齿的慢性感染性疾病，其中低龄儿童龋（early childhood caries，ECC）是影响儿童口腔健康的最主要的慢性疾病之一[1]。ECC不仅影响儿童期口腔健康，还可以引发一系列的感染和疼痛，严重影响患者的生活质量[2-3]。世界卫生组织对186个国家的人群口腔健康进行长达20年的纵向调查，结果显示：在大部分国家，龋病仍影响着60%~90%的学龄儿童[4]。因此，针对龋病的病因学研究、风险评估乃至预防策略都是当今研究的重点问题[5]。

采用由Rudolph Technologies公司生产的AXI™ Series-Axi940/EB-30缺陷检测仪检测铜晶圆CMP后的表面缺陷(包括刮伤、腐蚀、颗粒玷污等状况)，该仪器能形成整个晶圆的表面缺陷图并统计缺陷数量，当超过30 000个缺陷时，系统将无法继续对晶圆扫描而终止检测，只能显示区域性红色标志。

共产党人的哲学，永远都是在艰困中开拓，在阻难中前行，在实现民族复兴、人民幸福的道路上，我们的哲理永远只有一个，那就是坚定信念，奋发进取，矢志不移地奋进在中国特色社会主义的大道上！而中国特色社会主义所强化和凸显的，则也正是我们雄威壮美、如钢似铁的道路自信！

老姆登村位于怒江东岸的碧罗雪山，海拔从1300米至2300米，6个自然村，12个村民小组。全村有317户,1168人。村子海拔2000米以上为人工防护林及原始森林。种植业与林副业相结合，种植业尤为发达。目前村里正在实施一户一宅的政策，村民们不能建新房，也不能加盖房屋，因此限制了旅游发展。国家公园的建设将会对当地的旅游业发展带来机遇，但游客的到来也会破坏杜鹃林，因此，村委会制定了保护七莲湖的规定，包括禁止乱砍乱伐，呼吁导游带游客到七莲湖时自带煤炭来解决生活用火，并要求村民加强监督。

人类与其体内共生的微生物（即共生菌群，亦称人体微生物组）共同组成一个超级生物体，而口腔的健康与疾病状态依赖于宿主与口腔微生物群落之间的相互作用[6]。龋病四联因素学说认为，细菌、环境、宿主、时间均是龋病发生的必要条件，细菌是其中一项重要环节。2000年以来，获得越来越多学者认同的“生态菌斑假说”[7]亦为龋病的微生物病因学研究提供了新切入点。口腔菌群是人体内最复杂的微生物群落之一，其中绝大多数微生物不可培养[8]。由于技术手段和分析策略的局限性，极大地限制了对龋病根源进行全面而精准地解析。近年来，人类微生物组学计划的深入开展和高通量测序技术的迅猛发展为口腔菌群研究提供了前所未有的崭新视野，同时为龋病的微生物病因学的深入认知带来了新契机。

唾液收集：筛选进入研究的儿童取样前一晚及当天早晨不刷牙，上午9时进行样本收集。取样时，嘱儿童把自然、未受刺激的唾液缓慢吐入无菌50 mL离心管中，持续5 min，对样品分别编号，封口至4 ℃采样样品保存箱，置于-80 ℃冰箱中保存。

1 材料和方法

1.1 样本采集

最后，龋病风险评估已经成为了当今龋病研究的一个重点问题，也是现代龋病防治的重要组成部分[5]。本研究基于唾液菌群细菌属和筛选的4个菌属，分别建立了龋病风险评估模型，区分健康和龋病样品的准确率均可以达到70%以上；特别是基于筛选的4个微生物因子的龋病评估模型与基于全菌谱的龋病评估模型性能较为相似，这一结果提示可以利用这4个菌属建立快速、准确而便捷的龋病风险评估方法。

1∶1）。所有儿童要求检查前1个月未服用抗生素，口唇黏膜颜色、质地均未见异常，没有发育畸形及全身性疾病等先天疾病，近1个月内未佩戴口腔活动矫治器。整个实验流程各项细节及以后的数据发表均得到青岛大学医学伦理委员会批准，同时征得儿童监护人同意。

