细胞色素 b（Cytochrome b，Cytb）基因是线粒体DNA的重要基因组成，其结构和功能是线粒体DNA的13个蛋白质编码基因中了解得最清楚的基因[1]。由于它的进化速度适中、母系遗传、易于扩增等特点，Cytb基因成为最为普遍的遗传标记之一，在分类学和法医学领域都具应用[2-3]。尤其是线粒体Cytb基因在哺乳动物物种鉴定方面较为普遍[4-8]。

2017年9月收到江西井冈山地区待鉴定的哺乳动物肌肉样品1份，无法依据宏观形态特征进行物种鉴定。为此，本研究通过提取样品的基因组DNA、测定线粒体Cytb基因序列，结合NCBI在线Blast、系统树构建、遗传距离及动物地理分布综合确定物种，以便为林业案件审理提供科学依据。

1 研究方法

1.1 DNA提取、PCR扩增与序列测定

利用动物基因组DNA快速抽提试剂盒（上海生工）提取基因组DNA。PCR引物采用哺乳动物Cytb基因通用引物L14724/H15915[9]。PCR扩增体系为25 μl, 包含 10×EX Taq buffer（Mg2+Free）,2.5 mM dNTP,25 mM MgCl2,10 μM 引物，1unit Ex Taq polymerase(TaKaRa Biotech,Dalian)。

PCR扩增反应条件：95℃预变性5 min，95℃变性 30 s，55℃退火 50 s，72℃延伸 1 min 30 s，重复35个循环，最后72℃延伸10 min。PCR扩增产物经1%的TAE琼脂糖凝胶电泳检测，以Marker III(MD103)作为参照Marker，电泳图见图1。PCR产物经纯化后送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

本研究有几个限制：首先，样本量不是很大，还需要加大临床样本验证结果。第二，本研究集中在CT双低技术结合IMR重建对于桥血管影像质量的评价，对于诊断的准确性并没有涉及，这是下一步的研究方向。

  

图1 目的基因的电泳图Fig.1 The electrophoresis diagram of target gene

1.2 DNA序列处理

各序列间的遗传距离见表2。K001与EF035448（Cervus unicolor swinhoe i）的遗传距离最小（0.007），其次和HM049636（Cervus albirostris）遗传距离近（0.009）；HM049636和 EF035448的遗传距离仅为0.002，低于K001与EF035448序列之间的遗传距离。

通过NCBI数据库中的在线序列Blast(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi),选取序列一致性≧95%的序列。物种拉丁名相同的序列仅保留1条，共获得17条序列（表1）用于构建系统发生树。通过逐一查看可确定这些序列对应物种均属鹿科动物。以麝科动物林麝 （Moschus berezovskii）(基因序列号：AF026884）和鹿科马鹿中亚亚种 （Cervus elaphus bactrianus）（AY142327）作为外群，利用 Mega6.06[10]构建邻接树（neighbor-joining,NJ），模型采用 K2P[11]；同时，利用PhyML 3.0[12]构建最大似然树（maximum likelihood,ML），替代模型设为GTR。

 

表1 构建系统树的序列物种信息Tab.1 Species information used for building phylogenetic trees

  

序列一致性/%Sequence Ident水鹿台湾亚种Cervus unicolor swinhoei EF035448 99水鹿海南亚种C.unicolor hainana KY946815 99白唇鹿C.albirostris HM049636 99水鹿印支亚种C.unicolor cambojensis AF423201 99水鹿C.unicolor FJ556575 98豚鹿指名亚种Axis porcinus porcinus AY035874 98东北马鹿C.elaphus xanthopygus AB021097 95西伯利亚马鹿C.elaphus sibericus AF423199 95马鹿川西亚种C.elaphus macneilli AY035875 95马鹿西藏亚种C.elaphus wallichi AY044861 95马鹿甘南亚种C.elaphus kansuensis AY070223 95塔里木马鹿C.elaphus yarkandensis AY142326 95马鹿中亚亚种C.elaphus bactrianus AY142327 95天山马鹿C.elaphus songaricus HQ191429 95梅花鹿C.nippon JF893483 95梅花鹿琉球亚种C.nippon keramae AB021091 95马鹿C.elaphus alxaicus KU942399 95物种名及拉丁学名Species and Latin name基因序列号Genbank No.