然后，对于种系发育信息的结果，本研究得出的主要细菌门构成与既往关于儿童口腔牙菌斑的研究[10-11,13]相互验证，但在两组人群中无明显差异。本研究未发现有该类“龋特异性”细菌存在，但观察到在两组人群中丰度存在显著差异的“龋相关性”细菌种类。在细菌属水平，S-ECC者检测到显著增加的（增加约7%丰度）Prevotella属，且发现此属的更高级分类亦在S-ECC组中高表达，包括纲水平上的Bacteroides，目水平上的Bacteroidales，科水平上的Prevotellaceae。Prevotella为无芽孢革兰阴性厌氧杆菌，体外培养时缺乏致龋相关的产酸特性，仅具备中度耐酸能力[14]，并非常规意义上讲的致龋性较强的细菌，如Streptococci mutans或Lactobacilli等[15]；但是其他一系列依赖相同或者不同技术手段的龋病菌群研究[9,16-17]也有类似结果，即发现Prevotella与龋病关系密切。Simón-Soro等[18]发现，在牙本质龋样品中胶原酶过量表达，而该基因主要来源于升高的Prevotella属，提示Prevotella可能并非通过传统的致龋特性（产酸、耐酸等）参与了牙体组织脱矿而诱发龋病，而是潜在性地通过自身的蛋白溶解特性参与了龋病发展这一过程。

1.1.2 样本采集方法   口腔检查：由两名牙体牙髓专科医生以视诊结合探诊的方式进行检查，检查器械均经高温高压严格灭菌消毒。在检查前统一认识、方法和标准，标准一致性检验的Kappa值均大于0.83。采用世界卫生组织《口腔健康调查基本方法》（1997年）对龋病的诊断标准诊断龋病。

本研究采用新一代的高通量生物技术（454 GS FLX Titanium）并结合多元统计分析手段，旨在全面解析口腔唾液微生物群落的生态特征，并对重症低龄龋儿童及健康儿童的唾液菌群进行相互比较分析，探讨可能的参与龋病发生发展的微生物因素。

1.2 基因组DNA提取、聚合酶链式反应（polymerase         chain reaction，PCR）扩增及测序

采用DNeasy® Blood and Tissue kit（Qiagen公司，美国）试剂盒纯分离样本中基因组DNA，定量测定其浓度，检测纯度，并电泳检测DNA完整性，保存于-80 ℃。选取16SrRNA片段上V1—V3高变区（Escherichia coli positions 5—534）作为扩增目标片段进行PCR扩增。按照Qiagen MiniElute试剂盒提供的操作流程进行回收并纯化目的片段DNA，溶解于20 μL TE液洗涤[9]，利用454 GS FLX Titanium平台进行双端测序。

1.3 数据分析

利用本实验室已经建立的454高通量序列处理流程，利用MOTHUR（https://www.mothur.org/）软件对得到的原始序列进行质量控制[9]。

虽然产业链金融中潜在的风险整体较少，但是财务公司依然不能忽略风险的预警与控制，但是现阶段财务公司在风险控制方面的能力整体不够理想。由于财务公司自身与商业银行存在差距，所以财务公司的资金规模、金融产品种类以及金融功能等方面都相对不如商业银行，整体表现出抵御风险的能力较弱。其次，财务公司在识别与处理风险方面的效率还有所不足，很多时候在风险爆发后才采取措施进行风险处理，将会对企业集团和上下游企业的运营都造成影响。

由图4可以总结出两组高表达的微生物。1）C组高表达的微生物，即可疑致龋微生物（P<0.1）：拟杆菌纲（Bacteroides）、拟杆菌目（Bacteroidales）、普氏菌科（Prevotellaceae）以及普氏菌属（Prevotella）；2）H组高表达的微生物，即健康相关微生物（P<0.1）：黄杆菌纲（Flavobacteria）、黄杆菌目（Flavobacteriales）、黄杆菌科（Flavobacteriaceae）、棒状杆菌科（Corynebacteriaceae）、伯杰菌属（Bergeyella）、棒状杆菌属（Corynebacterium）和链球菌组（Streptococcaceae Group）。

1.3.2 物种的种系发育信息分析   从门到种水平进行细菌种系信息划归。利用RDP Classifier分类工具，比对Greengens数据库（http://greengenes.secondgenome.com/），选取置信度0.8为临界阈值，低于该临界值即列为未分类细菌，并计算每个门类各物种的相对丰度。

1.3.3 统计学分析   所有统计分析采用R（Version 3.2.1）软件包进行。两组间比较采用Wilcoxon ranksum检验，多重比较采用Bonferroni检验校正（P<0.1认为差异具有统计学意义）。采用多因素方差分析（permutational multivariate analysis of variance，PERMANOVA）检测疾病状态和性别对菌群结构的影响程度。所用模型算法为机械学习的随机森林（random forest，RF）法，预测能力通过受试者工作特征（receiver operating characteristic curve，ROC）分析，模型区分能力则利用ROC曲线评估（area under the curve，AUC）进行分析。

2 结果

采用多样本平行标记技术对儿童口腔唾液样品进行分析，得到约400 bp长的序列。经初步筛选，共获得270 395条序列，每个样品平均得到5 634条序列。

2.1 基于OTU的菌种多样性分析

由图1可见：H组与C组的Shannon和Simpson指数无明显差异（P＞0.05），但两组的Chao1指数差异有统计学意义，且C组明显高于H组（P<0.05）；不同性别的α多样性指数的差异均无统计学意义（P＞0.05）。

  

图1 唾液菌群多样性分析Fig1 Comparison of salivary diversity and richness

2.2 基于Bray-Curtis的群落结构特点

H组和C组唾液微生物群落结构见图2。首先，龋病状态会显著影响唾液菌群结构（F=2.76，P<0.01），而性别对唾液菌群结构没有明显影响（P＞0.05，图2左）；其次，H组和C组的菌群结构存在差异（P<0.01），且C组儿童的群落结构更为相似和保守，而H组则相距较远且更为分散（P<0.001，图2中）；最后，进一步通过距离矩阵进行PCoA分析，可以在P1主坐标看到两组人群的分离趋向（P<0.01，图2右）。

排气时刻异常决定柴油机膨胀阶段对外做功能力大小，甚至会引起由于换气效率(排气充分性)的变化而影响下一循环的燃烧。在稳定工况条件下，排气时刻的变化，将直接在排气温度上有所体现。

  

图2 H组和C组唾液微生物群落结构比较Fig2 Comparison of saliva microbial community structure between group H and group C

2.3 基于种系发育信息的群落特点

对H组和C组唾液的菌群微生物相对丰度进行比较分析，结果见图3。在细菌门水平，两组样品的组成成分都较为近似，超过99%的群落成员由以下6个优势细菌门构成，包括厚壁菌门（Firmicutes，42.55%）、拟杆菌门（Bacteroidetes，24.50%）、变形菌门（Proteobacteria，16.76%）、放线菌门（Actinobacteria，9.51%）、梭杆菌门（Fusobacteria，4.94%）、TM7（1.18%）；但H组和C组在门水平上的物种组成无明显差异。

  

图3 唾液菌群中优势细菌门构成Fig 3 The predominant phylum in the saliva microbiota

在门、纲、目、科、属、种6个分类水平，分别对不同性别来源和不同疾病状态的人群进行比较，未发现性别相关的细菌种类；在H和C组间比较，未发现龋特异性细菌种类（单独存在于某一方人群，而另一方人群中缺失），但从纲到属4级水平均检测到相对丰度存在显著差别分布的细菌种类（图4）。

  

图4 H组和C组唾液菌群种系发育信息比较Fig4 Phylogeny-based comparison of salivary flora between group H and group C

1.3.1 群落结构分析   基于操作分类单元（operational taxonomic units，OTU）结果计算物种丰度估计指数（Chao1）及物种多样性指数（Shannon和Simpson），以展示口腔唾液菌群的α多样性。通过计算任意两个样品的Bray-Curtis距离，构建Bray-Curtis矩阵并进行主坐标分析（principal coordinate analysis，PCoA），以展示C组和H组间的物种结构特征（β多样性）。

2.4 利用唾液菌群建立S-ECC儿童龋病的评估模型

[10] Ling Z, Kong J, Jia P, et al. Analysis of oral microbiota in children with dental caries by PCR-DGGE and barcoded pyrosequencing[J]. Microb Ecol, 2010, 60(3):677-690. 

  

图5 唾液菌群可反映宿主龋病状态Fig5 Caries classification based on salivary microbiota profiles

3 讨论

首先，本研究考察了S-ECC儿童和健康儿童的唾液菌群物种多样性差异，发现两组的物种多样性指数Shannon和Simpson均无差异，这与之前的研究结果一致[10-12]；但C组的唾液菌群物种丰富度（Chao1指数）显著高于H组，提示口腔的龋病状态与唾液微生物的物种丰富度存在一定关系，但其原因还有待后续进一步验证。

总之，由于语文是我国最博大精深的学科之一，教育部门理应十分重视学生语文核心素养的培养。此次出版的部编教材，很大程度上弥补了以前语文课本的不足，是更加科学、系统的体系，为教师提供了教学上的思路和便利，也让学生能在相对完备的体系及教师的循循善诱中提升语文核心素养，为以后的阅读、写作打下坚实的基础。

其次，通过考察健康组和龋病组的唾液菌群结构差异，发现龋病状态是影响菌群结构变异的最重要因素，且H组和C组菌群结构具有明显区分性，说明龋病的发生并不是某种特异性微生物的作用结果，而是口腔生物膜菌群结构整体发生的改变，这亦与“生态菌斑假说”的理论相一致[7]。特别的是，H组样本彼此间变异较大，而C组样本间唾液菌群相对保守度高，这提示龋病的发生模式可能较为一致。值得注意的是，既往的儿童龋病纵向研究[9]和成年人龋活跃者元基因组学研究中[6]亦发现健康和龋病者菌群结构上存在显著差异，但在低龄儿童龋病的横断面研究[10-12]中较难检测到。本研究发现差异的可能原因是研究对象均为重症龋病者（dmft≥10），两组的口腔健康状态表型差异较大，且采用了较为灵敏的多元统计学方法。这一结果提示，当无法进行纵向实验设计剔除个体背景干扰因素时，选取疾病状态较为严重的极端样本可较易挖掘疾病发生的一定内部规律。