1.3 序列Blast与系统树构建

随着改革开放的深入推进，在华的外国人逐年增加，有部分外国人由短期旅居转变为长期居留，日本人是其中一个重要群体。这些外国人居留模式的变化影响着我国城市经济社会及空间景观的发展。中山大学刘云刚研究团队对这一问题进行了深入研究，分别从广州日本移民的生活活动、生活空间以及族裔经济与社会空间特征等方面进行了探讨。研究认为，旅居广州的日本移民生活空间具有主动集聚和被动隔离的特征，这种居留模式对中国城市经济社会及空间景观带来诸多影响，主要特征之一是族裔经济的出现。广州的日本移民对族裔经济依赖度高，而族裔经济的发展给中国的国际化城市建设和移民管理带来了新的挑战 [16]。

1.4 遗传距离分析

为了进一步确定K001与其他序列之间的关系，利用Mega6.06[10]计算了Clade A序列之间的遗传距离。

ML和BI方法产生较为相似的系统树（图2）。从图2可见，Clade A和Clade B形成两大分枝，不过支持率较低。Clade B主要包括梅花鹿(Cervus nippon)和马鹿(C.elaphus)两大部分,并且支持率较高（93/99）；Clade A包括水鹿(C.unicolor)、白唇鹿(C.albirostris)和豚鹿(Axis porcinus)。K001嵌入在水鹿海南亚种(C.unicolor hainana)与水鹿台湾亚种 (C.unicolor swinhoei)之间，但支持率不高。

2 结果

2.1 序列信息

经校对，测定的获得了Cytb基因全序列（1140bp），其核苷酸组成A 31.1%、T28.7%、G13.1%、C27.1%。序列命名为K001。

2.2 系统树分析

在当下经济体制中，组织的竞争能力，实际上就是人才的竞争，即企业与企业之间人力资源团队的竞争，可以说人力资源直接决定着一个企业、一个组织的人才管理体制优越性。

2.3 遗传距离分析

利用Lasergene软件内的Seqman进行序列拼接，进行测序峰图人工校对，并利用Mega6.06[10]对拼好的序列进行翻译，确保序列能翻译成氨基酸序列，以排除假基因。

前苏联著名教育家苏霍姆林斯基曾说：“最完备的教育是学校和家庭的结合”。要教育好学生，不能只靠班主任，而是要调动一切可调动的力量，其中，家长的力量尤为重要。无论是班主任还是家长，都希望通过家校协作给予孩子最适合的教育。在工作中，班主任与家长如何通过有效的沟通，增进理解，增强互信，达成共识，从而帮助孩子成长呢？

3 讨论

研究中序列Blast表明序列一致性（≥99%）的有水鹿和白唇鹿；系统树中K001嵌入水鹿海南亚种和水鹿台湾亚种之间；K001和 EF035448（Cervus unicolor swinhoei）的遗传距离仅为0.007。根据相关文献记载，白唇鹿是我国特有种，局限于青藏高原东部边缘，主要分布在西藏、青海、甘肃和四川，在江西及其周边省份没有分布[13-14]。而水鹿在我国分布区域较广，在江西省有分布[14]。因此，综合确认K001样品属鹿科的水鹿，为国家Ⅱ级重点保护野生动物。

  

图2 基于Cytb基因序列构建的ML系统发生树注：系统树分枝标注的分别是ML和NJ对应的支持率；*指支持率低于60Fig.2 ML phylogenetic tree based on Cytb gene sequencesNote:The node of branches represent supporting values of ML and NJ,respectively.*represent support values which below 60.

 

表2 Clade A中Cytb基因序列间的遗传距离Tab.2 Genetic distance of Cytb gene sequences among Clade A

  

KY946815 EF035448 AF423201 FJ556575 HM049636 K001 AY035874 KY946815 Cervus unicolor hainana EF035448 Cervus unicolor swinhoei 0.006 AF423201 Cervus unicolor cambojensis 0.007 0.003 FJ556575 Cervus unicolor 0.019 0.018 0.019 HM049636 Cervus albirostris 0.006 0.002 0.003 0.018 K001 0.010 0.007 0.010 0.022 0.009 AY035874 Axis porcinus porcinus 0.015 0.015 0.016 0.006 0.015 0.019

本研究中白唇鹿序列（HM049636）和水鹿序列（EF035448）的遗传距离仅为0.002，推测HM049636对应的物种可能是误判，但需要加入更多白唇鹿的线粒体Cytb基因序列进行验证。

野生动物物种鉴定是物种研究的基础，也是林业司法鉴定的重要内容。野生动物司法鉴定可有效打击非法盗猎、走私、倒卖野生动物及其制品，为林业案件审理提供科学依据。

参考文献：

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[13]吴家炎,王伟.中国白唇鹿[M].北京:中国林业出版社,1999.

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