表1显示：系统对数据检索的速率一般，数据验证对比结果正确率达到百分百，也就是说系统可以完整地对数据进行存证。

1.1.1 采样对象的选择   2016年4—5月对青岛市崂山区幼儿园儿童进行口腔检查，筛选出24名重症低龄儿童龋（severe early childhood caries，S-ECC）儿童（C组）和24名健康儿童（H组）参与本研究。C组儿童要求龋失补牙指数（decayed, missing, and filled teeth，dmft）≥10，H组要求dmft=0；两组儿童年龄均在4岁左右，其中男24名（健康和疾病人数的比例为1∶1），女24名（健康和疾病人数的比例为

[参考文献]

[1]  Anderson M. Risk assessment and epidemiology of dental caries: review of the literature[J]. Pediatr Dent, 2002, 24(5):377-385.

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[3]  Alm A, Wendt LK, Koch G, et al. Prevalence of approximal caries in posterior teeth in 15-year-old Swedish teenagers in relation to their caries experience at 3 years of age[J]. Caries Res, 2007, 41(5):392-398. 

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[6] Yang F, Zeng X, Ning K, et al. Saliva microbiomes distinguish caries-active from healthy human populations[J]. ISME J, 2012, 6(1):1-10. 

根据气温、季节变化注意防寒保暖，避免物理性损伤刺激皮肤。避免过度地使用电热毯和暖气。内衣应选择宽松舒适、透气好的棉织物，对皮肤刺激小，又有利于血液循环。衣裤要勤换洗，尤其是要保持内衣内裤的清洁卫生。

[7]  Marsh PD. Dental diseases—are these examples of ecological catastrophes[J]. Int J Dent Hyg, 2006, 4(Suppl 1):3-10; discussion 50-52. 

[8]  Turnbaugh PJ, Ley RE, Hamady M, et al. The human microbiome project[J]. Nature, 2007, 449(7164):804-810. 

[9]  Teng F, Yang F, Huang S, et al. Prediction of early childhood caries via spatial-temporal variations of oral microbiota[J]. Cell Host Microbe, 2015, 18(3):296-306. 

基于S-ECC儿童龋病时口腔菌群表现出明显改变的结果，笔者利用RF法基于唾液菌群种系发育属水平上的全部物种以及筛选出来的4个潜在的龋病生物标记物 （Prevotella、Bergeyella、Corynebacterium、Streptococcaceae Group）建立评估模型，结果见图5。由图5可见，基于所有唾液细菌属信息建立的龋病评估模型（图5左，AUC=0.88，准确率为0.79）区分健康和龋病的性能略优于基于4个细菌属信息建立的评估模型（图5右，AUC=0.78，准确率为0.73），提示该细菌属作为低龄儿童龋病风险评估模型具有应用潜能。

[11] Jiang S, Gao X, Jin L, et al. Salivary microbiome diversity in caries-free and caries-affected children[J]. Int J Mol Sci, 2016, 17(12):E1978. 

兰博基尼Esperienza驾驶体验活动是这个意大利超级跑车品牌自2014年开始推出的一项综合的全球驾驶体验方案，旨在让车迷和潜在用户能够获得专业试驾和初步探索兰博基尼世界的机会。兰博基尼Esperienza驾驶体验活动由兰博基尼赛车运动管理部门Squadra Corse主办。该部门同时负责兰博基尼Accademia驾驶学院活动，在赛道和冰雪上为客户提供驾驶培训和竞速入门训练，并管理致力于为年轻车手打造完美初级赛事体验的兰博基尼Super Trofeo超级挑战赛，以及为经验丰富的车手提供驾驶兰博基尼赛车参加GT3等全球赛事的机会。

[12] Ling Z, Liu X, Wang Y, et al. Pyrosequencing analysis of the salivary microbiota of healthy Chinese children and adults[J]. Microb Ecol, 2013, 65(2):487-495. 

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式中，A代表拟合函数的幅值；ω0为延迟因子，rad·s-1；ω1和振荡周期相关；ωc和波形的初始相位相关。

[15] Gross EL, Beall CJ, Kutsch SR, et al. Beyond Streptococcus mutans: dental caries onset linked to multiple species by 16S rRNA community analysis[J]. PLoS One, 2012, 7(10):e47722. 

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Research progress in application of polycarboxylate superplasticizer polyether macromonomer 10 13

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